miR-101 miR-384在喉癌患者中的表達(dá)情況及意義

楊喜科 姜 平 付莉萍

喉癌是常見的頭頸部惡性腫瘤，占全身惡性腫瘤的5.7%～7.6%。近年來，盡管以手術(shù)為主的綜合治療方案使喉癌預(yù)后得到改善，但其遠(yuǎn)期生存率并未見明顯提高，尤其是伴頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，其5年生存率不足50%[1]。闡明喉癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，探尋分子靶向標(biāo)志物以實(shí)現(xiàn)靶向治療是提高喉癌生存率的關(guān)鍵。微小RNA(microRNAs,miRNAs)是近年發(fā)現(xiàn)的非編碼內(nèi)源性小分子RNA，對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后的負(fù)向調(diào)控。研究[2-3]顯示，miRNA與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展緊密關(guān)聯(lián)。miR-101在肝癌、前列腺癌、宮頸癌等多種惡性腫瘤中表達(dá)下調(diào)，是一種抑癌miRNA，miR-101可通過作用于Mcl-1而發(fā)揮抗腫瘤作用[4]。miR-384在多種惡性腫瘤中表達(dá)異常，也被認(rèn)為是一種抑癌miRNA，能夠抑制腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移[5-6]。但在喉癌中，miR-101、miR-384表達(dá)是否對(duì)腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移有影響，目前尚缺乏相關(guān)報(bào)道。為此，本研究檢測(cè)喉癌組織中miR-101、miR-384表達(dá)水平，旨在初步探討喉癌發(fā)病的分子機(jī)制及潛在治療靶點(diǎn)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2013年10月至2014年12月南陽市中心醫(yī)院收治的經(jīng)手術(shù)病理證實(shí)的104例喉癌患者，均采集新鮮喉癌組織及癌旁正常黏膜組織(距癌組織0.5～1.0 cm)。所有患者術(shù)前均未接受放化療及免疫治療。其中，男性94例，女性10例；年齡37～82歲，平均(54.21±7.62)歲；病理類型均為喉磷癌，其中高分化癌62例，中分化癌37例，低分化癌5例；原發(fā)部位：聲門上型23例，聲門型70例，聲門下型11例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況：有轉(zhuǎn)移29例，無轉(zhuǎn)移75例。TNM分期：II期42例，III期40例，IV期22例。全部標(biāo)本均于手術(shù)切取離體后置入液氮中，轉(zhuǎn)運(yùn)至-80℃冰箱中保存。本研究征得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有對(duì)象均對(duì)研究充分知情，并簽署知情同意書。

1.2 儀器與試劑 熒光定量PCR儀(美國(guó)Thermo Forma公司)，Trizol試劑(美國(guó)Invitrogen公司)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國(guó)Applied Biosystems公司)，PCR引物(南京金斯瑞公司設(shè)計(jì)合成)，-80℃低溫冰箱(無錫冠亞恒溫制冷技術(shù)有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)室方法

1.3.1 總RNA的提取 ①組織勻漿：取喉癌組織、癌旁正常黏膜組織各100 mg，放置于EP管中，加入Trizol Reagent 1 mL，冰上操作勻漿至液態(tài)。靜置5 min后，4℃環(huán)境下離心(12 500 r/min×3 min)。②兩相分離：吸取1.5 mL組織上清液至新的離心管(1.5 mL)中，加入200 μL氯仿，輕輕振蕩EP管，混勻，EP管液體為粉紅色乳狀，室溫靜置5 min，4℃離心(12 000 r/min×15 min)，此時(shí)液體分為3層，其中RNA全部溶解于上層水相。③RNA的沉淀：取離心后的上層水相，移至新的EP管(1.5 mL)中，加入異丙醇，充分混勻，靜置10 min，4℃環(huán)境下離心(12 000 r/min×10 min)。④RNA的洗滌：吸除上清液，可見EP管底部沉淀有白色物質(zhì)，加入1 mL無水冰乙醇，輕彈EP管底部使白色沉淀物充分洗滌、振蕩，4℃環(huán)境下離心(12 000 r/min×15 min)。離心后肉眼可見EP管底部存在少量白色沉淀物質(zhì)，將上清液棄掉，將EP管置于超凈臺(tái)中20 min，使RNA干燥。⑤RNA沉淀的重新溶解：采用移液槍往RNA沉淀中加RNA-free H2O，反復(fù)吹打數(shù)次，于55～60℃下孵育10 min。取2 μL溶解液進(jìn)行RNA測(cè)定，將得到的RNA溶解液置于-80℃環(huán)境下保存。

