鹽度漸變對黃條鰤消化酶和超氧化物歧化酶活力及甲狀腺激素的影響*

史 寶， 柳學(xué)周,2**， 劉永山,2， 張言祥， 高全義，徐永江， 王 濱， 姜 燕，宋雪松

(1.青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點國家實驗室海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過程功能實驗室，中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所， 山東 青島 266071；2.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院， 上海 201306； 3.大連富谷水產(chǎn)有限公司， 遼寧 大連 116400)

鹽度是水生動物生活環(huán)境中重要的理化因子,鹽度的變化會導(dǎo)致魚體產(chǎn)生不同程度的應(yīng)激反應(yīng),引發(fā)機體一系列生理變化進而影響內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定[1]。鹽度通過滲透調(diào)節(jié)影響魚類的新陳代謝等生理活動和各項生理機能[2]。除了生活在等滲環(huán)境中，鹽度對魚類產(chǎn)生的影響首先是對其滲透壓的脅迫。魚類滲透壓的主動調(diào)節(jié)過程需要肝臟和腎臟等器官的參與，需要消耗大量的能量，從而影響魚類消化生理活動。魚類對營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收需要消化酶的參與，酶活力的高低可以反映魚類消化吸收能力[3]，魚類賴以生存水體中的鹽度能夠影響其消化器官中消化酶活力，最終影響魚類對食物的消化吸收[4]。脂肪酶存在于消化系統(tǒng)的各個部分，它主要通過消化分解脂肪為機體運動提供能量；蛋白酶則將蛋白質(zhì)分解為氨基酸；淀粉酶活力的大小與生物的食性有很大的關(guān)系[5-6]。目前國內(nèi)外在鹽度漸變對消化酶活力影響機制方面的研究報道較少，仍需進行進一步探索。在魚類養(yǎng)殖過程中，水體鹽度改變常引起多種生理應(yīng)激反應(yīng)。鹽度變化引起的魚體應(yīng)激反應(yīng)與自由基(O2-)的過量生成有關(guān)，過多的O2-會影響魚類正常生長[7]，SOD是魚類體內(nèi)重要的抗氧化酶，SOD可清除O2-后產(chǎn)生H2O2，通過清除過多的O2-保護細胞免受氧化損傷[8]。鹽度變化引起的生理應(yīng)激反應(yīng)又受到內(nèi)分泌激素的介導(dǎo)；其中T4是魚類適應(yīng)淡水生活的重要內(nèi)分泌激素，參與滲透壓調(diào)節(jié)，能夠促進細胞的呼吸作用，使機體耗氧量和代謝率增加，對魚類適應(yīng)鹽度起積極作用[9]。通過研究鹽度漸變對魚類各種生長及生理生化指標(biāo)的影響及魚類的響應(yīng)，可以為魚類在合適的水域進行大規(guī)模人工養(yǎng)殖提供理論依據(jù)。

黃條鰤(Seriolaaureovittata)屬鱸形目(Perciformes)鲹科(Carangidae)鰤屬(Seriola)，世界范圍內(nèi)鰤屬魚類共有9種，根據(jù)地域性差異可分為3個形態(tài)相似的地理亞種：亞洲種群、加利福尼亞種群和南部(南非—澳洲)種群[10]。黃條鰤適宜于深遠?？癸L(fēng)浪網(wǎng)箱養(yǎng)殖和陸基工廠化養(yǎng)殖，具有生長速度較快、肉質(zhì)鮮嫩、養(yǎng)殖產(chǎn)量高等優(yōu)點，是支持全球溫帶地區(qū)商業(yè)漁業(yè)的重要品種[11-14]。近年來，黃條鰤繁育及養(yǎng)殖技術(shù)研究在我國剛剛起步，有關(guān)黃條鰤養(yǎng)殖生物學(xué)方面的研究報道很少，尚未見黃條鰤環(huán)境適應(yīng)機理方面的研究報道。本研究以黃條鰤幼魚為材料，通過檢測和分析鹽度向高或向低漸變條件下的脂肪酶、蛋白酶和淀粉酶活性、SOD活性、T4濃度等指標(biāo)的變化，以研究這些因子在黃條鰤對高滲環(huán)境和低滲環(huán)境適應(yīng)過程的可能作用，為深入認(rèn)識黃條鰤對環(huán)境的應(yīng)激和適應(yīng)機制提供基礎(chǔ)資料。

