線粒體異常與卵巢功能不全的相關(guān)性研究

于 蕾 紀(jì)冬梅

早發(fā)性卵巢功能不全(premature ovarian insufficiency，POI)是指40歲之前月經(jīng)正常，因卵巢功能衰竭或者不全而出現(xiàn)的持續(xù)性閉經(jīng)等癥狀，直接影響患者生育，增加患者流產(chǎn)率和胎兒染色體畸變率，是卵巢早衰(premature ovarian failure，POF)的早期階段[1]。目前認(rèn)為，POI具體發(fā)病原因涉及多個(gè)方面，但大部分患者的病因仍不確定。據(jù)報(bào)道[2]，非由化療或放療引起的POI病例中，確定病因的僅占所有病例的20%，大約5%的POI病例為自身免疫性的疾病，15%的病例有明確的遺傳起源，包括染色體異常和/或個(gè)體基因突變[3]。而線粒體作為機(jī)體細(xì)胞工作的“能量工廠”，目前研究[4]認(rèn)為，其功能異?？赡芘cPOI的發(fā)病存在著密切聯(lián)系，但具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。本文對(duì)線粒體異常與卵巢功能不全發(fā)生發(fā)展相關(guān)的研究進(jìn)行綜述，旨在從線粒體遺傳的角度解釋POI發(fā)生的分子機(jī)制，并為POI的風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)與治療提供更好的方案。

1 線粒體與線粒體DNA

線粒體廣泛存在于除紅細(xì)胞以外的真核細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，與各種生命活動(dòng)需要能量的供給息息相關(guān)。卵細(xì)胞作為人體內(nèi)線粒體含量最為豐富的細(xì)胞，依賴線粒體獲得發(fā)育各個(gè)階段所需要的能量。顆粒細(xì)胞內(nèi)也含有大量的線粒體，影響顆粒細(xì)胞的分裂代謝、細(xì)胞周期以及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等過程[5]。研究[6-8]發(fā)現(xiàn)，線粒體功能失調(diào)可能引起顆粒細(xì)胞的凋亡，使卵母細(xì)胞的生理活動(dòng)停止，導(dǎo)致卵泡發(fā)生閉鎖甚至衰竭，進(jìn)而引起卵巢儲(chǔ)備功能減退(decreased ovarian reserve,DOR)，而DOR也會(huì)對(duì)周圍顆粒細(xì)胞線粒體生物合成的動(dòng)態(tài)特性產(chǎn)生嚴(yán)重影響，形成惡性循環(huán)，最終推動(dòng)POI的進(jìn)展。

線粒體是半自主細(xì)胞器，受細(xì)胞核基因組(nuclear DNA,nDNA)與線粒體基因組(mitochondrial DNA，mtDNA)的共同調(diào)控。mtDNA是含有16～569個(gè)堿基對(duì)的環(huán)狀DNA分子，編碼呼吸鏈上的13種蛋白、線粒體核糖體中2種rRNA以及22種tRNA共同構(gòu)成線粒體翻譯機(jī)制的一部分。但由于mtDNA沒有組蛋白和染色體結(jié)構(gòu)的保護(hù)而極易損傷，mtDNA的突變率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于核DNA突變率。目前線粒體DNA中超過250個(gè)致病性變體和超過300個(gè)核基因的突變已經(jīng)被證明是導(dǎo)致線粒體疾病的重要因素[9-10]。其中與POI發(fā)病相關(guān)的基因包括MRPS22、POLG、TWNK、LARS2、HARS2、AARS2、CLPP、和LRPPRC等，這些基因在線粒體DNA復(fù)制、基因表達(dá)、蛋白質(zhì)合成和降解中起著重要作用。

