四逆湯高效液相指紋圖譜的建立及含量測定

阮玥 林燕 張曉燕

摘要 目的：通過高效液相色譜法（HPLC）對四逆湯進(jìn)行指紋圖譜的建立。方法：對HPLC法進(jìn)行常規(guī)的可靠性方法學(xué)考察，包括專屬性、精密度、穩(wěn)定性等，然后進(jìn)一步采用HPLC對四逆湯進(jìn)行指紋圖譜的建立，在此基礎(chǔ)上比較10批不同四逆湯樣品的相似度，并進(jìn)行含量測定。結(jié)果：1）線性回歸考察中結(jié)果顯示在一定的線性范圍內(nèi)四逆湯中的次烏頭堿對照品、6-姜酚對照品、和甘草苷對照品溶液線性關(guān)系考察均顯示良好。2）烏頭堿、6-姜酚和甘草苷在精密度試驗、穩(wěn)定性試驗和重復(fù)性試驗中RSD值分別為0.47%、0.86%、0.39%，2.11%、2.63%、1.95%，1.58%、1.97%、1.02%，均顯示四逆湯在HPLC檢測中的精密度、穩(wěn)定性和重復(fù)性均較好。3）四逆湯中次烏頭堿、6-姜酚和甘草苷的含量測定中10個不同批次的四逆湯在3個成分中差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），其平均測得量為（12.86±0.18）μg/mL、（62.91±0.78）μg/mL、（349.96±0.26）μg/mL。結(jié)論：采用高效液相對四逆湯進(jìn)行指紋圖譜的建立和相似度比較分析及含量測定發(fā)現(xiàn)，四逆湯的質(zhì)量穩(wěn)定性均一，可作為臨床療效的穩(wěn)定性提供藥理學(xué)實驗依據(jù)。

關(guān)鍵詞 高效液相色譜法;四逆湯;指紋圖譜;次烏頭堿;6-姜酚;甘草苷;含量測定;藥理實驗

Abstract Objective：To establish the fingerprint of Sini Decoction by high performance liquid chromatography（HPLC）.Methods：The routine reliability methodology of HPLC method was investigated，including specificity，precision and stability etc.，and HPLC was used for the establishment of fingerprint of Sini Decoction.On this basis，the similarity of 10 batches of different Sini Decoction samples were compared，and the content was determined.Results：1）The results of linear regression investigation showed within a certain linear range，the linear relationship of the subaconitine reference substance，6-gingerol reference substance，and glycyrrhizin reference substance solution in Sini Decoction showed good results.2）The RSD values of aconitine，6-gingerol and glycyrrhizin in precision test，stability test and repeatability test were 0.47%，0.86%，0.39%，2.11%，2.63%，1.95%，1.58%，1.97% and 1.02%，respectively，which showed that Sini Decoction had good precision，stability and repeatability in HPLC detection.3）In the determination of the contents of sub-aconitine，6-gingerol and glycyrrhizin in Sini Decoction，there was no significant difference among the 3 components in 10 different batches of Sini Decoction，and the average contents were（12.86±0.18）ug/mL，（62.91±0.78）ug/mL and（349.96±0.26）ug/mL.Conclusion：HPLC relative to Sini Decoction was used for the establishment of fingerprints，similarity comparison analysis and content determination found that that Sini Decoction had uniform quality and stability，which could provide pharmacological experimental basis for the stability of clinical efficacy.

Keywords High performance liquid chromatography; Sini Decoction; Fingerprint; Hypaconitine; 6-gingerol; Glycyrrhizin; Content determination; Pharmacological experiment

中圖分類號：R284.1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A doi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.20.003

