外源GB 對(duì)鹽脅迫下2 種黃芪種子萌發(fā)及幼苗抗氧化酶的影響

韓多紅，王恩軍，張 勇

（1.河西學(xué)院生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 張掖 734000；2.甘肅省河西走廊特色資源利用省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 張掖 734000）

0 引言

【研究意義】土壤鹽漬化已成為當(dāng)前全球極其重要的農(nóng)業(yè)與環(huán)境問題，全球20%的耕地和33%的灌溉農(nóng)田受到土壤鹽分的影響，加上生產(chǎn)中不合理灌溉和過度施肥等農(nóng)業(yè)措施也進(jìn)一步加劇土壤次生鹽漬化[1]。甜菜堿（Glycinebetaine, GB）屬于季銨型水溶性生物堿，是一種生理抗鹽劑，通過生理調(diào)節(jié)作用減緩由于鹽脅迫對(duì)植物造成的傷害，以達(dá)到提高植物耐鹽性的目的，對(duì)植物維持呼吸作用和光合作用的正常進(jìn)行也具有重要的生理意義[2]。因此，利用外源GB 誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗逆性是提高植物抵御不良環(huán)境的有效方法，對(duì)增強(qiáng)農(nóng)作物的耐鹽性具有重要的意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】研究表明，鹽漬條件下，植物體內(nèi)會(huì)發(fā)生滲透脅迫，導(dǎo)致細(xì)胞氧化損傷和膜系統(tǒng)傷害[3-5]。外源甜菜堿（GB）的添加，可有效調(diào)節(jié)植物光合作用生理過程，促進(jìn)幼苗生長(zhǎng)，緩解低溫造成的氧化損傷，提高植物的抗鹽性[6-9]。目前，對(duì)黃芪的研究大多集中在栽培、藥用成分、藥理作用等方面[10-12]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】在鹽脅迫條件下，外源GB 對(duì)黃芪鹽分調(diào)控效應(yīng)的研究未見報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究以蒙古黃芪和膜莢黃芪為材料，研究在鹽脅迫下其種子萌發(fā)和幼苗抗氧化酶代謝的變化規(guī)律，并分析2 種黃芪耐鹽性的差異性，探討鹽脅迫下外源GB 對(duì)植物的調(diào)控機(jī)制，為黃芪在河西走廊大片鹽堿化土地上的栽培提供依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

黃芪種子由甘肅省張掖市民樂誠(chéng)泰藥業(yè)有限公司黃芪種植基地提供，經(jīng)河西學(xué)院張勇教授鑒定為蒙古黃芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.var.mongholicus（Bge.）Hsiao 和 膜 莢 黃 芪Astraglus membranaceus（Fisch.）Bge.的干燥成熟種子。試驗(yàn)于2019 年5 月在河西學(xué)院生命科學(xué)與工程試驗(yàn)中心進(jìn)行。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 種子萌發(fā)指標(biāo)的測(cè)定 選擇籽粒飽滿的種子用64% H2SO4處理4 min 破除硬實(shí)，清水沖洗30 min后，用2% NaClO 消毒5 min，蒸餾水沖洗干凈。設(shè)置6 個(gè)處理：CK1（蒸餾水）、CK2（100 mmol·L-1NaCl ）、T1（100 mmol·L-1NaCl + 10 mmol·L-1GB）、T2（100 mmol·L-1NaCl+ 20 mmol·L-1GB）、T3（100 mmol·L-1NaCl+ 30 mmol·L-1GB）、T4（100 mmol·L-1NaCl + 40 mmol·L-1GB ）。依照國(guó)際種子檢驗(yàn)規(guī)程，發(fā)芽床試驗(yàn)采用濾紙法，每處理1 個(gè)培養(yǎng)皿，重復(fù)3 次，共18 個(gè)培養(yǎng)皿。每個(gè)培養(yǎng)皿中墊有兩層濾紙，在不同處理的培養(yǎng)皿中分別加入相應(yīng)的處理液6 mL。供試種子先破除硬實(shí)后置于培養(yǎng)皿中，每個(gè)培養(yǎng)皿放入50 粒種子，置于恒溫培養(yǎng)箱中，設(shè)定溫度25 ℃、光照時(shí)間10 h、光照強(qiáng)度2 000 lx。每天統(tǒng)計(jì)種子萌發(fā)數(shù)，第3 d 計(jì)算發(fā)芽勢(shì)（GV），第7 d 計(jì)算發(fā)芽率（GR）、發(fā)芽指數(shù)（GI）、活力指數(shù)（VI）和相對(duì)鹽害率。

GV= 3 d 內(nèi)正常發(fā)芽種子數(shù)/全部供試種子數(shù)×100%

GR= 7 d 內(nèi)正常發(fā)芽種子數(shù)/全部供試種子數(shù)×100%

GI= Σ (Gt/Dt)