2 線粒體遺傳異常與POI

2.1 mtDNA拷貝數(shù)異常與POI的聯(lián)系 由于卵細(xì)胞內(nèi)每個(gè)線粒體含有1～2個(gè)mtDNA,所以為了方便計(jì)算線粒體數(shù)目，通常用mtDNA 的拷貝數(shù)來反映線粒體數(shù)目。線粒體在卵巢衰老中的病理生理作用研究[7，11]表明，線粒體DNA與卵母細(xì)胞質(zhì)量緊密相關(guān)，卵母細(xì)胞mtDNA拷貝數(shù)低，反映了卵母細(xì)胞成熟過程中線粒體含量低，細(xì)胞器生物基因不足，是卵母細(xì)胞質(zhì)量差、能力差的重要指標(biāo)，進(jìn)而預(yù)示著胚胎發(fā)育不良。在成熟的卵細(xì)胞中，mtDNA拷貝數(shù)最高，受精后隨著胚胎發(fā)育，拷貝數(shù)逐漸降低，直到達(dá)到一個(gè)平臺(tái)期[12]。研究[13]表明，高細(xì)胞拷貝數(shù)的mtDNA允許致病性mtDNA突變與正常mtDNA共存，通常致病性mtDNA突變只有在高于一定閾值水平時(shí)才會(huì)引起疾病。例如，負(fù)責(zé)線粒體基因組復(fù)制的線粒體DNA聚合酶γ催化亞單位(mitochondrial DNA polymeraseγ，POLG)的突變可導(dǎo)致mtDNA缺失和/或mtDNA缺失累積，部分POLG突變的女性患者存在POI的臨床表現(xiàn)[14-15]。Twinkle-mtDNA螺旋酶(twinkle mtDNA helicase,TWNK)是mtDNA復(fù)制所需的核心因子之一，研究[16]表明Twinkle基因編碼的解旋酶的高變異率也會(huì)影響mtDNA復(fù)制過程，可引起一系列遺傳性疾病，如Perrault綜合征。線粒體DNA控制區(qū)(又稱D-loop區(qū)，displacement loop region)是線粒體DNA中的一段非編碼區(qū)，D-Loop 區(qū)是重鏈的復(fù)制起點(diǎn)以及重、輕鏈的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子所在的位置,是γDNA 聚合酶與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的區(qū)域 ,調(diào)控mtDNA的復(fù)制與轉(zhuǎn)錄[17-19]。研究[20-24]發(fā)現(xiàn)，線粒體DNA D-Loop區(qū)的變異和腫瘤、糖尿病等疾病的關(guān)系密切，而且D-loop區(qū)突變率遠(yuǎn)高于mtDNA編碼區(qū)。導(dǎo)致D-loop區(qū)變異率高的原因可能有兩個(gè)，一是該區(qū)進(jìn)化速度相對(duì)較快，是線粒體DNA序列和長度變異最大的區(qū)域；二是mtDNA通過該區(qū)與線粒體膜結(jié)合，與mtDNA相比，Dloop區(qū)更易受到脂質(zhì)過氧化物的損害。因此，猜測(cè)D-loop 區(qū)高突變與POI可能存在一定關(guān)系。此外，有實(shí)驗(yàn)[25-26]發(fā)現(xiàn)，mtDNA D-loop 區(qū)的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)可能會(huì)影響mtDNA的復(fù)制和氧化磷酸化(oxidative phosphorylation,OXPHOS)關(guān)鍵蛋白的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致電子傳遞鏈(electron transfer chain，ETC)和線粒體功能的變化，造成功能不足，從而導(dǎo)致 mtDNA 損傷、活性氧(reactive oxygen species)過量產(chǎn)生和異常能量代謝，進(jìn)而影響卵母細(xì)胞一系列的發(fā)育過程。目前對(duì)于POI與線粒體Dloop區(qū)的相關(guān)研究比較少，尚需進(jìn)一步探索。

