基層獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室開展PCR 檢測的假陽性防范策略

吳玉疆，楊丁

（宜賓市動物疫病預(yù)防控制中心四川宜賓 644000）

目前，宜賓市市縣兩級共11 個(gè)獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室均配置了熒光PCR儀，開展病毒核酸檢測。檢測過程中，出現(xiàn)過假陽性結(jié)果的情況，對檢測造成了困擾。市動物疫控中心獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室通過在工作中分析總結(jié)，對假陽性的防范有了一定心得，適用于基層施行，現(xiàn)交流如下。

1 基層獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室開展PCR 檢測出現(xiàn)假陽性的主要原因

1.1 意識不足，措施不夠

基層獸醫(yī)人員大多對PCR 檢測技術(shù)了解較少，防范意識不足，也不知防范重點(diǎn)，加之日常工作事務(wù)繁雜，在檢測工作中很容易忽略防范措施。

1.2 分區(qū)不當(dāng)，硬件不足

宜賓市縣級基層獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室一般按照BLS-1 設(shè)置和分區(qū)，尚有幾個(gè)未通過實(shí)驗(yàn)室考核，規(guī)范化水平不夠。大多沒有或僅有一間病原檢測室，分區(qū)不夠清晰，也沒有氣流壓力系統(tǒng)，有的生物安全柜年久失修或沒有配備，容易導(dǎo)致污染發(fā)生。

1.3 經(jīng)驗(yàn)缺乏，操作不當(dāng)

基層實(shí)驗(yàn)人員的PCR 檢測操作經(jīng)驗(yàn)少，不夠熟悉，在處理、轉(zhuǎn)移、加樣等過程中均可能造成污染。加之目前檢測試劑敏感性都較高，試劑、吸頭、移液器、儀器等被污染，或是操作不當(dāng)產(chǎn)生氣溶膠等，均可導(dǎo)致假陽性結(jié)果。

2 基層獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室開展PCR 檢測的假陽性防范策略

檢測結(jié)果的時(shí)效性不言而喻，基層獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室若發(fā)生污染后再分析原因消除污染這一過程費(fèi)時(shí)費(fèi)力，因此，防范于未然顯得特別重要。

2.1 合理分區(qū)，配置到位

PCR 檢測需按照樣品處理、試劑配制、加樣、上機(jī)反應(yīng)四個(gè)過程，在四個(gè)獨(dú)立空間進(jìn)行，且按此進(jìn)行單向流向。結(jié)合宜賓市基層獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室實(shí)際，樣品處理（包括核酸提?。┲饕谏锇踩駜?nèi)進(jìn)行，暫時(shí)沒有的可在通風(fēng)櫥或超凈工作臺中進(jìn)行。加樣在血清室中進(jìn)行。試劑配制在相對獨(dú)立區(qū)域或另外一個(gè)超凈工作臺進(jìn)行，如果條件受限可以和加樣安排在血清室的兩個(gè)不同處且試劑配制區(qū)處于上風(fēng)口。熒光PCR 儀放在病原室、儀器室或其他相對獨(dú)立區(qū)域。

各區(qū)域根據(jù)空間大小安裝1 組以上紫外燈（平均功率為1.5W/m3），建議配備一臺移動紫外車。各區(qū)域物品專用，配備實(shí)驗(yàn)服、一次性手套、口罩、帽子、記號筆、帶蓋垃圾桶、清潔工具等。樣品處理、試劑配制和加樣區(qū)各按需配備一組移液器，如加樣區(qū)最好0～10μL 和0～20μL 兩個(gè)量程各一把，有移液器的區(qū)域都配備帶蓋廢液缸。試劑要有專門冰箱存放，不能放入樣品。

