響應面法優(yōu)化魯氏酵母菌與植物乳桿菌復配培養(yǎng)條件

趙家圓，高紹金，李艷青，韓齊

(黑龍江八一農墾大學 食品學院，黑龍江 大慶 163319)

肉制品在發(fā)酵過程中，發(fā)生一系列生物化學變化。原料肉通過有益微生物的作用，如乳酸菌、酵母菌等，可以改善產品質地，提高食品安全性，增強蛋白質的吸收率[1,2]，最終使發(fā)酵肉制品具有高營養(yǎng)、高品質、風味獨特和貯存期較長等優(yōu)點。

酵母菌是一種單細胞真核微生物，在傳統(tǒng)發(fā)酵制品中，魯氏酵母菌廣泛存在于豆醬、醬油等釀造產品中，也是在釀造過程中影響風味品質的重要微生物[3,4]。魯氏酵母菌經降解產生大量糖類營養(yǎng)物質，并伴隨產生高級醇、芳香雜醇類和呋喃酮類化合物，為發(fā)酵肉制品提供增香作用。有研究發(fā)現酵母菌還具有抗氧化活性，能夠保護肝臟[5]。酵母菌中的微量元素還具有抗衰老、抗腫瘤、預防癌癥、提高人體免疫力的作用[6]。酵母菌在生長繁殖過程中產酸能力弱，不具備還原硝酸鹽的能力，能夠降低肉中微生物菌群的硝酸鹽還原能力。

植物乳桿菌是一種廣泛存在于發(fā)酵產品中的可食用微生物，其具有較高的安全性和功能性[7]。目前，植物乳桿菌生理功能的研究已有較多報道，在降低膽固醇、抗氧化、抑制血管緊張素轉換酶活性、抑制食源性病原菌等方面均有較好的能力[8-11]。本試驗所采用的魯氏酵母菌和植物乳桿菌在前期試驗中均表現出較好的發(fā)酵性能，并且對發(fā)酵肉制品的風味改善有一定的積極作用，前期試驗中已經證明了魯氏酵母菌和植物乳桿菌的安全性[12]。因此，本試驗在單因素試驗基礎上進行Box-Behnken試驗設計，以培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間和復配比例為變量，以pH值和菌落總數為響應值，優(yōu)化魯氏酵母菌和植物乳桿菌復配發(fā)酵劑的制備工藝條件，以用于發(fā)酵肉制品的生產。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

魯氏酵母菌(Zygosaccharomycesrouxii，保藏編號CICC32899)：購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)：分離自發(fā)酵風干腸，由東北農業(yè)大學微生物實驗室分離并保藏。

MRS肉湯、MRS瓊脂培養(yǎng)基、YPD液體培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：均購自青島海博生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

SW-CJ-1 FD型超凈工作臺 蘇州安泰空氣技術有限公司；SHP-250型生化培養(yǎng)箱 上海森信實驗儀器有限公司；DELTA-320型pH計 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；LDZX-50 KBS型立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌種活化

將魯氏酵母菌及植物乳桿菌分別接種于YPD液體培養(yǎng)基和MRS液體培養(yǎng)基中。魯氏酵母菌于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中振蕩培養(yǎng)(180 r/min)30 h，以2.0%的接種量傳代2～3次至活力恢復，魯氏酵母菌數至108CFU/mL備用。植物乳桿菌于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h，以2.0%的接種量傳代2～3次至活力恢復，植物乳桿菌菌數至108CFU/mL備用。

1.3.2 拮抗試驗

在無菌條件下，將植物乳桿菌劃線接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(32 ℃，24 h)，將魯氏酵母菌垂直交叉魯氏酵母菌劃線于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(28 ℃，72 h)。觀察垂直交叉處是否有抑菌區(qū)域或菌落萎縮現象的產生。

1.3.3 單因素試驗

培養(yǎng)溫度的選擇：將魯氏酵母菌和植物乳桿菌分別以1%的接種量接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)溫度分別為20，22，25，28，30 ℃，檢測發(fā)酵液的pH值及菌落總數的變化。

培養(yǎng)時間的選擇：將魯氏酵母菌和植物乳桿菌分別以1%的接種量接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，在恒溫培養(yǎng)箱中于22 ℃條件下分別培養(yǎng)12，24，36，48，60 h，檢測發(fā)酵液的pH值及菌落總數的變化。

復配比的選擇：將魯氏酵母菌和植物乳桿菌分別以3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3的比例接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，接種總量為2%。在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(22 ℃，24 h)，檢測發(fā)酵液的pH值及菌落總數的變化。