2.2 mt-DNA基因突變與POI的聯(lián)系 多項(xiàng)研究[27-28]發(fā)現(xiàn)，mt-tRNA基因的突變/變異與多種臨床疾病相關(guān)，包括非營養(yǎng)不良性肌強(qiáng)直、肥厚性心肌病、視力喪失等。這種致病性突變可導(dǎo)致RNA轉(zhuǎn)錄和翻譯缺陷，導(dǎo)致線粒體呼吸鏈功能受損[29]。為了觀察mt-tRNA突變/變異體與POI之間的關(guān)系，Ding等[30]對(duì)50例POI患者和30例年齡匹配的健康女性進(jìn)行了mt-tRNAs突變分析，經(jīng)過聚合酶鏈鎖反應(yīng) (polymerase chain reaction，PCR)擴(kuò)增和直接測(cè)序分析，發(fā)現(xiàn)存在5種突變：tRNALeu(UUR) C3303T, tRNAMet A4435G, tRNAGln T4363C, tRNACys G5821A 和 tRNAThr A15951G。根據(jù)臨床和生化數(shù)據(jù)，在POI進(jìn)展過程中，這些突變可能改變tRNALeu(UUR)、tRNAMet、tRNAGln、tRNACys和tRNAThr的二級(jí)或三級(jí)結(jié)構(gòu)[32-34]，破壞tRNA中高度保守的堿基對(duì)的穩(wěn)定性，使tRNA代謝失敗，最后導(dǎo)致線粒體翻譯缺陷[31]。因此，研究者們認(rèn)為這5種突變可能導(dǎo)致mt-tRNAs代謝的衰竭以及tRNA穩(wěn)態(tài)水平或氨基?；芰ο陆担罱K導(dǎo)致線粒體功能紊亂，參與POI的發(fā)病。這為探究POI的分子機(jī)制提供了新思路，但針對(duì)輕度線粒體功能障礙，mt-tRNA基因突變本身不足以產(chǎn)生臨床表型，有待進(jìn)一步大樣本研究。

2.3 編碼線粒體核糖體蛋白的基因異常與POI的聯(lián)系 Chen等[35]在兩個(gè)獨(dú)立的近親家庭的4名青春期POI女性中發(fā)現(xiàn)了核基因編碼線粒體核糖體蛋白S22(MRPS22)純合子錯(cuò)義變異體，他們對(duì)研究對(duì)象先后進(jìn)行全基因外顯子組測(cè)序(Whole Exome Sequencing,WES)以及Sanger測(cè)序，發(fā)現(xiàn)MRPS22(p.R202H)變異是與POI表型分離的唯一氨基酸變化。隨后研究者通過建立小鼠和果蠅兩個(gè)動(dòng)物模型來研究MRPS22突變對(duì)卵巢組織的影響，將MRPS22基因敲除后發(fā)現(xiàn)，MRPS22基因缺陷小鼠的胚胎致死率顯著增高，并且發(fā)現(xiàn)卵巢體細(xì)胞中MRPS22的丟失不會(huì)改變細(xì)胞活力或卵巢發(fā)育，但生殖細(xì)胞中MRPS22基因敲除，會(huì)導(dǎo)致雌性不孕;果蠅模型中，MRPS22基因缺陷對(duì)其生育和卵巢發(fā)育(致病性強(qiáng))均存在有害影響。除MRPS22外，線粒體翻譯涉及的其他核蛋白突變與卵巢發(fā)育受損也有關(guān)。編碼線粒體亮氨酸t(yī)RNA合成酶(leucyl-tRNA synthetase 2，LARS2)以及線粒體組氨酸t(yī)RNA合成酶(histidyl-tRNA synthetase 2，HARS2)的基因突變導(dǎo)致Perrault綜合征，女性患者可有卵巢早衰表現(xiàn)[36-37]；線粒體tRNA合成酶(Aminoacyle-tRNA synthetases，AARS2)突變導(dǎo)致進(jìn)行性白質(zhì)腦病伴卵巢功能衰竭[38]；真核起始因子2B(eukaryotic initiation factor 2B，EIF2B)是參與真核細(xì)胞翻譯起始的重要蛋白質(zhì),其突變也可以導(dǎo)致卵巢營養(yǎng)不良，甚至卵巢功能衰竭[39]。綜上，種種研究表明，涉及線粒體翻譯的許多基因突變與卵巢發(fā)育之間的因果關(guān)系突顯了線粒體翻譯在卵巢組織中的關(guān)鍵作用。線粒體蛋白質(zhì)參與機(jī)體氧化磷酸化、三羧酸循環(huán)、脂肪酸氧化等多種病理生理過程，其結(jié)構(gòu)、功能的改變與POI的發(fā)病有密切關(guān)系。