1 材料和方法

1.1 實驗材料與設(shè)計

實驗用魚為2013年在黃海北部捕獲的黃條鰤魚苗，經(jīng)海上網(wǎng)箱馴化養(yǎng)殖和室內(nèi)工廠化越冬培育成熟，2017年產(chǎn)卵后人工培育出的體長19～23 cm，體重80～120 g黃條鰤幼魚，用于本實驗。實驗在大連富谷水產(chǎn)有限公司進行，苗種養(yǎng)殖期間海水的水溫為20～27 ℃、鹽度29，每天投喂鮮雜魚3～4次，投喂量為魚體重的3%～5%。實驗開始前所有暫養(yǎng)的實驗用魚停食24 h，實驗期間不投餌。各實驗組的鹽度調(diào)節(jié)：低鹽度組采用自然海水(鹽度29)加自來水調(diào)節(jié)，使用的自來水用1 000 L塑料桶作為自來水曝氣池，連續(xù)充氣、曝氣 24 h 以上使用；高鹽度實驗組的海水使用自然海水加海水晶進行人工配置后使用。

水溫高于17.5℃，S(‰)=1 305(比重-1)+(t-17.5)×0.3。

(黑色箭頭代表取樣時間點。0 h時鹽度為29；24 h時鹽度35；36 h時鹽度為20；60 h時鹽度為15；84 h時鹽度為10；108 h時鹽度為 5。The black arrows represent the sampling time point.The salinity at 0 hours is 29.The salinity at 24 hours is 35.The salinity at 36 hours is 20.The salinity at 60 hours is 15. The salinity at 84 hours is 10.The salinity at 108 hours is 5.)

圖1 鹽度漸變示意圖

Fig.1 Schematic diagram of the gradual salinity change

1.2 取樣過程

在鹽度逐漸過渡到鹽度35，20，15，10和5，并在此鹽度點經(jīng)12 h處理后，隨機選取3條實驗魚取樣。用麻醉劑將魚麻醉，用無菌1 mL注射器快速從尾部取血，直接置于多個1.5 mL無菌離心管中，在冰水混合液中靜置30 min 后，4 ℃、5 000 r/min 離心10 min，取上清即為血清。分離出的血清用來檢測SOD，T4。用液氮保存胃、腸、肝臟、幽門盲囊，測定消化酶包括脂肪酶、蛋白酶、淀粉酶，分析鹽度變化對消化酶活力的影響。

1.3 檢測過程

使用脂肪酶測試盒(A054，50T/48樣，南京建成生物工程研究所)測定了黃條鰤胃、腸、肝臟和幽門盲囊的脂肪酶含量；使用蛋白酶測試盒(A080，50T/24樣，南京建成生物工程研究所)測定了黃條鰤胃、腸、肝臟和幽門盲囊的蛋白酶含量。使用碘-淀粉比色法測定了黃條鰤胃、腸、肝臟和幽門盲囊的淀粉酶含量(C016，南京建成生物工程研究所淀粉酶測試盒)。使用超氧化物歧化酶(SOD)測試盒(A001-1，南京建成生物工程研究所)測定了血清總SOD含量；使用Fish T4 ELISA Kit(96T，CK-E90004F)測定了血清中甲狀腺激素(T4)的含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS 17.0軟件的單因素方差分析(One-way ANOVA)和Duncan’s多重比較分析。P>0.05為差異顯著。做圖數(shù)據(jù)均表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)。

