胚胎12.5天暴露于丙戊酸鈉大鼠發(fā)育及行為性別差異的研究*

趙 剛

1.深圳市南山區(qū)婦幼保健院兒童康復(fù)科，廣東 深圳 518067；

2.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院兒少衛(wèi)生與婦幼保健學(xué)教研室，哈爾濱 150081

孤獨(dú)癥是一種神經(jīng)發(fā)育障礙性疾病，主要癥狀是社交障礙，行為重復(fù)刻板、興趣狹隘［1］，同時(shí)伴隨多種神經(jīng)行為紊亂，如學(xué)習(xí)障礙，多動(dòng)和焦慮［2,3］。2014 年美國(guó)CDC數(shù)據(jù)顯示，孤獨(dú)癥譜系障礙發(fā)病率為14.7‰［4］。作為一種復(fù)雜性疾病，孤獨(dú)癥的病因涉及遺傳、表觀遺傳和環(huán)境等因素［5］。

孤獨(dú)癥男女發(fā)病比例達(dá)4.2∶1［6］。此外，臨床癥狀上也存在性別差異。對(duì)孤獨(dú)癥的研究顯示，女孩社交和溝通能力明顯低于男孩［7-9］，而男孩比女孩存在更多重復(fù)刻板行為和異常興趣。一直以來(lái)，胚胎期致畸藥物的使用被認(rèn)為是孤獨(dú)癥發(fā)病的重要原因。如果孕婦服用丙戊酸鈉（VPA），后代患孤獨(dú)癥的風(fēng)險(xiǎn)將增加。而胚胎早期暴露于VPA大鼠，也表現(xiàn)出類似孤獨(dú)癥樣改變［10］。

目前VPA 大鼠模型仍然存在局限，包括對(duì)VPA 大鼠發(fā)育和行為性別差異的研究。如果能使用性別二態(tài)性分析闡述VPA大鼠發(fā)育和行為特征，將有利于這一動(dòng)物模型的完善，促進(jìn)對(duì)孤獨(dú)癥病因認(rèn)識(shí)。

1 材料與方法

1.1 材料

Wistar 大鼠，體重200～250 g。Morris 水迷宮視頻跟蹤分析系統(tǒng)（成都太盟科技有限公司），YH-OF 自動(dòng)跟蹤系統(tǒng)（武漢一鴻科技有限公司），VPA粉劑（Sigma公司）。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型建立：大鼠雌雄2∶1 合籠過(guò)夜，次日清晨檢測(cè)到陰栓的雌鼠認(rèn)為交配成功，記為胚胎第一天（E1）。參照Schneider 等［10］方法，E12.5 受孕雌鼠隨機(jī)分兩組，模型組按600 mg/kg 劑量單次腹腔注射250 mg/ml VPA 溶液，鹽水組注射等體積生理鹽水。模型組和鹽水組雌鼠所生仔鼠分別記為VPA組和對(duì)照組。仔鼠出生后第21天（PND21）斷奶，雌雄分籠飼養(yǎng)，形成對(duì)照組（雄性、雌性）、VPA 組（雄性、雌性）。每組取6 只大鼠進(jìn)行后續(xù)研究。

1.2.2 發(fā)育指標(biāo)檢測(cè)：PND7、14、21、28、35，測(cè)量體重；（2）PND12-16，評(píng)定睜眼情況。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：2 分—睜開(kāi)2只眼睛；1分—睜開(kāi)1只眼睛；0分—未睜開(kāi)眼睛；（3）PND7-10，測(cè)試前庭發(fā)育。使用光滑傾斜板（25°），將大鼠頭向下放置，記錄頭部轉(zhuǎn)動(dòng)180°所需時(shí)間；（4）PND10、12、14、16，測(cè)試游泳能力。恒溫水槽28℃，測(cè)試時(shí)間5 s。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：4 分—鼻子與水面平齊或以上，雙耳在水面以上；3 分—鼻子與水面平齊或以上，雙耳與水面平齊；2 分—鼻子與水面平齊或以上，雙耳在水面以下；1分—鼻子在水面以下，頭頂在水面以上；0分—頭頂在水面以下。