3 線粒體氧化磷酸化障礙與POI的聯(lián)系

在細(xì)胞色素c氧化酶亞基中，MT-CO1、MT-CO2和MT-CO3由線粒體基因組編碼,MT-CO1是主要的催化亞單位。研究[41-42]表明,過度表達(dá) MT-CO1基因的細(xì)胞中產(chǎn)生的活性氧類是介導(dǎo)凋亡和 DNA損傷途徑相關(guān)基因差異表達(dá)的關(guān)鍵效應(yīng)因子，即細(xì)胞色素C氧化酶1(mitochondrial cytochrome oxidase I，MT-CO1)基因的高表達(dá)水平與卵母細(xì)胞成熟有關(guān)。Chaffari等[43]發(fā)現(xiàn)，POI患者M(jìn)T-CO1突變的發(fā)生率增加，提示MT-CO1基因突變可能會(huì)導(dǎo)致POI的發(fā)生。MT-CO1基因突變,引起OXPHOS障礙，導(dǎo)致ATP產(chǎn)生減少,ATP不足可影響卵母細(xì)胞內(nèi)PI3K/mTOR通路，導(dǎo)致卵母細(xì)胞雷帕霉素復(fù)合物1(mammalian target of rapamycin complex 1，mTORC1)活性升高,原始卵泡池提前激活[44-46]，從而加速卵泡發(fā)育和卵泡丟失，這會(huì)導(dǎo)致成年早期卵泡的衰竭，最后形成POF。根據(jù)自由基學(xué)說,線粒體氧化磷酸化過程中會(huì)產(chǎn)生自由基和活性氧(reactive oxygen species，ROS)。研究[47]表明,適量的ROS在卵母細(xì)胞的發(fā)育過程中產(chǎn)生一定的積極影響。但當(dāng)機(jī)體不能代謝這些毒性產(chǎn)物時(shí)，大量的自由基和ROS堆積可對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生有害影響，包括:①導(dǎo)致線粒體形態(tài)發(fā)生變化，如膜通透性增加、嵴結(jié)構(gòu)破壞、小線粒體碎片數(shù)量增加等[48-49]；②產(chǎn)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，釋放Ca2+增加，ROS進(jìn)一步積累，導(dǎo)致線粒體功能障礙[50]；③過高的ROS可以破壞卵巢顆粒細(xì)胞，使卵泡黃體化，誘導(dǎo)顆粒細(xì)胞凋亡[51]。同時(shí)，由于mtDNA缺乏保護(hù)并且與ETC位置相近，自由基和ROS可誘導(dǎo)mtDNA的氧化損傷,導(dǎo)致mtDNA突變的概率大幅度增加[52]，從而影響mtDNA編碼的呼吸鏈相關(guān)蛋白的合成，形成惡性循環(huán)。

4 POI的相關(guān)預(yù)測(cè)和治療

4.1 mtDNA拷貝數(shù)的檢測(cè) 卵母細(xì)胞和胚胎發(fā)育過程中，mtDNA拷貝數(shù)是線粒體功能的生物標(biāo)志物之一[53]。卵母細(xì)胞成熟時(shí)，胞內(nèi)mtDNA明顯增加，當(dāng)mtDNA拷貝數(shù)增加到一定程度時(shí)，卵母細(xì)胞才有受精能力。研究[54]發(fā)現(xiàn),卵母細(xì)胞內(nèi)異常線粒體比例升高和 mtDNA 拷貝數(shù)下降，可能會(huì)導(dǎo)致線粒體能量代謝障礙，影響卵母細(xì)胞發(fā)育、受精等過程。Marco等[55]通過實(shí)驗(yàn)證實(shí),POI女性血液細(xì)胞mtDNA含量具有顯著改變，血液和卵巢mtDNA/nDNA拷貝數(shù)似乎是相關(guān)的，所以血液中mtDNA含量的測(cè)定可能成為POI風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)的有用工具。