2 結(jié)果與分析

2.1 脂肪酶活性變化

在鹽度逐漸降低的過程中，黃條鰤胃脂肪酶活性總體呈降低的趨勢，鹽度從29降低到20時，胃脂肪酶活性顯著降低(P<0.05)，降低到15時則變化不顯著(P>0.05)，之后，隨著鹽度進一步降低，每個鹽度點胃脂肪酶活性均顯著降低(P<0.05)；在鹽度從29逐漸升高的過程中，胃脂肪酶活性也顯著降低(P<0.05)(見圖2)。腸脂肪酶活性隨著鹽度的逐漸降低，每個鹽度點均顯著降低(P<0.05)；鹽度從29升高到35時，腸脂肪酶活性也顯著降低(P<0.05)(見圖2)。肝臟脂肪酶活性隨著鹽度的降低呈降低的趨勢，鹽度從29降低到15的過程中，肝臟脂肪酶活性顯著降低(P<0.05)，降低到10時則變化不顯著(P>0.05)，鹽度進一步降低到5時又顯著降低(P<0.05)；鹽度從29升高到35時，肝臟脂肪酶活性變化不顯著(P>0.05)(見圖2)。幽門盲囊脂肪酶活性在鹽度降低過程中的變化與肝臟脂肪酶活性變化呈現(xiàn)相似的趨勢；而從鹽度29升高到35時幽門盲囊脂肪酶活性則顯著降低(P<0.05)(見圖2)?？傮w來看，隨著鹽度的升高和降低，各組織脂肪酶活性均呈降低的趨勢；且在不同鹽度漸變點時腸脂肪酶活性均為最高(見圖2)。

圖 2 鹽度漸變過程中胃、腸、肝臟和幽門盲囊的脂肪酶活性變化

Fig.2 Lipase activity vary among stomach, intestinal, liver and pyloric caecum during the gradual salinity change

2.2 蛋白酶活性變化

黃條鰤胃蛋白酶隨著鹽度的降低呈先升高后降低的趨勢，鹽度從29降低到20時，胃蛋白酶活性顯著上升達到峰值(P<0.05)；之后，隨著鹽度的逐漸降低，15，10，5鹽度點的胃蛋白酶活性均顯著降低(P<0.05)，其中鹽度5漸變點胃蛋白酶活性迅速降低，顯著低于其他鹽度漸變點(P<0.05)；在鹽度從29逐漸升高的過程中，胃蛋白酶活性顯著降低(P<0.05)(見圖3)。在鹽度逐漸降低的過程中，黃條鰤腸蛋白酶活性隨著鹽度的降低而降低，鹽度從29降低到15的過程中，腸蛋白酶活性顯著降低(P<0.05)，繼續(xù)降低到10時則變化不顯著(P>0.05)，鹽度進一步降低到5時又顯著降低(P<0.05)；在鹽度從29逐漸升高的過程中，腸蛋白酶活性也顯著降低(P<0.05)，且降低幅度很大(見圖3)。肝臟蛋白酶活性在鹽度從29降低的過程中呈現(xiàn)降低的趨勢，鹽度從29降低到15的過程中，肝臟蛋白酶活性顯著降低(P<0.05)，之后，隨著鹽度的進一步降低，肝臟蛋白酶活性趨于穩(wěn)定，雖有小幅波動，但無顯著變化(P>0.05)；鹽度從29升高到35時，肝臟蛋白酶活性也顯著降低(見圖3)。在鹽度逐漸降低的過程中，黃條鰤幽門盲囊蛋白酶活性總體呈降低的趨勢，鹽度從29降低到20時，幽門盲囊蛋白酶活性顯著降低(P<0.05)，降低到15時則變化不顯著(P>0.05)，之后，隨著鹽度進一步降低，每個鹽度點幽門盲囊蛋白酶活性均顯著降低(P<0.05)；在鹽度從29逐漸升高的過程中，幽門盲囊蛋白酶活性則顯著升高(P<0.05)(見圖3)。

圖3 鹽度漸變過程中胃、腸、肝臟和幽門盲囊的蛋白酶活性變化

Fig.3 Protease activity vary among stomach, intestinal, liver and pyloric caecum during the gradual salinity change