1.3.4 響應面法優(yōu)化魯氏酵母菌與植物乳桿菌復配的最佳培養(yǎng)條件

在單因素試驗基礎上，采用Design-Expert V8.0.6.1軟件中的Box-Behnken試驗設計，以培養(yǎng)溫度(A)、培養(yǎng)時間(B)和復配比(C)為變量，以pH值(Y1)和菌落總數(Y2)分別為響應值進行三因素三水平的響應面設計試驗，并進行回歸分析及顯著性檢驗，最終分析確定魯氏酵母菌與植物乳桿菌復配的最佳培養(yǎng)條件。試驗因素與水平設計見表1。

表1 響應面試驗因素水平

1.3.5 pH值的測定

1.3.6 菌落總數的測定

根據GB 4789.2-2016菌落總數測定方法，取1 mL發(fā)酵液加入9 mL無菌生理鹽水中進行連續(xù)梯度稀釋，選取適宜的3個梯度進行計數，采用營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基進行平板涂布，待培養(yǎng)基凝固后于恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)48 h后計算菌落總數。

1.4 數據統(tǒng)計與分析

所有試驗重復3次，每組3個平行，數據均表示成Mean±SD，采用Design-Expert V8.0.6.1軟件進行響應面分析，回歸方程方差分析顯著性檢驗。采用Statistix 8.0軟件對試驗數據進行差異顯著性分析(P<0.05)，采用Sigmaplot 12.5軟件進行繪圖。

2 結果分析

2.1 拮抗試驗

圖1 魯氏酵母菌與植物乳桿菌的拮抗試驗

本試驗所采用的植物乳桿菌分離自傳統(tǒng)發(fā)酵風干腸，魯氏酵母菌在前期試驗結果中表現出了良好的呈香作用，二者的添加有助于改善發(fā)酵肉制品的品質，促進風味物質的形成。在前期試驗中對植物乳桿菌及魯氏酵母菌的安全性能及發(fā)酵性能進行了檢驗，結果表明二者安全性較高，且具有良好的發(fā)酵性能，可以應用于發(fā)酵肉制品的生產中。將兩種不同的微生物發(fā)酵劑復配用于發(fā)酵肉制品生產的前提使二者能夠共存，本研究對魯氏酵母菌及植物乳桿菌進行了拮抗試驗。由圖1可知，在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基表面，魯氏酵母菌及植物乳桿菌菌落生長良好，交叉處沒有明顯的抑制現象或菌落萎縮，說明所用魯氏酵母菌與植物乳桿菌間無拮抗作用，可以用于后期復配發(fā)酵試驗。

2.2 單因素試驗結果

2.2.1 培養(yǎng)溫度的影響

將魯氏酵母菌和植物乳桿菌分別以1%的接種量接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，分別于20，22，25，28，30 ℃條件下恒溫培養(yǎng)24 h，檢測培養(yǎng)終點發(fā)酵液的pH值及菌落總數。由圖2可知，發(fā)酵液pH值呈先降低后升高的趨勢，菌落總數呈先升高后降低的趨勢。在22 ℃培養(yǎng)溫度下，發(fā)酵液pH值最低，這是因為L.plantarum在培養(yǎng)過程中生長繁殖生成乳酸等有機酸導致的[13]，而菌落總數最高，說明22 ℃條件下Z.rouxii和L.plantarum的生長狀態(tài)良好，且L.plantarum的產酸能力并沒有受到限制，較低的pH值有助于促進發(fā)酵肉制品的成熟，抑制有害微生物的生長。隨著培養(yǎng)溫度升高至25 ℃，發(fā)酵液pH值升高，菌落總數降低，這可能是由于培養(yǎng)溫度接近Z.rouxii的最適生長溫度(28 ℃)，Z.rouxii開始快速生長繁殖從而導致發(fā)酵液pH值升高。當培養(yǎng)溫度升高至30 ℃時，pH值快速升高，菌落總數趨于平衡，這可能是由于前期Z.rouxii的大量生長繁殖抑制了L.plantarum的生長。因此，當培養(yǎng)溫度在20～25 ℃范圍內，Z.rouxii和L.plantarum的生長繁殖不受到抑制，確定Z.rouxii和L.plantarum復配發(fā)酵液的最優(yōu)培養(yǎng)溫度為22 ℃。

2.2.2 培養(yǎng)時間的影響

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圖3 培養(yǎng)時間對發(fā)酵液pH值及菌落總數的影響

