尿毒清顆粒對單側(cè)輸尿管梗阻大鼠腎間質(zhì)纖維化及腎功能和轉(zhuǎn)化生長因子-β1表達(dá)的影響

韓宇鵬 孟慶云 楊舒賀 楊松

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154002)

各種慢性腎臟疾病(CKD)中腎臟纖維化(RIF)是進(jìn)展為終末期腎衰竭(ESRD)的一種病理損傷過程，其特征病理變化主要包括腎小管間質(zhì)炎癥和纖維化、腎小管萎縮和擴(kuò)張及腎小球硬化等〔1～4〕。研究顯示，影響CKD預(yù)后中腎小管間質(zhì)損傷嚴(yán)重程度是決定因素〔5～7〕。分析RIF的相關(guān)發(fā)病機(jī)制及研發(fā)抗腎間質(zhì)纖維化的藥物，對于控制CKD具有重要意義。本文研究旨在探討尿毒清顆粒對單側(cè)輸尿管梗阻(UUO)大鼠腎間質(zhì)纖維化及腎功能和轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β1表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1實驗材料 清潔級雄性Wistar大鼠90只，體質(zhì)量(150±10)g，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w，實驗動物每天予以12 h光照，飼養(yǎng)溫度(22±2)℃，相對濕度(55±2)%。動物飼料、墊料、飲用水均已消毒，大鼠來源于佳木斯大學(xué)實驗動物中心。

1.2實驗分組及UUO模型制備 按照隨機(jī)數(shù)字法分為假手術(shù)組、模型組、實驗組各30只。模型組和實驗組行左側(cè)輸尿管結(jié)扎術(shù)，均于無菌條件下進(jìn)行，給予(0.3～0.4)ml/100 g的10%水合氯醛進(jìn)行腹腔內(nèi)注射麻醉，于大鼠背部，左側(cè)肋腰點下0.5 cm左右及脊柱左側(cè)1 cm左右做一1.5～2.0 cm的縱向切口，逐層進(jìn)腹，大鼠腎臟充分暴露。將腎下及部分包膜和腎蒂處包膜用小彎鑷輕輕剝離，將大鼠輸尿管分離出，分別在遠(yuǎn)離腎盂1 cm左右處及緊靠腎盂處應(yīng)用“0”號絲線結(jié)扎輸尿管，并且于兩結(jié)中間將輸尿管剪斷，對大鼠腹腔用慶大霉素生理鹽水沖洗，檢查若無出血和滲漏后將腹膜腔各層及背部皮膚逐層縫合，常規(guī)消毒，覆蓋無菌鋪巾。其中假手術(shù)組手術(shù)除不剪斷及不結(jié)扎輸尿管外，其余操作同模型組和實驗組。

1.3給藥方法 實驗組給予尿毒清顆粒每日2 g/kg灌胃，假手術(shù)組與模型組灌胃等劑量生理鹽水，每日1次，連續(xù)14 d。各組于手術(shù)后第14天處死，留取左側(cè)梗阻腎標(biāo)本。

1.4腎組織病理光鏡檢測 取大鼠左腎組織，應(yīng)用甲醛固定后石蠟包埋切片，將其切成3 μm切片后行蘇木素-伊紅(HE)。HE染色觀察腎小管間質(zhì)細(xì)胞浸潤及病理改變，半定量分析腎臟間質(zhì)纖維化。

1.5腎功能指標(biāo)測定 采集大鼠下腔靜脈血，經(jīng)1 500 r/min離心5 min后取血清，采用全自動生化分析儀，檢測血尿素氮(BUN)和血肌酐(Scr)水平。

1.6血清TGF-β1表達(dá) 取1.5血清標(biāo)本，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗測定血清TGF-β1水平。

1.7腎組織中TGF-β1表達(dá) 所有腎組織標(biāo)本按常規(guī)固定、脫水、透明、石蠟包埋，切片4 μm。將切片脫蠟，熱抗原修復(fù)，分別滴加一抗兔抗大鼠TGF-β1多克隆抗體(1∶120)。4℃孵育過夜,滴加二抗，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，蘇木素復(fù)染細(xì)胞核，每次染色均以磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作陰性對照，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片。采用免疫組織化學(xué)法測定TGF-β1表達(dá)，以胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性，測定TGF-β1陽性面積。