2.3 淀粉酶活性變化

在鹽度逐漸降低的過程中，黃條鰤胃淀粉酶活性隨鹽度降低而呈降低的趨勢，鹽度從29降低到20時，胃淀粉酶活性顯著降低(P<0.05)，降低到15時則變化不顯著(P>0.05)，之后，隨著鹽度進一步降低，鹽度點10和5胃淀粉酶活性均顯著降低(P<0.05)；在鹽度從29逐漸升高的過程中，胃淀粉酶活性顯著降低(P<0.05)(見圖4)。腸淀粉酶活性在鹽度從29降低的過程中逐漸降低，鹽度降低到20時，腸淀粉酶活性顯著降低(P<0.05)，且降低幅度很大，降低到15時則變化不顯著(P>0.05)，之后，隨著鹽度降低腸淀粉酶活性降低幅度變小，但鹽度點10和5腸淀粉酶活性變化仍顯著(P<0.05)；在鹽度從29升高到35時，腸淀粉酶活性顯著降低(P<0.05)(見圖4)。黃條鰤肝臟淀粉酶活性在各鹽度漸變點均顯著低于胃、腸和幽門盲囊淀粉酶活性；在鹽度從29降低的過程中，肝臟淀粉酶活性逐漸降低，整體變化幅度較小，鹽度降到15時，各鹽度點肝臟淀粉酶活性均顯著降低(P<0.05)，繼續(xù)降低到10時則變化不顯著(P>0.05)，鹽度進一步降低到5時又顯著降低(P<0.05)；在鹽度從29逐漸升高的過程中，肝臟淀粉酶活性也顯著降低(P<0.05)(見圖4)。幽門盲囊淀粉酶活性隨著鹽度的降低呈降低的趨勢，鹽度從29降低到15的過程中，幽門盲囊淀粉酶活性顯著降低(P<0.05)，降低到10時則變化不顯著(P>0.05)，鹽度進一步降低到5時幽門盲囊淀粉酶活性又顯著降低(P<0.05)；鹽度從29升高到35時，肝臟脂肪酶活性變化不顯著(P>0.05)(見圖4)。

圖4 鹽度漸變過程中胃、腸、肝臟和幽門盲囊的淀粉酶活性變化

Fig.4 Amylase activity vary among stomach, intestinal, liver and pyloric caecum during the gradual salinity change

2.4 超氧化物歧化酶(SOD)活性變化

如圖5所示，黃條鰤血清中SOD活性隨著鹽度的降低總體呈先升高后降低的趨勢，鹽度漸變到20時，血清中SOD活性變化不顯著(P>0.05)，之后，隨著鹽度的逐漸降低，鹽度15和10漸變點血清中SOD活性升高，顯著高于其他鹽度漸變點(P<0.05)；隨著鹽度的進一步降低，鹽度5漸變點血清中SOD活性迅速下降，顯著低于其他鹽度漸變點(P<0.05)。在鹽度從29逐漸升高的過程中，血清中SOD活性沒有出現(xiàn)顯著性變化(P>0.05)。

2.5 甲狀腺激素(T4)濃度變化

鹽度從29逐漸向低漸變的過程中，甲狀腺素濃度呈逐漸升高的趨勢；鹽度從29降低到鹽度20時甲狀腺激素濃度變化不顯著(P>0.05)，而鹽度10和5漸變點甲狀腺激素則顯著高于其他鹽度漸變點(P<0.05)。在鹽度從29向高漸變的過程中，甲狀腺激素濃度也隨之升高，鹽度35與鹽度29漸變點甲狀腺激素濃度有顯著性差異(P<0.05)。從總體趨勢看，鹽度降低或升高，甲狀腺激素濃度均升高；鹽度5時甲狀腺激素濃度最高(見圖6)。

圖5 鹽度漸變過程中血清的SOD活性變化

Fig.5 SOD activity vary among serum during
the gradual salinity change

3 討論

3.1 鹽度漸變對黃條鰤幼魚消化酶活力的影響

消化酶是由消化系統(tǒng)分泌的具有消化作用的酶類，不同消化酶在不同消化器官中分布不均[15]。脂肪酶存在于消化系統(tǒng)的各個部分，它主要通過消化分解脂肪為魚類運動提供能量。對日本蟳(Scyllaserrata)的研究表明鹽度升高可以刺激胃、腸和幽門盲囊脂肪酶活性升高，但隨著鹽度進一步升高脂肪酶活性受到抑制[16]。在本研究中超過鹽度29漸變點后黃條鰤胃、腸、肝臟和幽門盲囊的脂肪酶活性降低，可能是因為鹽度過高抑制了脂肪酶活力。有研究表明鹽度從25降低到15過程中斜帶石斑魚(Epinepheluscoiodies)的胃、腸和幽門盲囊脂肪酶活性下降[17]。與斜帶石斑魚研究結(jié)果相似，在本研究中從鹽度29漸變點降低時黃條鰤脂肪酶活力也隨之降低，可能是由于鹽度降低后，鹽度對脂肪酶的激活作用較弱，從而導(dǎo)致脂肪酶活力降低。