1.3.2 qRT-PCR檢測(cè)喉癌組織中miR-101、miR-384的表達(dá) 采用熒光定量 qRT-PCR法，以兩步法檢測(cè)miR-101、miR-384，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。熒光定量PCR，應(yīng)用通用的反轉(zhuǎn)錄條件轉(zhuǎn)錄目的miRNAs，95℃ 30 s、95℃ 10 s、55℃ 15 s、72℃ 20 s，40次循環(huán)，以U6為內(nèi)參，參照公式計(jì)算miR-101、miR-384的相對(duì)表達(dá)量。

miR-101引物序列：5’-AAATGTACTGCGCGTGGAGAC-3’；COX-2-Forward 5’-CTGGCGCTCAGCCATACAG-3’，COX2-Reverse 5’-CACCTCGGTTTTGACATGGGT-3’3’，U6-Forward 5’-CTCGCTTCGGCAGCACATA-3’，U6-Reverse 5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’，GAPDH-Forward 5’-CACTGGCGTC TTCACCACCAT-3’，GAPDH-Reverse 5’-GTGCAGGAGGCATTGCTGAT-3’。

miR-384引物序列：5’-GAAGATCTCTTCAAAGTGAACAGCCCAGT-3’，5’-CCCAAGCTTAGCTTCTTGAAGGCTTCCTATG-3’。

1.4 觀察指標(biāo) 比較喉癌組織及癌旁正常黏膜組織miR-101、miR-384相對(duì)表達(dá)量；搜集患者臨床資料，比較不同臨床參數(shù)(性別、年齡、吸煙史、腫瘤直徑、原發(fā)部位、腫瘤TNM分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移)間喉癌組織miR-101、miR-384表達(dá)量的差異。

隨訪截至2019年6月，中位隨訪時(shí)間38個(gè)月(6～60個(gè)月)。根據(jù)喉癌組織目標(biāo)基因相對(duì)表達(dá)量中位數(shù)，定義miR-101≤0.56為低表達(dá)(n=40)，>0.56為高表達(dá)(n=64)；并定義miR-384≤0.45為低表達(dá)(n=46)，>0.45為高表達(dá)(n=58)，并采用Kaplan-Meier 法分析miR-101、miR-384對(duì)喉癌患者預(yù)后的影響。

2 結(jié)果

2.1 miR-101、miR-384表達(dá)比較 與癌旁正常黏膜組織相比，喉癌組織miR-101、miR-384相對(duì)表達(dá)量均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 喉癌組織與癌旁正常黏膜組織miR-101、miR-384相對(duì)表達(dá)量比較

2.2 喉癌組織miR-101與miR-384表達(dá)的相關(guān)性分析 Pearson相關(guān)分析顯示，喉癌組織miR-101相對(duì)表達(dá)量與miR-384相對(duì)表達(dá)量呈正相關(guān)(r=0.436，P<0.001)。

2.3 臨床病理參數(shù)對(duì)喉癌組miR-101、miR-384表達(dá)的影響 性別、年齡、吸煙史、腫瘤直徑、原發(fā)部位、分化程度對(duì)喉癌組織miR-101、miR-384的表達(dá)無明顯影響(P>0.05)； III～I(xiàn)V期患者喉癌組織miR-101、miR-384表達(dá)量低于II期(P<0.05)；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者喉癌組織miR-101、miR-384表達(dá)量低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者(P<0.05)。見表2。

表2 臨床病理參數(shù)對(duì)喉癌組織miR-101、miR-384表達(dá)的影響

續(xù)表2

2.4 影響喉癌組織miR-101、miR-384表達(dá)的多因素回歸分析 以TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移為自變量，以喉癌組患者miR-101、miR-384表達(dá)量為因變量，進(jìn)行多元逐步回歸分析，結(jié)果顯示，TNM分期較晚、發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與喉癌組織miR-101、miR-384的相對(duì)表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)。見表3、4。

