血府逐瘀湯影響退變椎間盤(pán)髓核組織內(nèi)蛋白水解酶和微血管生成的機(jī)制

郭義 林俊

(萍鄉(xiāng)市中醫(yī)院骨科，江西 萍鄉(xiāng) 337000)

椎間盤(pán)退變?cè)黾恿搜吹娘L(fēng)險(xiǎn)，并在社會(huì)中造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)和健康負(fù)擔(dān)〔1〕。成人椎間盤(pán)主要由三部分組成，包括內(nèi)髓核，外環(huán)狀纖維和終板〔2〕。椎間盤(pán)是無(wú)血管的，這使得損傷后完全修復(fù)。椎間盤(pán)退變有很多原因，其中炎癥起著重要作用〔3〕。白細(xì)胞介素(IL)-1β具有有效的促炎作用，可刺激促炎因子的釋放〔4〕。已經(jīng)證明它在椎間盤(pán)退變期間導(dǎo)致炎癥，基質(zhì)降解，氧化應(yīng)激反應(yīng)和細(xì)胞凋亡〔5〕。因此，由于在椎間盤(pán)退變?cè)缙陔A段的炎癥作用，抗炎治療是優(yōu)先考慮的因素。據(jù)報(bào)道，血府逐瘀湯是治療椎間盤(pán)退變疾病的一種古老的中藥配方，由11種粗草藥組成：桃李、當(dāng)歸、川芎、紅花、芍藥、地黃、枳殼、柴胡、桔梗、牛膝和甘草〔6〕。血府逐瘀湯衍生的化合物，包括羥基紅花黃色素A和苦杏仁苷，已被證明具有控制炎癥反應(yīng)的能力〔7〕。血府逐瘀湯具有血管生成作用，不僅可以增加雞胚絨毛尿囊膜模型中的血管數(shù)量，還可以動(dòng)員骨髓內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPC)，促進(jìn)EPC分化和血管形成〔8，9〕。在炎癥相關(guān)的結(jié)腸癌發(fā)生受到血府逐瘀湯的抑制，表明它可以作為治療結(jié)腸炎相關(guān)結(jié)腸癌的強(qiáng)有力的預(yù)防劑〔10〕。另外，已經(jīng)在兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中證明了血府逐瘀湯抑制基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-1、MMP-3、MMP-13的表達(dá)〔11～13〕。血府逐瘀湯對(duì)IL-1β誘導(dǎo)的髓核的影響尚未進(jìn)行過(guò)研究，因此，本研究旨在探討血府逐瘀湯影響退變椎間盤(pán)髓核組織內(nèi)蛋白水解酶和微血管生成的機(jī)制。

1 材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 體重200～250 g的雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠由實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供。將它們?cè)跇?biāo)準(zhǔn)條件下維持至少1 w，然后禁食12 h，在每次實(shí)驗(yàn)前自由獲取食物和水。

1.2椎間盤(pán)退變模型 根據(jù)體重，用1%戊巴比妥鈉(Sigma Aldrich，St.Louis，MO)以0.4 ml/kg麻醉SD大鼠。對(duì)于椎間盤(pán)退變模型，Co7/Co8或Co8/Co9尾椎椎間盤(pán)之間的椎間盤(pán)間隙首先通過(guò)放射線照相定位。將由手工制作的塞子控制的20號(hào)無(wú)菌針插入距離背側(cè)至腹側(cè)約5 mm處，旋轉(zhuǎn)360°并保持在固定位置30 s，然后移除。

1.3醫(yī)學(xué)倫理學(xué)問(wèn)題 所有外科手術(shù)干預(yù)、治療和術(shù)后動(dòng)物護(hù)理程序均嚴(yán)格按照機(jī)構(gòu)動(dòng)物護(hù)理和使用委員會(huì)的規(guī)定進(jìn)行，并符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和使用指南。

1.4實(shí)驗(yàn)分組 將72只雄性大鼠分為對(duì)照組(無(wú)針刺或治療)；椎間盤(pán)退變組(僅針刺)；血府逐瘀湯組(每周注射含50 μmol/L血府逐瘀湯的PBS進(jìn)行針刺)各24只。由于椎間盤(pán)的無(wú)血管性質(zhì)，使用31-G針的微量注射器進(jìn)行注射。這里使用的體內(nèi)劑量是基于體外實(shí)驗(yàn)，其中我們確定了血府逐瘀湯的無(wú)毒性和有效性。

1.5實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1大鼠髓核細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和治療 將髓核細(xì)胞維持在DMEM/F12(Gibco公司，紐約)和補(bǔ)充有抗生素的10%磷酸鹽緩沖液(PBS)中。使用0.25%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(EDTA)將細(xì)胞以80%～90%的傳導(dǎo)率傳代。在以下所有實(shí)驗(yàn)中，我們對(duì)細(xì)胞使用了2～3次傳代。將細(xì)胞在37℃培養(yǎng)箱中于5%CO2下培養(yǎng)。培養(yǎng)基每2 d更換一次。對(duì)于細(xì)胞活力檢測(cè)，使用不同濃度的血府逐瘀湯處理髓核細(xì)胞 24 h。為了檢測(cè)炎癥的指標(biāo)，用血府逐瘀湯預(yù)處理細(xì)胞2 h，然后用或不用IL-1β處理24 h。