圖6 鹽度漸變過程中血清的T4含量變化

Fig.6 T4 content vary among serum during the
gradual salinity change

在史氏鱘(Acipenserschrenckii)、點籃子魚(Siganusguttatas)和奧尼羅非魚(O.niloticus♀×O.aureus♂)胃、腸、肝臟和幽門盲囊蛋白酶與鹽度變化關(guān)系的研究結(jié)果顯示隨鹽度升高蛋白酶活力均減小了[18-20]。本研究中超過鹽度29的高鹽度漸變點時，黃條鰤腸蛋白酶活力隨鹽度的升高而減小。海水中部分無機離子對蛋白酶具有激活或抑制作用，無機離子直接作用于蛋白酶是鹽度影響魚體內(nèi)蛋白酶活力的主要原因[21]，結(jié)合本研究結(jié)果分析，可能是因為在高鹽度環(huán)境中，某些無機離子進入黃條鰤體內(nèi)達到了一定的濃度進而抑制了蛋白酶的活性。在低鹽度漸變點黃條鰤胃、腸、肝臟和幽門盲囊蛋白酶活性均隨鹽度升高而增加了，可能由于鹽度降低，對蛋白酶有激活作用的離子含量也相對減少，影響了蛋白酶的活性。

消化器官中淀粉酶活力的大小與生物的食性有很大的關(guān)系，一般雜食性或草食性動物的淀粉酶活性較高[15]。影響魚類淀粉酶活力的因素還有很多，包括溫度、pH及離子濃度等[22]。本研究中鹽度對黃條鰤淀粉酶活力影響顯著，在高鹽度漸變點胃和肝臟淀粉酶活性隨鹽度升高而減小，表明隨鹽度增加黃條鰤對淀粉類物質(zhì)的消化能力減弱。在高鹽度時，黃條鰤淀粉酶活性較低，這可能是因為黃條鰤滲透調(diào)節(jié)時血漿中Cl-濃度升高[23]，對淀粉酶的活性產(chǎn)生抑制作用；這與星洲紅魚(Oreochromissp. red tilapia)的研究結(jié)果一致[24]。有研究表明淀粉酶原需要在腸道中經(jīng)過腸激活酶的進一步激活才有酶活力[25]，黃條鰤肝臟淀粉酶活性在每個鹽度漸變點相比胃、腸和幽門盲囊都是最弱的，可能是由于肝臟主要分泌淀粉酶原，所以淀粉酶在肝臟中并不活躍。

3.2 鹽度漸變對黃條鰤幼魚超氧化物歧化酶(SOD)活性的影響

SOD作為重要的抗氧化防御系統(tǒng)酶，能夠有效轉(zhuǎn)化環(huán)境鹽度變化時魚體產(chǎn)生的大量活性氧自由基從而保護機體細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定[26]，因此SOD活性變化可以準(zhǔn)確反映機體內(nèi)自由基的代謝情況[27]。有研究結(jié)果表明適當(dāng)降低水體鹽度可以激活和增強銀鯧(Pampusargenteus)幼魚肝臟SOD活性以消除機體中過多的活性氧自由基[28]；黑鯛(Acanthopagrusschlegeli)從鹽度30轉(zhuǎn)移到鹽度10中SOD活性也顯著升高[29]。本研究結(jié)果與上述兩個研究結(jié)果類似，當(dāng)鹽度降低到15和10漸變點時黃條鰤血清SOD活性顯著升高，預(yù)示著黃條鰤產(chǎn)生了大量的自由基有待清除。當(dāng)魚體受重度逆境脅迫時，魚體SOD活性被抑制[30]。本研究中鹽度5時黃條鰤SOD活性顯著低于其他漸變點，說明鹽度5對黃條鰤來說屬于重度脅迫，難以較快適應(yīng)。而鹽度20和35漸變點黃條鰤血清SOD活性與鹽度29時差異不明顯，表明黃條鰤受到較輕脅迫，說明黃條鰤在一定鹽度范圍內(nèi)，自由基的產(chǎn)生與機體抗氧化防御過程處于動態(tài)平衡中。因此血清SOD變化可以作為黃條鰤養(yǎng)殖生產(chǎn)中對鹽度變化的應(yīng)激反應(yīng)指標(biāo)。