1.2.3 行為指標(biāo)檢測(cè)：（1）水迷宮測(cè)試：PND21-28，評(píng)估大鼠學(xué)習(xí)記憶能力。定位劃行實(shí)驗(yàn)：隱蔽平臺(tái)放在第三象限中心水下1 cm。1～3 天，訓(xùn)練大鼠60 s 內(nèi)尋找隱蔽平臺(tái)。如未找到，將其引至平臺(tái)，停留10 s。4～7 天，記錄大鼠爬上平臺(tái)潛伏期?？臻g探索實(shí)驗(yàn)：即第8 天，除去平臺(tái)，記錄大鼠60 s 內(nèi)穿越平臺(tái)位置次數(shù)。（2）曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)：PND29-35，評(píng)估大鼠自發(fā)活動(dòng)。根據(jù)Kim［11］方法，使用配備攝像頭的自動(dòng)跟蹤系統(tǒng)記錄30 min內(nèi)大鼠移動(dòng)距離和移動(dòng)持續(xù)時(shí)間。（3）三箱社交實(shí)驗(yàn)：PND28-35，評(píng)估大鼠社交行為。方法改編自Crawley［12］，測(cè)試工具為三箱。使用配備攝像頭的自動(dòng)跟蹤系統(tǒng)記錄被試大鼠在三箱內(nèi)停留時(shí)間及運(yùn)動(dòng)軌跡。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0 統(tǒng)計(jì)分析。組間比較采用方差分析，組別（VPA 組/對(duì)照組）和性別（雌性/雄性）作為組間因素，如果發(fā)現(xiàn)任何一個(gè)因素存在顯著效應(yīng)，則采用LSD 檢測(cè)進(jìn)行Post Hoc 多重比較。水迷宮定位劃行實(shí)驗(yàn)采用重復(fù)測(cè)量方差分析。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，數(shù)據(jù)用均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

2 結(jié)果

2.1 發(fā)育指標(biāo)檢測(cè)

PND14，VPA 大鼠體重顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）；PND14、21、35，雌性總體體重顯著低于雄性（P＜0.05）；PND14，存在性別與組別交互作用（P＜0.05）。Post hoc 比較發(fā)現(xiàn)，PND14，VPA 雄性大鼠體重顯著低于對(duì)照組雄性大鼠（圖1a）。PND13-15，VPA 大鼠睜眼情況評(píng)分顯著低于對(duì)照組（P＜0.05），無(wú)性別差異及交互作用（圖1b）。PND7-10，VPA 大鼠趨地性測(cè)試評(píng)分顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），無(wú)性別差異及交互作用（圖1c）。PND10、12、14、16，VPA 大鼠游泳能力顯著低于對(duì)照組（P＜0.05），無(wú)性別差異及交互作用（圖1d）。

2.2 行為學(xué)檢測(cè)

2.2.1 水迷宮測(cè)試：定位劃行實(shí)驗(yàn)（圖2a），4 天測(cè)試中，VPA 大鼠逃避潛伏期均顯著長(zhǎng)于對(duì)照組（P＜0.05），隨著訓(xùn)練次數(shù)增加，兩組逃避潛伏期均顯著縮短，但VPA組縮短程度顯著低于對(duì)照組。兩組大鼠逃避潛伏期均沒(méi)有顯示出性別差異（P＞0.05）。空間探索實(shí)驗(yàn)（圖2b），VPA 大鼠穿越第三象限中心次數(shù)顯著低于對(duì)照組（P＜0.05），但無(wú)性別差異及交互作用。

2.2.2 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)：自發(fā)活動(dòng)距離（圖2c），VPA 大鼠自發(fā)活動(dòng)距離顯著長(zhǎng)于對(duì)照組（P＜0.05）；雄性顯著短于雌性（P＜0.05）；性別與組別存在交互作用（P＜0.05）。Post hoc比較發(fā)現(xiàn)，VPA雄性大鼠自發(fā)活動(dòng)距離顯著高于VPA雌性大鼠，表現(xiàn)出性別差異。自發(fā)活動(dòng)持續(xù)時(shí)間（圖2d），VPA大鼠自發(fā)活動(dòng)持續(xù)時(shí)間顯著長(zhǎng)于對(duì)照組（P＜0.05）；雄性顯著短于雌性（P＜0.05）；性別與組別存在交互作用（P＜0.05）。Post hoc 比較發(fā)現(xiàn)，VPA 雄性大鼠自發(fā)活動(dòng)持續(xù)時(shí)間顯著長(zhǎng)于VPA雌性大鼠。