《傷寒論》中收錄了四逆湯，而這一僅由附子、炙甘草和干姜3味藥材組成的藥方，是以回陽與救逆并重的重要代表方，這個方的藥物組成雖然簡單，但是藥效極其復(fù)雜，是中藥中七情配伍的典型代表方藥。該方中僅以3味藥材即體現(xiàn)了中藥配伍中的相畏/相殺配伍關(guān)系，又體現(xiàn)了中藥配伍中相須/相使配伍關(guān)系，將中藥配伍中減毒增效的特點體現(xiàn)的淋漓盡致[1]。四逆湯廣泛運(yùn)用于臨床各個領(lǐng)域，不僅可以運(yùn)用于內(nèi)外婦兒多科病種[2-3]，而且涵蓋了心肝脾肺腎五大系統(tǒng)的各種疑難雜癥，比如心力衰竭[4]、心肌梗死[5-6]等心臟系統(tǒng)疾病;急性腸胃炎吐瀉過度的脾胃系統(tǒng)疾病[7-8];以及諸如休克[9]、腫瘤[10]等疑難雜癥。而四逆湯全方以附子為君藥，從現(xiàn)代藥理學(xué)的角度入手，烏頭類生物堿為其主要成分[11-12];干姜為臣藥，6-姜酚為其主要成分[13];炙甘草是佐使藥，甘草皂苷類化合物為其主要成分[14]。高效液相技術(shù)是在中藥研究中較為成熟的應(yīng)用技術(shù)，而中藥指紋圖譜能一定程度的反應(yīng)中藥化學(xué)成分，通過對藥方中單一成分的含量測定來對整個藥方進(jìn)行質(zhì)量控制。由此本研究通過建立四逆湯的指紋圖譜并采集10個不同批次的四逆湯進(jìn)行相似度比較，同時進(jìn)行四逆湯成分含量測定，為四逆湯的臨床質(zhì)量控制提供實驗研究基礎(chǔ)，現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 高效液相色譜儀器和色譜系統(tǒng)（上海圣科儀器設(shè)備有限公司，型號：LC210），色譜儀器系統(tǒng)包括：色譜柱恒溫箱、高壓輸液泵等;色譜柱（上海添時科學(xué)儀器有限公司，型號：C18-AQ，孔徑：120 ，規(guī)格：4.6 mm×150 mm，粒度：5 μm）;電子分析天平（上海方瑞儀器有限公司，型號：FA1104，最小顯示值：0.1 mg）;全自動小型超聲波清洗器（山東博科科學(xué)儀器有限公司，型號：BK-600VAD）。

1.2 試藥 由四川省維克奇生物科技有限公司購入的所有對照品，其中甘草苷對照品純度≥98%（批號：1340404）、次烏頭堿對照品純度≥98%（批號：130509）、6-姜酚對照品純度≥98%（批號：140124）。HPLC級色譜純乙腈（MERCK公司，德國，批號：75-05-8）;HPLC級色譜純甲醇（MERCK公司，德國，批號：67-56-1）;HPLC級色譜純甲酸（ACS公司，美國，批號：631-61-8）。

1.3 分析藥品 四逆湯，藥物組成有附子30 g、干姜20 g和炙甘草30 g。其中附子產(chǎn)地四川，屬于毛茛科植物烏頭的子根炮制加工品（批號：YPA4F0001）;干姜產(chǎn)地四川，屬于干姜的干燥根莖炮制加工品（批號：GAP200611）;炙甘草產(chǎn)地甘肅，屬于甘草的干燥根和根莖（批號：YPA4G0001）。所有藥材均為本院藥房提供，每種藥材均各取10個不同批次的藥材配伍四逆湯，并標(biāo)記為S1、S2、S3、S4……S10。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 進(jìn)樣體積為10 μL;色譜柱的的溫度控制在25 ℃;流動相A以色譜純甲醇和超純水均勻混合而成，流動相B以0.1%色譜純甲酸和超純水混合而成;研究中所有高效液相色譜線性梯度洗脫程序均根據(jù)表1進(jìn)行。檢測波長設(shè)置在230 nm時可以檢測到較多的吸收峰。

2.2 對照品溶液配制 采用精確度為十萬分之一的電子分析天平精密分別精密稱取次烏頭堿對照品、6-姜酚對照品、甘草苷對照品分別各3.81 mg、9.02 mg、11.66 mg，分別放置在用標(biāo)簽標(biāo)記好3個對照品名的5 mL容量瓶中，并用色譜純甲醇定容至容量瓶刻度，配制成所需質(zhì)量濃度的單一對照品溶液。最終次烏頭堿對照品的質(zhì)量濃度是0.762 g/L、6-姜酚對照品的質(zhì)量濃度是1.804 g/L、甘草苷對照品的質(zhì)量濃度是2.332 g/L。將4種對照品溶液取適量混合搖勻后，即得混合對照品溶液。

2.3 供試品溶液配制

2.3.1 四逆湯供試品溶液配制 根據(jù)1.3四逆湯藥物組成的配比加入10倍超純水，經(jīng)過1 h的充分浸泡之后，采用回流提取的方式提取濃縮液1 h，分別提取2次后，采用紗布過濾，合并2次過濾濃縮藥液，并加入無水乙醇在50 mL的容量瓶中，先靜置24 h后再經(jīng)過抽濾回收乙醇，最后將無醇味的濃縮藥液用超純水定容，使得最終四逆湯濃縮液的含藥量為0.8 g/mL，最后采用孔徑只有0.2 μm的有機(jī)過濾膜對四逆湯濃縮液進(jìn)行過濾，所得的續(xù)濾液即為四逆湯供試品溶液。