1.8統(tǒng)計學(xué)方法 運用SPSS22.0軟件統(tǒng)計進(jìn)行t、F檢驗。

2 結(jié) 果

2.1各組組織病理表現(xiàn)比較 假手術(shù)組腎組織形態(tài)結(jié)構(gòu)基本正常；模型組第14天時發(fā)生間質(zhì)增寬、間質(zhì)炎細(xì)胞浸潤、腎小管萎縮及RIF表現(xiàn)；實驗組RIF程度明顯減輕。見圖1。

2.2各組腎功能變化比較 模型組和實驗組BUN和Scr表達(dá)、血清及腎臟組織TGF-β1表達(dá)顯著高于假手術(shù)組，且實驗組顯著低于對照組(P<0.05)。見表1。

圖1 各組腎臟組織纖維化表現(xiàn)(HE，×200)

表1 各組腎功能變化、血清及腎臟組織TGF-β1表達(dá)比較

3 討 論

目前已知的腎間質(zhì)纖維化機(jī)制包括：腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化、腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞活化與增殖、細(xì)胞外基質(zhì)轉(zhuǎn)換失平衡、腎組織局部缺氧缺血〔7，8〕。腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化在腎小管間質(zhì)纖維化中扮演重要角色。在腎損傷過程中，多種因子誘導(dǎo)上皮細(xì)胞部分轉(zhuǎn)化為成纖維細(xì)胞，若及時干預(yù)則能恢復(fù)上皮細(xì)胞的完整性，阻斷腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的發(fā)生〔9～11〕。目前，對腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化在腎間質(zhì)纖維化發(fā)生發(fā)展中的重要性仍缺乏全面認(rèn)識。

尿毒清顆粒作為一種中成藥，組成主要包括黃芪、黨參、制何首烏、制大黃、白術(shù)、車前草、茯苓、丹參、川芎、姜半夏等，其中黃芪和黨參具有益氣健脾功效，制何首烏具有益精補(bǔ)腎功效，共奏益腎健脾功效；制大黃具有通腑泄?jié)峁π?，可使?jié)駶嶂坝纱蟊闩懦觯仔g(shù)具有除濕健脾功效，車前草和茯苓具有除濕利尿功效，姜半夏具有降逆止嘔、燥濕何種功效，共奏通腑降濁功效；丹參和川芎具有活血化瘀功效。縱觀全方可奏通腑降濁、活血化瘀和健脾利濕功效?，F(xiàn)代藥理研究表明，尿毒清顆?？梢愿纳苹颊叩牡|(zhì)水平，降低腎組織代謝水平，健脾利濕，活血化瘀，不良反應(yīng)小，達(dá)到較好臨床效果〔12，13〕。程錦繡等〔14〕實驗證實尿毒清顆粒可提高慢性腎衰竭大鼠生存質(zhì)量，降低Scr、BUN水平，其機(jī)制與調(diào)節(jié)TGF-β1通路有關(guān)。此外，劉新輝等〔15〕實驗證實黃芪甲苷可保護(hù)TGF-β1誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化,其機(jī)制可能與增加線粒體生物合成有關(guān)。本研究表明，尿毒清顆?？蓽p輕腎間質(zhì)纖維化；模型組和實驗組BUN和Scr表達(dá)高于假手術(shù)組，且實驗組低于對照組，由此可見尿毒清顆?？筛纳颇I功能。

TGF-β是腎間質(zhì)纖維化過程中最重要的生長因子之一，在腎間質(zhì)纖維化發(fā)生、發(fā)展的多個環(huán)節(jié)起作用〔16〕。TGF-β1是TGF-β家族中的一員，是纖維化的關(guān)鍵因子，可通過促進(jìn)腎臟細(xì)胞肥大、腎臟的免疫調(diào)節(jié)和細(xì)胞外基質(zhì)的生成來介導(dǎo)腎小球硬化〔17，18〕。TGF-β1被認(rèn)為是上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化過程的主要誘導(dǎo)因子。

綜上，尿毒清顆?？蓽p輕UUO大鼠腎間質(zhì)纖維化，改善腎功能及降低TGF-β1表達(dá)。