3.3 鹽度漸變對黃條鰤幼魚甲狀腺激素(T4)濃度的影響

多種激素控制魚體的器官參與滲透調(diào)節(jié)，維持魚體在不同鹽度環(huán)境下的體內(nèi)水份和礦物質(zhì)的平衡；影響和干擾魚類體內(nèi)離子平衡狀態(tài)的外界條件，都會相應(yīng)的引起參與滲透調(diào)節(jié)的激素水平的改變。甲狀腺激素是魚類下丘腦-垂體-甲狀腺軸主要分泌的激素，具有廣泛的生理學(xué)功能；甲狀腺激素協(xié)同皮質(zhì)醇激素、生長激素等在調(diào)控魚類發(fā)育、生長、新陳代謝和滲透調(diào)節(jié)方面具有重要的作用[31]。T4在鹽度發(fā)生變化時能夠作用于肝臟、腎臟等器官，使肝糖分解血糖升高；促進細胞的呼吸作用，使機體耗氧量和代謝率增加[32]。Rahim等對草魚(Ctenophayngodonidella)的研究結(jié)果表明鹽度12，8和4組T4濃度顯著高于淡水組T4濃度[31]。與之類似，本研究中鹽度35時黃條鰤血清T4濃度顯著高于鹽度29血清T4濃度。在本研究中隨著鹽度的升高和降低，黃條鰤血清T4濃度均升高，這可能是鹽度變化刺激了魚體甲狀腺的活動，增加了血清中T4的水平；這也可能是在較高鹽度條件下黃條鰤鰓絲Na+-K+-ATPase酶活力相應(yīng)升高，通過T4水平升高以適應(yīng)魚體在鹽度變化過程中進行滲透調(diào)節(jié)時對能量的需要。因此黃條鰤通過血清中T4的變化對環(huán)境鹽度變化進行自主適應(yīng)， T4對黃條鰤滲透壓調(diào)節(jié)起到一定作用，有利于維持魚體的正常存活。

4 結(jié)語

本研究采用實驗生態(tài)學(xué)的方法，分析了鹽度漸變對黃條鰤消化生理、抗氧化水平和T4濃度變化的影響，探討了黃條鰤對鹽度漸變的應(yīng)激響應(yīng)機制。研究發(fā)現(xiàn)，胃、腸、肝臟和幽門盲囊的脂肪酶活性均在鹽度29漸變點最高；腸和肝臟的蛋白酶活性在鹽度29漸變點達到峰值，而幽門盲囊的蛋白酶活性在鹽度35漸變點最高；胃、腸、肝臟的淀粉酶活性在鹽度29漸變點最高，而幽門盲囊的淀粉酶活性在鹽度35漸變點最高，但與鹽度29漸變點無顯著性差異；3種消化酶活性在4種組織整體變化趨勢是隨著鹽度升高或降低，表現(xiàn)為降低的趨勢。血清中SOD活性和T4濃度整體變化趨勢是隨著鹽度的升高或降低，呈上升的趨勢。本研究中觀察到黃條鰤生存和繁衍的自然海水鹽度29是幼魚存活的適宜鹽度，在略低的鹽度20～29均能較快適應(yīng)，而在較低或者較高鹽度漸變點時消化酶活力和抗應(yīng)激指標(biāo)出現(xiàn)顯著的異常；黃條鰤對外界鹽度變化表現(xiàn)出較強的適應(yīng)性。研究結(jié)果為解析黃條鰤對環(huán)境的應(yīng)激和適應(yīng)機制及商業(yè)養(yǎng)殖開發(fā)提供理論依據(jù)。