4.2 保護(hù)線粒體功能 線粒體是對(duì)各種損傷最為敏感的細(xì)胞器之一，最常見的損傷原因是氧化應(yīng)激。為了應(yīng)對(duì)氧化應(yīng)激的損害，使用多種抗氧化劑對(duì)于改善卵巢功能和卵子質(zhì)量可能起到一定的作用。目前研究[56-57]提示，添加輔酶 Q10 在一定程度上能提高卵巢功能低減患者的卵巢反應(yīng)性、排卵率，改善妊娠狀態(tài)；維生素E(vitamin E,VE)在整個(gè)生殖過程中起著至關(guān)重要的作用,與POI關(guān)系密切[58]，VE 缺乏可導(dǎo)致機(jī)體的氧化能力降低，造成ROS堆積，引起卵母細(xì)胞線粒體線粒體異常，最終影響卵母細(xì)胞質(zhì)量。補(bǔ)充VE可增加卵巢卵泡生成、卵母細(xì)胞質(zhì)量、受精率和胚胎發(fā)育[59]。褪黑素(melatonin，MT)是維持卵巢正常功能的調(diào)節(jié)因素之一,可改善不孕女性卵母細(xì)胞的氧化應(yīng)激狀態(tài),提高體外受精-胚胎移植(In vitro fertilization-embryo transfer,IVF-ET)治療下的受精率,對(duì)推進(jìn)IVF-ET的發(fā)展有積極作用[60]；長期給予MT可改善衰老所致卵巢功能不全小鼠的卵巢功能，增加卵泡數(shù)量, 減少閉鎖卵泡，提高卵母細(xì)胞受精率與囊胚形成率[61]。此外，白藜蘆醇也是改善生殖功能的關(guān)注熱點(diǎn)，它是一種具有抗氧化活性的植物抗毒素，通過實(shí)驗(yàn)[62]發(fā)現(xiàn)，在貓卵細(xì)胞體外受精過程中補(bǔ)充白藜蘆醇可以逆轉(zhuǎn)氧化應(yīng)激對(duì)卵母細(xì)胞的不利影響，為改善體外受精卵的培養(yǎng)條件提供了依據(jù)，但具體臨床應(yīng)用仍有待進(jìn)一步研究。

4.3 補(bǔ)充正常線粒體 卵母細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)和功能異?？蓪?dǎo)致卵母細(xì)胞代謝障礙，引起POI的發(fā)生。研究[63]發(fā)現(xiàn)，功能性線粒體移植作為輔助生殖的新療法，可能是提高卵母細(xì)胞質(zhì)量的可行策略。早在1997年,胞質(zhì)移植技術(shù)成功應(yīng)用于高齡不育患者，說明胞質(zhì)移植對(duì)改善胚胎發(fā)育具有積極影響，但因其移植成分復(fù)雜、影響因素多、存在安全隱患和倫理糾紛等問題，無法廣泛用于臨床。胞核移植現(xiàn)有兩種方法，一種是指將供體卵子中的細(xì)胞核取出并放入受體去核后的卵子中，培育出胚胎；另有一種是電融合法，即將供體的卵細(xì)胞與去核的受體卵細(xì)胞通過電刺激使之發(fā)生融合。但以上方法產(chǎn)生的后代的基因組包含來自親本的核DNA和來自親本以及供體的mtDNA，造成胚胎細(xì)胞線粒體的異質(zhì)性，其安全性有待確定。近些年，自體線粒體移植備受關(guān)注，這種方法可以克服所謂“三親”嬰兒的遺傳瓶頸。方叢團(tuán)隊(duì)[63]將自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中的線粒體分離并移植到卵母細(xì)胞中，獲得滿意的妊娠結(jié)局，為解決原發(fā)不孕夫婦胚胎質(zhì)量差及妊娠結(jié)局差等問題提供了新思路。但由于自體干細(xì)胞很難獲得，更重要的是，轉(zhuǎn)移線粒體的劑量和質(zhì)量是決定其成功與否的關(guān)鍵，目前從細(xì)胞培養(yǎng)中分離和鑒定功能性線粒體的技術(shù)不成熟，分離線粒體的數(shù)量和功能很難分析。因此，自體線粒體移植的有效性和安全性有待進(jìn)一步研究[61]。

綜上所述，卵巢功能不全的病因多且復(fù)雜，具體相關(guān)機(jī)制尚未完全發(fā)掘。而線粒體異常在卵巢功能不全中所發(fā)揮的具體作用也是大眾密切關(guān)注的，需要進(jìn)一步的研究來更好地闡明線粒體對(duì)POI的貢獻(xiàn)，從而在未來選擇更多更好的方案來治療POI。