圖-1.VPA誘導(dǎo)孤獨(dú)癥模型大鼠生長(zhǎng)發(fā)育測(cè)量結(jié)果

2.2.3 三箱社交實(shí)驗(yàn)：探索陌生大鼠1 和空籠子的時(shí)間（圖2e），VPA 大鼠探索陌生大鼠1 的時(shí)間顯著短于對(duì)照組，探索空籠子的時(shí)間顯著長(zhǎng)于對(duì)照組（P＜0.05）；雄性大鼠探索陌生大鼠1的時(shí)間顯著短于雌性（P＜0.05）；探索陌生大鼠1 的時(shí)間存在性別與組別的交互作用（P＜0.05）。Post hoc比較發(fā)現(xiàn)，VPA雌性大鼠探索陌生大鼠1的時(shí)間顯著長(zhǎng)于VPA 雄性大鼠。探索陌生大鼠1 和空籠子的次數(shù)（圖2f），VPA 大鼠探索陌生大鼠1 的次數(shù)顯著少于對(duì)照組，探索空籠子的次數(shù)顯著多于對(duì)照組（P＜0.05）；雄性探索空籠子的次數(shù)顯著高于雌性（P＜0.05）；探索空籠子的次數(shù)存在性別與組別的交互作用（P＜0.05）。Post hoc 比較發(fā)現(xiàn)，VPA雄性大鼠探索空籠子的次數(shù)顯著多于VPA雌性大鼠。

3 討論

本研究顯示，VPA 大鼠總體發(fā)育水平均顯著落后于對(duì)照組。除體重表現(xiàn)出性別差異，其他發(fā)育指標(biāo)均無(wú)顯著性別差異。行為測(cè)試中，我們的結(jié)果與以往相似［13］，VPA雄性大鼠顯示出社交障礙和多動(dòng)。同樣的行為變化也表現(xiàn)在VPA 雌性大鼠。同時(shí)，VPA 組內(nèi)表現(xiàn)出顯著的性別差異，VPA 雄性大鼠表現(xiàn)的更多動(dòng)，這與人類觀察結(jié)果相似。但不同的是，VPA雄性大鼠比VPA雌性大鼠社交障礙表現(xiàn)的更明顯。在水迷宮測(cè)試中，VPA 大鼠表現(xiàn)出學(xué)習(xí)記憶障礙。同時(shí)表現(xiàn)出性別差異，即VPA雄性大鼠的受損程度要高于VPA雌性大鼠。

研究顯示VPA大鼠有明顯的社交障礙。大鼠社交沖動(dòng)減少和自發(fā)活動(dòng)增加可能與焦慮升高有關(guān)，因?yàn)榭謶趾徒箲]對(duì)大鼠這些行為會(huì)產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響［14］。VPA大鼠高架十字迷宮測(cè)試發(fā)現(xiàn)，VPA 雄性大鼠焦慮水平明顯升高。眾所周知，智力低下與孤獨(dú)癥密切相關(guān)［15］。VPA大鼠表現(xiàn)出的學(xué)習(xí)記憶障礙，可能與海馬神經(jīng)元損傷有關(guān)［16］。海馬是學(xué)習(xí)記憶中樞，海馬神經(jīng)元損傷，會(huì)導(dǎo)致一系列行為和認(rèn)知改變。前期研究發(fā)現(xiàn)，VPA 雌性大鼠海馬CA1區(qū)的損傷要小于VPA雄性大鼠，這可能與雌性和雄性嚙齒動(dòng)物對(duì)有毒物質(zhì)的抵抗力不同有關(guān)，同時(shí)表現(xiàn)出的行為也存在性別差異?？赡芘c腦發(fā)育早期雌性和雄性對(duì)化學(xué)藥劑易受性不同有關(guān)。這可能是導(dǎo)致某些疾病性別比例差異顯著的重要原因。

圖-2 VPA誘導(dǎo)孤獨(dú)癥模型大鼠行為測(cè)試結(jié)果

總之，本研究觀察到VPA大鼠表現(xiàn)出發(fā)育和行為模式異常，并且與孤獨(dú)癥患者非常相似。同時(shí)也表現(xiàn)出顯著的性別差異，這與孤獨(dú)癥不平衡的男女發(fā)病比例以及癥狀表現(xiàn)的性別差異相類似。雖然動(dòng)物模型不能完全等同于人類疾病，然而，作為疾病研究的重要手段，動(dòng)物模型研究仍然擁有廣闊前景，需要不斷完善。