式中，Gt為浸種后t日的發(fā)芽數(shù)；Dt為相應(yīng)發(fā)芽日數(shù)。

VI=S×GI

式中，S為平均鮮重。

相對(duì)鹽害率=[（CK1發(fā)芽率-脅迫處理發(fā)芽率）/CK1發(fā)芽率]×100%

1.2.2 幼苗生理指標(biāo)的測(cè)定 選取經(jīng)64% H2SO4破除硬實(shí)處理后的黃芪種子，放入25 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中浸種催芽，待種子露白后播種于裝有蛭石的育苗缽內(nèi)，6 個(gè)處理，每處理3 個(gè)育苗缽，每育苗缽內(nèi)播種30 粒種子，用1/4 Hoagland 培養(yǎng)液進(jìn)行澆灌，在幼苗2 葉期時(shí)定苗，每缽留生長(zhǎng)一致的幼苗15 株，3 個(gè)重復(fù)。在第51 d 后進(jìn)行處理：每天每缽分2 次根施5 mL 的處理液，7 d 后測(cè)定保護(hù)酶活性。超氧化物歧化酶（SOD）活性、過氧化物酶（POD）活性、過氧化氫酶（CAT）活性參照陳建勛等[13]的方法測(cè)定；抗壞血酸過氧化物酶（APX）活性、谷胱甘肽還原酶（GR）活性、脫氫抗壞血酸還原酶（DHAR）活性參照段九菊等[14]的方法測(cè)定。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表達(dá)，應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行單因素方差分析（one-way ANOVA）和LSD法（a=0.05）多重比較，Origin8.0 繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源GB 對(duì)鹽脅迫下黃芪種子萌發(fā)指標(biāo)的影響

由表1 看出，CK2（鹽脅迫對(duì)照處理）2 種黃芪種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)均較CK1（純水對(duì)照處理）明顯降低，相對(duì)鹽害率均達(dá)62%以上。CK2與CK1相比，蒙古黃芪的發(fā)芽率降低65.58%，膜莢黃芪降低64.50%。在鹽脅迫下添加外源GB 濃度為10～30 mmol·L-1（T1、T2、T3）情況下，隨著外源GB 濃度增大，2 種黃芪的各項(xiàng)發(fā)芽指標(biāo)總體呈升高的趨勢(shì)，相對(duì)鹽害率呈下降趨勢(shì)；當(dāng)鹽脅迫下的外源GB 濃度為40 mmol·L-1（T4）時(shí)則各項(xiàng)發(fā)芽指標(biāo)顯著下降，相對(duì)鹽害率顯著上升。T3處理的各項(xiàng)發(fā)芽指標(biāo)均達(dá)到最大值，與CK2處理相比，蒙古黃芪的發(fā)芽率（GR）、發(fā)芽勢(shì)（GV）、發(fā)芽指數(shù)（GI）和活力指數(shù)（VI）分別升高159.07%、341.28%、189.25%和184.62%，膜莢黃芪分別升高167.01%、372.41%、210.10%和200.00%，蒙古黃芪和膜莢黃芪的相對(duì)鹽害率分別較CK2降低74.38%和76.18%。

表1 外源GB 對(duì)鹽脅迫下黃芪種子萌發(fā)的影響Table 1 Effect of GB on seed germination of A.membranaceus under salt stress

2.2 外源GB 對(duì)鹽脅迫下黃芪幼苗抗氧化酶活性的影響

由圖1 可知，不同品種的純水對(duì)照處理（CK1），膜莢黃芪幼苗SOD、POD 和CAT 活性均比蒙古黃芪高；鹽脅迫對(duì)照處理（CK2）的2 個(gè)黃芪品種（蒙古黃芪和膜莢黃芪）的SOD、POD 和CAT活性均有升高，分別比CK1提高18.34%和22.23%、12.41%和13.63%、31.65%和33.72%，且2 種黃芪的POD、CAT 活性均與CK1差異顯著（P＜0.05）。鹽脅迫下添加外源GB 的4 個(gè)處理（T1、T2、T3、T4），2 種黃芪幼苗SOD、POD 和CAT 活性均呈先上升后下降的趨勢(shì)，T3達(dá)到最大值。T3處理的SOD、POD 和CAT活性，蒙古黃芪分別較CK2提高41.23%、89.15%和50.67%，膜莢黃芪分別較CK2提高42.92%、91.44%和53.41%，差異均達(dá)顯著水平（P＜0.05）。表明外源GB 可顯著提高黃芪幼苗在鹽脅迫下的SOD、POD和CAT 活性，且膜莢黃芪的提高幅度大于蒙古黃芪。