2.2 提高意識，規(guī)范操作

2.2.1 檢測前準(zhǔn)備進(jìn)入前：有的基層獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室離辦公區(qū)很近，人員進(jìn)出較為隨意，應(yīng)嚴(yán)格控制人員進(jìn)出。進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室必須換鞋（或鞋套），穿工作服。有時(shí)檢測人員會參與采樣，當(dāng)日應(yīng)盡量不進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室，必須參與檢測時(shí)，應(yīng)洗手、清洗鞋底、清潔衣服，整潔后方可進(jìn)入，必要時(shí)更換鞋子，戴工作帽。同時(shí)，在檢測區(qū)域外用消毒劑噴灑樣品外包裝，對采血管、離心管等樣品保存管外表面進(jìn)行消毒后方可帶入檢測區(qū)域。

進(jìn)入后：打開生物安全柜風(fēng)機(jī)保持10min 以上再使用。柜內(nèi)不放無關(guān)物品，可在臺面上鋪一層吸水性墊料，以防污染和產(chǎn)生氣溶膠。檢查廢液缸中是否加入適量10%次氯酸消毒液，各垃圾桶內(nèi)是否套上厚實(shí)垃圾袋。檢查試劑、耗材、用具等是否到位，避免檢測時(shí)來回“串室”取拿物品。檢查臺面是否潔凈，空調(diào)開啟后注意風(fēng)速風(fēng)向。

平時(shí)將EP 管、移液器吸頭、吸頭盒等封口放入柜內(nèi)，避免開口敞放。新試劑可在干凈區(qū)分裝保存。

2.2.2 檢測中操作換：佩戴合適的手套，寬松的手套容易沾染。檢測過程中懷疑手套被污染時(shí)立即換掉。進(jìn)出不同區(qū)域更換對應(yīng)區(qū)域?qū)嶒?yàn)服（標(biāo)記或用不同顏色實(shí)驗(yàn)服以便識別）、手套等。移液器和吸頭、EP 管等耗材只在該區(qū)域使用。

慢：生物安全柜內(nèi)操作時(shí)動作應(yīng)輕緩，在臺面中后部進(jìn)行。移液器吸取時(shí)要輕緩，避免過快吸入內(nèi)部污染或產(chǎn)生氣溶膠，最好使用帶濾芯的吸頭。移液器從采血管等較深容器中吸取樣品時(shí)，應(yīng)傾斜容器，盡量不讓前端接觸容器內(nèi)壁，若沾污應(yīng)及時(shí)用酒精棉擦拭。從袋中取EP 管過程中，手不要觸及管蓋內(nèi)側(cè)，可用鑷子夾取。樣品管、試劑管擰蓋時(shí)手與管蓋接觸面要少，管蓋擰開后，倒放在桌面上。檢測未完成前，其他實(shí)驗(yàn)人員不要大動作收拾、打掃等。蓋：槍頭盒用完立即關(guān)蓋，避免吸完樣品或陽性對照的槍頭經(jīng)過打開的槍頭盒、還未蓋口的PCR 管或試劑管蓋。

離：試劑和樣品在加樣前必須離心到管底，特別是陽性對照，以免吸液時(shí)沾到移液器前端污染。

分：加樣順序按陰性對照-樣品-陽性對照進(jìn)行，分為潔凈區(qū)、操作區(qū)和廢棄區(qū)。左邊為潔凈區(qū)，放置吸頭、EP 管、試劑、管蓋等，中間為操作區(qū)，放置樣品、加樣板等，右邊為廢棄區(qū)，放置廢液缸等。這樣，加樣時(shí)從左到右移動，避免來回污染。加樣過程中的廢吸頭、廢棄物等要放入廢液缸內(nèi)，且要保證能浸泡于消毒液中。

2.2.3 檢測后處理整備：整理臺面，用75%酒精和10%次氯酸擦拭消毒生物安全柜臺面，風(fēng)機(jī)運(yùn)行至少10min 再關(guān)閉，并開啟柜內(nèi)紫外燈照射30min 以上，若是通風(fēng)櫥或超凈工作臺則用移動紫外燈照射60min 以上。臺面、移液器等的表面同樣可用酒精和消毒劑擦拭。樣品、廢棄物等高壓滅菌處理，剪刀等消毒洗凈后高壓滅菌備用。PCR 反應(yīng)管嚴(yán)禁開口也無需高壓，及時(shí)清理出實(shí)驗(yàn)室。垃圾桶每日清倒更換新的垃圾袋，廢液缸更換消毒液。打開各區(qū)的紫外燈照射1h 以上。值得注意的是，高壓的主要作用是滅活病原而非清除核酸污染。