1.5.2血府逐瘀湯制劑 血府逐瘀湯由以下成分組成：當(dāng)歸9 g、地黃9 g、桃李12 g、紅花9 g、枳殼6 g、芍藥6 g、柴胡3 g、甘草6 g、桔梗4.5 g、川芎4.5 g和牛膝9 g。原料購(gòu)自醫(yī)院藥房。每種藥草均由大學(xué)中草藥系的草藥植物學(xué)家認(rèn)證。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法，使用具有上述比例的11種血府逐瘀湯草藥生成血府逐瘀湯的凍干粉末。最后，確定1 g凍干粉末含有5.2 g粗草藥。根據(jù)1 g/ml(W/V)的標(biāo)準(zhǔn)，將其在用蒸餾水分解之前儲(chǔ)存在4℃下使用。

1.5.3總RNA分離和實(shí)時(shí)PCR 使用RNAiso試劑提取總RNA。使用2 μg RNA和PrimeScriptTMRT Master Mix進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。使用SYBR?檢測(cè)cDNA，在StepOnePlus實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)(應(yīng)用生物系統(tǒng)公司，美國(guó))上的Premix Ex Taq TM Ⅱ試劑盒。使用2-ΔΔCt方法分析數(shù)據(jù)。使用的引物序列為MMP-1，上游GCGTATATGGGCTAGAAGCAT、下游GCGTATATACGTTTTAGAGCC；MMP-3，上游TAGCTATGCGTAAATTTCGCT、下游AAATTGCGCGTAGCGCGGCA；MMP-9，上游CATTTAGCTAGAGCTTTGCCG、下游GCTAGATCGCTAGCTAGCTAG；β-actin，上游GTATAAATTCTATGCGCGATA、AAAACGCGCTAGC TCGCCGT。

1.5.4酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA) 在9體積(1∶9，W/V)冰冷的生理鹽水中裂解髓核細(xì)胞。將勻漿物離心15 min(3 000 r/min，4℃)。根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū)(武漢華美生物工程有限公司，中國(guó))，將上清液用于測(cè)量MMP-1、MMP-3和MMP-9的含量。使用Bradford方法測(cè)量組織蛋白質(zhì)濃度。

1.5.5蛋白質(zhì)免疫印跡 通過(guò)蛋白質(zhì)免疫印跡檢測(cè)微血管生成相關(guān)因子〔血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF-β)〕蛋白表達(dá)。在蛋白質(zhì)裂解緩沖液(碧云天生物技術(shù)研究所，上海)中裂解髓核細(xì)胞。通過(guò)二喹啉甲酸(BCA)蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所，上海)測(cè)試蛋白質(zhì)濃度，并將蛋白質(zhì)樣品與5倍加載緩沖液混合。通過(guò)10%或12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠分離等量的蛋白質(zhì)，并轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜(密理博公司，上海)。在5%脫脂牛奶中封閉2 h后，用TBST中的一抗在4℃下探測(cè)印跡過(guò)夜。將印跡與辣根過(guò)氧化物酶綴合的第二抗體(抗兔或抗小鼠；碧云天生物技術(shù)研究所，上海)一起溫育。然后使用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光(密理博公司，上海)顯色印跡，并使用Bio-Rad XRS化學(xué)發(fā)光檢測(cè)系統(tǒng)(伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司，上海)成像。使用Image J軟件定量條帶密度。相對(duì)于GAPDH的水平呈現(xiàn)蛋白質(zhì)表達(dá)量。

1.5.6細(xì)胞活力測(cè)定 根據(jù)方案使用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8(CCK-8；東仁化學(xué)科技有限公司，上海)評(píng)估細(xì)胞活力。將大鼠髓核細(xì)胞以2 000個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種在96孔板中。在血府逐瘀湯處理24 h后，除去每個(gè)孔中的培養(yǎng)基并用含有10% CCK-8溶液的200 μl新鮮培養(yǎng)基替換，并將細(xì)胞在37℃再培養(yǎng)2 h。收集100 μl樣品，并使用酶標(biāo)儀(伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司，上海)在450 nm處在96孔板中測(cè)量活力。

1.5.7磁共振成像(MRI) 在大鼠尾椎針刺模型中在椎間盤(pán)之間每周注射一次血府逐瘀湯。在注射后通過(guò)MRI評(píng)估骶椎椎間盤(pán)。簡(jiǎn)而言之，將大鼠麻醉并置于3.0T MRI掃描儀(Signa Excite，Little Chalfont公司，美國(guó))中的俯臥位。T2加權(quán)切片在矢狀平面中成像。數(shù)據(jù)由3名獨(dú)立的盲法觀察員處理。