將魯氏酵母菌和植物乳桿菌分別以1%的接種量接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，于22 ℃條件下分別恒溫培養(yǎng)12，24，36，48，60 h，檢測培養(yǎng)終點發(fā)酵液的pH值及菌落總數。由圖3可知，當培養(yǎng)時間在12～24 h范圍內，pH值輕微下降，菌落總數升高，這可能是由于L.plantarum生長繁殖產生有機酸導致的，并且Z.rouxii也具有較好的生長狀態(tài)。當培養(yǎng)至36 h時，pH值快速升高，而菌落總數快速降低，說明Z.rouxii的生長繁殖速度超過了L.plantarum，開始抑制L.plantarum的生長繁殖。當培養(yǎng)至60 h時，pH值和菌落總數均呈升高趨勢，這可能是由于此時L.plantarum的生長繁殖已經進入了衰亡期，而Z.rouxii的生長繁殖尚未結束成為優(yōu)勢菌群導致的。因此，24 h為Z.rouxii和L.plantarum的最適培養(yǎng)時間。

2.2.3 復配比例的影響

圖4 復配比例對發(fā)酵液的pH值及菌落總數的影響

將Z.rouxii和L.plantarum分別以3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3的比例接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，接種總量為1%，22 ℃條件下恒溫培養(yǎng)24 h，檢測培養(yǎng)終點發(fā)酵液的pH值及菌落總數的變化。由圖4可知，當Z.rouxii和L.plantarum的復配比例由3∶1降低至2∶1時，發(fā)酵液的pH值升高，但菌落總數增加并不顯著(P>0.05)，說明Z.rouxii的生長繁殖情況優(yōu)于L.plantarum，Z.rouxii是優(yōu)勢菌群。當Z.rouxii和L.plantarum的復配比例為1∶1時，pH值顯著降低(P<0.05)，菌落總數輕微升高，說明當Z.rouxii和L.plantarum復配比例為1∶1時，二者均能穩(wěn)定生長，無抑制作用。當Z.rouxii和L.plantarum的復配比例變至1∶2和1∶3時，pH值顯著降低(P<0.05)，菌落總數先降低后升高，這可能是由于L.plantarum的添加比例上升后大量生成有機酸造成pH值降低，從而抑制了Z.rouxii的生長，菌落總數降低。繼續(xù)增加L.plantarum的添加比例后，L.plantarum成為優(yōu)勢菌群，開始快速生長繁殖，菌落總數增加。最終確定Z.rouxii和L.plantarum的最優(yōu)復配比例為1∶1。

2.3 以pH值為響應值的響應面試驗結果

2.3.1 響應面回歸模型的建立與分析

基于單因素試驗結果，以培養(yǎng)溫度(A)、培養(yǎng)時間(B)和復配比例(C)為變量，根據Box-Behnken試驗原理，以發(fā)酵液pH值為響應值，進行二次多項回歸方程擬合及分析。試驗設計及結果見表2。

表2 響應面試驗設計及結果

續(xù) 表

對試驗數據進行多項式擬合回歸，得二次多元回歸方程：Y1=7.09-0.11A-0.064B+0.029C-0.038AB+0.028AC-0.17BC+0.048A2-0.08B2-0.11C2。

對模型進行方差分析和顯著性檢驗，分析回歸方程的擬合度，結果見表3。

表3 回歸方程方差分析表

模型的P<0.0001，說明擬合所得二次多元回歸方程達到了極顯著水平，并且方程的擬合程度較好，失擬項P>0.05，不顯著，可以準確地分析和預測培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間和復配比例等因素與發(fā)酵液pH值間的關系。模型R2=0.9905，說明該模型擬合程度較好，可以利用該模型分析和預測Z.rouxii和L.plantarum的復配條件。所得二次多元回歸方程一次項A，B，交互項BC和二次項C2對發(fā)酵液pH值的影響極顯著，一次項C，交互項AB、AC，二次項A2、B2對發(fā)酵液pH值的影響顯著。由F值可知各因素對發(fā)酵液pH值影響的大小順序為：培養(yǎng)溫度(A)>培養(yǎng)時間(B)>復配比例(C)。

2.3.2 響應面分析與優(yōu)化

根據回歸模型，對培養(yǎng)溫度(A)、培養(yǎng)時間(B)和復配比例(C)3個因素兩兩對發(fā)酵液pH值作響應面圖和等高線圖，見圖5。

圖5 不同因素交互作用對發(fā)酵液pH值的影響

由圖5可知，不同因素間交互作用對發(fā)酵液pH值的影響可以通過響應面的變化及等高線的密集程度直觀地反映出來，當響應面圖呈馬鞍或橢圓形時，說明兩因素的交互作用對響應值影響顯著[14,15]。培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間和復配比例3個因素兩兩對發(fā)酵液pH值影響所得響應面圖均為馬鞍形，說明3個因素兩兩交互作用顯著。根據等高線的密集程度，培養(yǎng)溫度對發(fā)酵液pH值影響的等高線較密集，說明培養(yǎng)溫度的影響更為顯著，與回歸方程方差分析結果基本一致。