2.3.2 陰性對照溶液配制 首先依次除去一味藥材，保留2味藥材，（如除附子外可得陰性對照溶液1、除干姜外得陰性對照溶液2，除炙甘草外得陰性對照溶液3），根據(jù)1.3中的四逆湯藥物組成的配比加入10倍超純水，經(jīng)過1 h的充分浸泡之后，采用回流提取的方式提取濃縮液1 h，分別提取2次后，采用紗布過濾，合并2次過濾濃縮藥液，并加入無水乙醇在50 mL的容量瓶中，先靜置24 h后再經(jīng)過抽濾回收乙醇，最后將無醇味的濃縮藥液用超純水定容，使得最終四逆湯濃縮液的含藥量為0.8 g/mL，最后采用孔徑只有0.2 μm的有機(jī)過濾膜對四逆湯濃縮液進(jìn)行過濾，所得的續(xù)濾液即為陰性對照供試品溶液。

2.4 專屬性試驗 采用HPLC法對混合對照品溶液、陰性對照供試品溶液、四逆湯供試品溶液進(jìn)行專屬性試驗，本研究結(jié)果顯示，四逆湯中次烏頭堿、6-姜酚和甘草苷等3種主要成分均可見良好的分離度，且在各個陰性對照溶液中次烏頭堿、6-姜酚和甘草苷等3種主要成分相應(yīng)的保留時間里均無吸收峰，顯示本高效液相研究方法的專屬性均較好。

2.5 線性關(guān)系考察 根據(jù)對照品溶液配制方法將次烏頭堿對照品、6-姜酚對照品、和甘草苷對照品溶液分別根據(jù)從低濃度到高濃度的梯度，采用甲醇配制6個濃度梯度的對照品溶液，每一個濃度均測試4次，記錄色譜峰面積并計算平均值和繪制回歸方程，方程中縱坐標(biāo)Y是各對照品的平均峰面積，橫坐標(biāo)X是各對照品對應(yīng)的濃度梯度，結(jié)果顯示在一定的線性范圍內(nèi)四逆湯中的次烏頭堿對照品、6-姜酚對照品、和甘草苷對照品溶液線性關(guān)系考察均顯示良好。見表2。

2.6 精密度試驗 在精密試驗中將取同一批次同一時間配制的四逆湯供試品溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，連續(xù)檢測次烏頭堿、6-姜酚和甘草苷的含量并換算其各自對應(yīng)的RSD值，結(jié)果顯示烏頭堿、6-姜酚和甘草苷的的RSD值分別為0.47%、0.86%、0.39%，符合當(dāng)精密試驗中RSD值小于3%時，即說明高效液相色譜儀器的精密度良好，適宜采用高效液相色譜法為四逆湯建立指紋圖譜。

2.7 穩(wěn)定性試驗 在穩(wěn)定性試驗中，選擇某一個批次所配置的四逆湯供試品溶液，將該份四逆湯供試品溶液分為6份，并依次標(biāo)記相應(yīng)的靜置時間，依次為0、2、4、8、12、24 h，然后根據(jù)時間的從短到長的順序檢測四逆湯中次烏頭堿、6-姜酚和甘草苷的含量并換算各成分的RSD值。結(jié)果顯示次烏頭堿、6-姜酚和甘草苷的RSD值分別為2.11%、2.63%、1.95%，符合當(dāng)穩(wěn)定性試驗的RSD值小于3%時，即說明四逆湯供試品溶液在靜置24 h內(nèi)采用高效液相測試，其結(jié)果均能保持良好的穩(wěn)定性。

2.8 重復(fù)性試驗 在重復(fù)性試驗中，待測樣品必須保證是6份同一批次同一制備方法制備的四逆湯供試品溶液，必須試驗使用同一臺高效液相色譜儀器及相同的色譜條件重復(fù)測試該供試品溶液，檢測四逆湯中次烏頭堿、6-姜酚和甘草苷的含量并換算各成分的RSD值。結(jié)果顯示次烏頭堿、6-姜酚和甘草苷的RSD值分別為1.58%、1.97%、1.02%，符合當(dāng)重復(fù)性試驗RSD值小于3%時，即說明采用高效液相色譜法檢測四逆湯供試品溶液能夠保持良好的重復(fù)性。