1.6統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS11.0軟件進(jìn)行方差分析及LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1蛋白水解酶相關(guān)基因mRNA的表達(dá)水平 與對(duì)照組比較，椎間盤(pán)退變組MMP-1、MMP-3和MMP-9 mRNA的表達(dá)水平明顯增加，而血府逐瘀湯組較椎間盤(pán)退變組MMP-1、MMP-3和MMP-9 mRNA的表達(dá)水平明顯降低(均P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組蛋白水解酶相關(guān)基因mRNA表達(dá)

2.2蛋白水解酶相關(guān)基因蛋白含量檢測(cè) 與對(duì)照組相比，椎間盤(pán)退變組MMP-1、MMP-3和MMP-9含量明顯增加，而血府逐瘀湯組較椎間盤(pán)退變組MMP-1、MMP-3和MMP-9含量明顯降低(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組蛋白水解酶相關(guān)基因蛋白含量

2.3Western印跡檢測(cè)微血管生成相關(guān)因子蛋白表達(dá) 與對(duì)照組相比，椎間盤(pán)退變組VEGF、FGF和TGF蛋白表達(dá)水平明顯降低，而血府逐瘀湯組較椎間盤(pán)退變組VEGF、FGF和TGF蛋白表達(dá)水平明顯增加(P<0.05)。見(jiàn)表3、圖1。

2.4CCK-8檢測(cè)細(xì)胞活力 與對(duì)照組〔(98.23±8.72)%〕相比，椎間盤(pán)退變組細(xì)胞存活率〔(55.44±5.26)%〕明顯降低，而血府逐瘀湯組〔(82.74±7.95)%〕較椎間盤(pán)退變組細(xì)胞存活率明顯增加，3組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=12.148，P=0.003)。

表3 各組微血管生成相關(guān)因子蛋白表達(dá)水平比較

圖1 Western印跡檢測(cè)微血管生成相關(guān)因子蛋白

2.5炎癥相關(guān)因子mRNA表達(dá)水平 與對(duì)照組相比，椎間盤(pán)退變組TNF-α、IL-6和IL-10 mRNA表達(dá)水平明顯增加，而血府逐瘀湯組較椎間盤(pán)退變組TNF-α、IL-6和IL-10 mRNA表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)。見(jiàn)表4。

表4 各組TNF-α、IL-6和IL-10 mRNA表達(dá)

2.6血府逐瘀湯減緩了大鼠尾椎椎體針刺模型中椎間盤(pán)退變的進(jìn)展 MRI結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，椎間盤(pán)退變組MRI信號(hào)強(qiáng)度降低。然而，與椎間盤(pán)退變組相比，血府逐瘀湯組顯示出更高的MRI信號(hào)強(qiáng)度。見(jiàn)圖2。

圖2 各組MRI評(píng)估骶椎椎間盤(pán)

3 討 論

椎間盤(pán)退變是一種流行的疾病，在衰老過(guò)程中自然發(fā)生。其特征在于局部髓核區(qū)域中細(xì)胞外基質(zhì)的逐漸喪失，是成人背部疼痛的最常見(jiàn)原因，具有巨大的社會(huì)經(jīng)濟(jì)意義〔14，15〕。金屬蛋白酶和促炎細(xì)胞因子在該過(guò)程中起重要作用〔16〕。因此，抗炎策略是椎間盤(pán)退變治療的重要組成部分。血府逐瘀湯因其有效的抗炎作用而廣為人知〔17〕。IL-1β被認(rèn)為是一種重要的細(xì)胞因子，它通過(guò)刺激一系列不同介質(zhì)(如趨化因子，細(xì)胞因子和MMPs)的產(chǎn)生而發(fā)揮有效的促炎作用〔18，19〕。已經(jīng)充分描述了IL-1β在由退行性椎間盤(pán)影響的細(xì)胞中升高，這種作用與椎間盤(pán)體內(nèi)平衡的功能失調(diào)密切相關(guān)并導(dǎo)致髓核組織的降解〔20〕。因此，本實(shí)驗(yàn)中使用IL-1β作為促炎劑。

本研究結(jié)果表明，血府逐瘀湯抑制IL-1β誘導(dǎo)的炎癥介質(zhì)(TNF-α、IL-6和IL-10)和基質(zhì)降解蛋白酶(MMP-1，MMP-3和MMP-9)。此外，本研究發(fā)現(xiàn)血府逐瘀湯通過(guò)調(diào)節(jié)VEGF、FGF和TGF蛋白表達(dá)，增加微血管生成。體內(nèi)MRI和組織學(xué)結(jié)果還顯示，血府逐瘀湯保護(hù)髓核免受椎間盤(pán)退變的進(jìn)展。因此，血府逐瘀湯可能是治療椎間盤(pán)退變的潛在藥物。

除了體外研究，本研究使用大鼠尾椎針刺模型來(lái)評(píng)估血府逐瘀湯是否可以在體內(nèi)保護(hù)髓核。證據(jù)表明，在椎間盤(pán)退變的發(fā)展中，炎癥加劇了軟骨的退化。本研究結(jié)果表明血府逐瘀湯治療可以減緩椎間盤(pán)退變的進(jìn)展。