2.4 以菌落總數為響應值的響應面試驗結果

2.4.1 響應面回歸模型的建立與分析

基于單因素試驗結果，以培養(yǎng)溫度(A)、培養(yǎng)時間(B)和復配比例(C)為變量，根據Box-Behnken試驗原理，以發(fā)酵液菌落總數為響應值，進行二次多項回歸方程擬合及分析。試驗設計及結果見表4。

表4 響應面試驗設計及結果

續(xù) 表

對試驗數據進行多項式擬合回歸，得二次多元回歸方程：Y2=11.37-0.068A-0.013B-0.014C-0.019AB-0.028AC-0.084BC-0.048A2-0.047B2-0.066C2。

對模型進行方差分析和顯著性檢驗，分析回歸方程的擬合度，結果見表5。

表5 回歸方程方差分析表

模型的P<0.0001，說明擬合所得二次多元回歸方程達到了極顯著水平，并且方程的擬合程度較好，失擬項P>0.05，不顯著，可以準確地分析和預測培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間和復配比例等因素與發(fā)酵液菌落總數間的關系。模型R2=0.9865，說明該模型擬合程度較好，可以利用該模型分析和預測Z.rouxii和L.plantarum的復配條件。所得二次多元回歸方程一次項A，交互項BC和二次項C2對發(fā)酵液菌落總數的影響極顯著，一次項B，C，交互項AB、AC，二次項A2、B2對發(fā)酵液菌落總數的影響顯著。由F值可知各因素對發(fā)酵液菌落總數影響的大小順序為：培養(yǎng)溫度(A)>復配比例(C)>培養(yǎng)時間(B)。

2.4.2 響應面回歸模型的建立與分析

根據回歸模型，對培養(yǎng)溫度(A)、培養(yǎng)時間(B)和復配比例(C)3個因素兩兩對發(fā)酵液菌落總數作響應面圖和等高線圖，見圖6。

圖6 不同因素交互作用對發(fā)酵液菌落總數的影響

由圖6可知，不同因素間交互作用對發(fā)酵液菌落總數的影響可以通過響應面的變化及等高線的密集程度直觀地反映出來。培養(yǎng)溫度與培養(yǎng)時間、培養(yǎng)溫度與復配比例的響應面圖為馬鞍形，培養(yǎng)時間與復配比例的響應面圖接近橢圓形，說明3個因素兩兩交互作用顯著。

2.5 回歸模型的驗證結果

本研究選取發(fā)酵液pH值和菌落總數作為響應值優(yōu)化Z.rouxii和L.plantarum的復配條件，響應面分析結果也表明培養(yǎng)時間、培養(yǎng)溫度和復配比例均對發(fā)酵液pH值和菌落總數具有顯著影響，可以通過pH值和菌落總數的變化判斷Z.rouxii和L.plantarum間的生長情況。但在實際培養(yǎng)過程中不能僅以pH值作為Z.rouxii和L.plantarum生長情況的判斷依據，必須與菌落總數指標綜合考慮。因此，回歸模型的驗證選取菌落總數作為最優(yōu)復配條件的判斷依據，最優(yōu)復配條件為培養(yǎng)溫度20.71 ℃，培養(yǎng)時間22.99 h，Z.rouxii和L.plantarum的復配比值為1.32，此時模型預測發(fā)酵液的菌落總數為11.39 lg CFU/mL。對優(yōu)化結果進行驗證，實際結果為10.72 lg CFU/mL，與預測值擬合度達94.12%，表明模型擬合度較好，可以用于優(yōu)化Z.rouxii和L.plantarum的復配條件。

3 結論

本試驗以培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間和復配比例為變量，以pH值及菌落總數為響應值，進行響應面試驗和方差分析，結果顯示:兩組試驗的預測模型均極顯著(P<0.01)，培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間和復配比例間兩兩交互作用均顯著，對發(fā)酵液pH值影響因素排序為培養(yǎng)溫度>培養(yǎng)時間>復配比例，對發(fā)酵液菌落總數影響的大小順序為：培養(yǎng)溫度>復配比例>培養(yǎng)時間。以菌落總數優(yōu)化復配條件為培養(yǎng)溫度20.71 ℃、培養(yǎng)時間22.99 h、Z.rouxii和L.plantarum的復配比值為1.32。對優(yōu)化結果進行驗證，實際結果與預測值擬合度達94.12%。