通風(fēng)：樣品處理間的開窗通風(fēng)在檢測后方可進(jìn)行。除樣品處理區(qū)外，其他檢測區(qū)域如無核酸污染不用經(jīng)常打開門窗通風(fēng)，一般3～5d 換氣1h。

日常維護(hù)中，實(shí)驗(yàn)地面、儀器表面、實(shí)驗(yàn)服等根據(jù)工作頻率和檢測結(jié)果消毒和清潔。墻面、地面用浸泡有效氯濃度0.5%消毒液的抹布或拖布擦拭，注意污染區(qū)和清潔區(qū)的抹布、拖布等不要混用。儀器表面和金屬部件可用75%酒精消毒，非金屬物件可用含2%～3%有效氯的次氯酸鹽消毒，清水洗凈或擦拭。

2.2.4 污染處理基層獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室PCR 檢測污染的原因主要是氣溶膠、移液器、吸頭、試劑等。一般污染可通過復(fù)檢或小范圍消毒、更換移液器、槍頭、試劑等后重檢排除。若上述處理無法消除，伴有假陽性不規(guī)律增多，應(yīng)懷疑發(fā)生氣溶膠污染，需暫停檢測重點(diǎn)進(jìn)行通風(fēng)和清潔消毒處理，具體如下。

所有臺面、地面、用具、儀器外表面等用10%次氯酸清潔，儀器內(nèi)表面和非玻璃外表面、管架等用0.5%次氯酸清潔，清洗實(shí)驗(yàn)服，開窗大范圍通風(fēng)數(shù)天并每日紫外燈照射，更換槍頭、試劑等?？蛇x用核酸祛除劑，對重點(diǎn)區(qū)域進(jìn)行噴灑。之后可通過環(huán)境監(jiān)測（將配好的反應(yīng)液開蓋暴露于各監(jiān)測點(diǎn)半小時(shí)后直接上機(jī)反應(yīng)）驗(yàn)證污染是否消除。

3 保證基層獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室PCR 檢測準(zhǔn)確性的幾個(gè)要點(diǎn)

3.1 合理分區(qū)

合理分區(qū)是開展PCR 檢測的前提?；鶎訉?shí)驗(yàn)人員防污染意識不足，加之在不合理的分區(qū)內(nèi)進(jìn)行樣品處理、試劑配制、加樣等操作，污染風(fēng)險(xiǎn)較高。

3.2 重視細(xì)節(jié)

基層實(shí)驗(yàn)人員往往日常工作事務(wù)繁雜，檢測過程中臨時(shí)離開、接打電話等時(shí)有發(fā)生，而PCR 檢測對注意力和操作要求較高，任何一個(gè)細(xì)節(jié)沒到位，都可能造成結(jié)果不準(zhǔn)確。如在開放環(huán)境進(jìn)行樣品前處理；天熱時(shí)空調(diào)大風(fēng)速來回吹；廢液缸和垃圾桶不帶蓋或長期處于開蓋狀態(tài)；加樣時(shí)讓EP 管、槍頭盒長期打開并處于下風(fēng)向，或棄槍頭時(shí)直接從打開的EP 管、吸頭盒上面劃過等。

3.3 隊(duì)伍穩(wěn)定

分子生物學(xué)檢測逐漸成為基層獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室的一項(xiàng)能力建設(shè)內(nèi)容，相比傳統(tǒng)血清學(xué)檢測，PCR 等分子生物學(xué)檢測對實(shí)驗(yàn)人員的技能提出了更高要求。在硬件保證、制度實(shí)施的前提下，檢測人員通過技能培訓(xùn)、較長時(shí)間的崗位規(guī)范操作和定期的比對驗(yàn)證等，不斷提升熟練度和經(jīng)驗(yàn)，才能保證每次檢測的質(zhì)量?！?/p>