表3 影響miR-101表達(dá)的多元逐步回歸分析

表4 影響miR-384表達(dá)的多元逐步回歸分析

2.5 生存分析 miR-101高表達(dá)術(shù)后5年生存率為84.37%，高于低表達(dá)的62.50%(χ2=4.486，P=0.034)；miR-384高表達(dá)術(shù)后5年生存率為86.21%，高于低表達(dá)的60.87%(χ2=7.587，P=0.006)。不同miR-101、miR-384表達(dá)水平喉癌患者的生存曲線見圖1、2。

圖1 不同miR-101表達(dá)水平喉癌患者的生存曲線

圖2 不同miR-384表達(dá)水平喉癌患者的生存曲線

3 討論

miRNA是一類真核生物內(nèi)源性非編碼單鏈小RNA分子，長(zhǎng)19～23個(gè)核苷酸。盡管miRNA在人體基因數(shù)中僅占2%，卻對(duì)30%以上人體基因的表達(dá)有調(diào)控作用，介導(dǎo)細(xì)胞生長(zhǎng)、分化及凋亡等多種生物學(xué)過程，與多種疾病發(fā)生、進(jìn)展緊密關(guān)聯(lián)[7]。miR-101被發(fā)現(xiàn)在多種惡性腫瘤組織中呈低表達(dá)，其低表達(dá)與腫瘤發(fā)生、發(fā)展呈正相關(guān)關(guān)系，且低表達(dá)miR-101癌癥患者生存率較低[8]。研究[9-10]表明，miR-101在惡性腫瘤中有著強(qiáng)大的抑癌基因功能。Zhou等[11]研究顯示，miR-101可通過抑制細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子 2表達(dá)而抑制胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。Ye等[12]研究發(fā)現(xiàn)，miR-101可通過下調(diào)趨化因子12表達(dá)而抑制肺癌發(fā)生發(fā)展。劉健等[13]研究表明，miR-101可通過介導(dǎo)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3A表達(dá)，而對(duì)乳腺癌增殖、遷移有抑制作用。本研究顯示，與癌旁正常黏膜組織相比，喉癌組織miR-101相對(duì)表達(dá)量降低，且臨床分期越晚、伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者miR-101相對(duì)表達(dá)量相對(duì)越低，提示miR-101表達(dá)下調(diào)與喉癌發(fā)生、侵襲及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。

目前，已在多種腫瘤中發(fā)現(xiàn)，miR表達(dá)與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[13]。Chen等[14]研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)鏈非編碼RNA結(jié)直腸腫瘤差別表達(dá)基因通過抑制miR-384表達(dá)促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲，提示miR-384參與了肝癌的發(fā)生發(fā)展。miR-384還能靶向抑制蛋白激酶B表達(dá)而抑制大腸癌細(xì)胞增殖，在多種致癌信號(hào)通路中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-384在喉癌組織中表達(dá)明顯降低，且晚期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者miR-384相對(duì)表達(dá)量明顯低于早期、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，提示miR-384表達(dá)下調(diào)，可能參與了喉癌的發(fā)生發(fā)展，這可能是喉癌發(fā)生的重要分子機(jī)制，有望成為靶向治療的新靶點(diǎn)。

本研究對(duì)miR-101與miR-384的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行相關(guān)分析顯示，二者呈正相關(guān)，二者表達(dá)下調(diào)可能共同促進(jìn)了喉癌的發(fā)生發(fā)展。此外，本研究還對(duì)患者5年生存情況與這2基因表達(dá)之間的關(guān)系進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示，miR-101高表達(dá)術(shù)后5年生存率為83.6%，高于低表達(dá)的64.8%；miR-384高表達(dá)術(shù)后5年生存率為84.1%，高于低表達(dá)的65.3%。提示miR-384高表達(dá)有利于患者預(yù)后。由此推測(cè)miR-101、miR-384可能作為判斷喉癌病理進(jìn)程及預(yù)后的新型分子標(biāo)志物。

綜上所述，miR-101、miR-384在喉癌組織中均呈低表達(dá)，與腫瘤發(fā)生、侵襲、轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)，這將有助于深入研究喉癌的發(fā)病機(jī)制，并為臨床診療提供更多策略及思路。