2.9 回收率試驗 在加樣回收率試驗中，將含量已知的四逆湯供試品溶液分成6個等份，每一份均加入等量的對照品溶液，混合均勻后對混合液和各個對照品溶液分別重復(fù)檢測6次，檢測四逆湯供試品溶液中次烏頭堿、6-姜酚和甘草苷的平均回收率。結(jié)果顯示次烏頭堿、6-姜酚和甘草苷的平均回收率分別為（95.88±2.30）%、（97.28±3.20）%、（96.12±3.10）%，說明采用高效液相色譜法建立四逆湯供試品溶液的指紋圖譜及測試其中次烏頭堿、6-姜酚和甘草苷的含量是可靠的。

2.10 樣品檢測結(jié)果

2.10.1 四逆湯高效液相指紋圖譜建立 首先通過高效液相指紋圖譜建立四逆湯的對照指紋圖譜，見圖1，并以9號峰為參考峰（甘草苷），因為9號峰的峰面積和分離度都比較穩(wěn)定，辨識度高，因此將其作為本研究的參考峰，進(jìn)而對10個不同批次的四逆湯進(jìn)行指紋圖譜相似度分析，結(jié)果顯示10個不同批次的四逆湯指紋圖譜相似度均大于0.8。見圖2，表4。

2.10.2 四逆湯的含量測定 四逆湯中次烏頭堿、6-姜酚和甘草苷的含量測定中10個不同批次的四逆湯在3個成分中差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），其平均測得量為（12.86±0.18）μg/mL、（62.91±0.78）μg/mL、（349.96±0.26）μg/mL。見表5。

3 討論

中藥指紋圖譜是指某些中藥材或中藥制劑或中藥配方在經(jīng)過適當(dāng)處理后，采用一定的分析手段（比如高效液相色譜法），得到的能夠標(biāo)示該中藥材/中藥制劑/中藥配方的化學(xué)特征的色譜圖或光譜圖[15-16]。因此在藥理學(xué)研究中中藥指紋圖譜是一種綜合的，可量化的藥理學(xué)分析鑒定手段，它是建立在中藥化學(xué)成分系統(tǒng)研究的基礎(chǔ)上，主要用于評價該中藥材/中藥制劑/中藥配方或中藥新藥研究的半成品質(zhì)量的真實性、藥品或藥方的穩(wěn)定性[17-18]。在四逆湯的研究中，多少研究是對組方中單一藥材的單一成分或多成分分析，鮮少對四逆湯進(jìn)行指紋圖譜的建立，因此本研究基于中藥指紋圖譜這一分析手段對四逆湯進(jìn)行指紋圖譜的建立，10批不同批次四逆湯相似度的分析以及主要成分含量的測定。在四逆湯高效液相色譜法指紋圖譜的建立過程中，首先在色譜條件的流動相體系條件摸索中，在選用流動相體系為pH=10的0.1%醋酸銨溶液——乙腈進(jìn)行分析，結(jié)果僅出現(xiàn)較少的色譜峰，且有細(xì)小結(jié)晶析出，導(dǎo)致高效液相色譜柱堵塞;緊接著研究前期又改用流動相體系0.1%甲酸水溶液——乙腈后，盡管這個色譜條件下能獲得較多色譜峰，但是各個色譜峰之間的分離度不好，且無法通過調(diào)整洗脫梯度得到改善;而當(dāng)課題組將流動相體系改設(shè)置為0.1%甲酸水溶液——甲醇的時候，得到了相對平穩(wěn)的基線圖，而且不僅有較多峰形較好的色譜峰數(shù)目，各個色譜峰的分離度良好，辨識度良好，且色譜峰的對稱性也良好。因此本研究即采用0.1%甲酸水溶液——甲醇作為流動相體系進(jìn)行指紋圖譜的建立。研究中通過高效液相色譜法對四逆湯進(jìn)行指紋圖譜的建立合10個不同批次四逆湯相似度分析，結(jié)果顯示10個不同批次的四逆湯指紋圖譜相似度均大于0.8，相似度較高。為了進(jìn)一步研究四逆湯的含量情況，對四逆湯進(jìn)行含量測定，結(jié)果顯示，四逆湯中次烏頭堿、6-姜酚和甘草苷的含量測定中10個不同批次的四逆湯在3個成分中差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，更進(jìn)一步從藥理學(xué)角度證實了四逆湯療效的穩(wěn)定性。

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（2019-04-30收稿 責(zé)任編輯：王楊）