由圖2 可知，鹽脅迫對(duì)照處理（CK2）的2 種黃芪APX、GR 和DHAR 活性均比純水對(duì)照處理（CK1）大幅度下降，兩者存在顯著性差異（P＜0.05）。鹽脅迫下添加外源GB 的4 個(gè)處理（T1、T2、T3、T4），2 種黃芪幼苗的APX、GR 和DHAR 活性均呈先上升后下降的趨勢(shì)，在T3處理達(dá)到最大值，T4處理出現(xiàn)下降。與CK2相比，T3處理的APX、GR 和DHAR活性，膜莢黃芪分別提高323.02%、139.38%和109.92%，蒙古黃芪分別提高343.23%、167.25%和111.01%，差異均達(dá)顯著水平（P＜0.05）。表明外源GB 可顯著提高黃芪幼苗在鹽脅迫下的APX、GR和DHAR 活性，且外源GB 對(duì)膜莢黃芪的鹽脅迫緩解效果優(yōu)于蒙古黃芪。

圖1 外源GB 對(duì)鹽脅迫下黃芪幼苗SOD、POD 和CAT 活性的影響Fig.1 Effects of GB on SOD, POD and CAT activities in A.membranaceus seedlings under salt stress

圖2 外源GB 對(duì)鹽脅迫下黃芪幼苗APX、GR 和DHAR 活性的影響Fig.2 Effects of GB on APX, GR and DHAR activities in A.membranaceus seedlings under salt stress

3 討論與結(jié)論

3.1 外源GB 對(duì)鹽脅迫下黃芪種子發(fā)芽指標(biāo)的影響

植物最重要的繁殖器官是種子，因此植物種子在萌發(fā)階段的耐鹽狀況可以反映該物種的耐鹽能力[15]。本研究中，鹽脅迫會(huì)導(dǎo)致2 種黃芪種子的發(fā)芽率等指標(biāo)明顯降低，相對(duì)鹽害率大幅上升，但在添加外源GB（≤30 mmol·L-1）后，發(fā)芽率等指標(biāo)均出現(xiàn)升高，表明外源GB 可有效緩解鹽脅迫對(duì)種子萌發(fā)造成的抑制作用。在鹽脅迫處理下，蒙古黃芪種子的發(fā)芽率等指標(biāo)降幅較大；在外源GB 處理后，膜莢黃芪的發(fā)芽率等指標(biāo)增幅較大，表明膜莢黃芪種子對(duì)鹽脅迫的耐受性和調(diào)控響應(yīng)性均高于蒙古黃芪。

3.2 外源GB 對(duì)鹽脅迫下黃芪幼苗抗氧化酶活性的影響

鹽脅迫可引起植物體內(nèi)產(chǎn)生活性氧簇（ROS），由于ROS 的增加，細(xì)胞中抗氧化酶（SOD、POD、CAT 和APX 等）活性都會(huì)有所升高以清除產(chǎn)生的ROS[16]。逆境中保護(hù)酶活性會(huì)增強(qiáng)或維持較高的水平，才能清除活性氧自由基使之保持較低水平，以防止自由基對(duì)生物膜結(jié)構(gòu)和功能的破壞[17]。SOD 能催化O2-發(fā)生歧化反應(yīng)產(chǎn)生H2O2和O2，H2O2隨后主要 被POD、CAT 和AsA-GSH 循環(huán)清除，APX 在AsA-GSH 循環(huán)中清除H2O2起著關(guān)鍵作用, 而MDHAR、DHAR 和GR 主要通過影響AsA 和GSH 的再生，為APX 清除H2O2提供底物[18]。本研究中，鹽脅迫下，2 種黃芪幼苗中的SOD、CAT、POD 活性出現(xiàn)小幅度的升高，但APX、GR 和DHAR 的活性出現(xiàn)顯著下降；在外源GB（≤30 mmol·L-1）處理后，SOD、POD和CAT，以及AsA-GSH 循環(huán)的關(guān)鍵酶APX、GR 和DHAR 活性均出現(xiàn)升高。這表明，黃芪幼苗可通過調(diào)節(jié)自身SOD 等酶的活性來抵御鹽脅迫傷害，外源GB 可有效提高抗氧化酶的活性，緩解鹽脅迫傷害，這可能是由于外源GB 可作為輔因子參與Ca2+-CaM信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑, 調(diào)控相關(guān)蛋白表達(dá)所致。同樣在經(jīng)外源GB 處理后，膜莢黃芪的抗氧化酶活性高于蒙古黃芪，說明品種之間存在差異性。

綜上所述，鹽脅迫會(huì)對(duì)黃芪種子的萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)造成傷害，添加外源GB 可有效緩解鹽脅迫的傷害，本試驗(yàn)適宜的添加濃度為30 mmol·L-1。2 種黃芪品種相比較，膜莢黃芪的耐鹽性及對(duì)外源GB 調(diào)控的響應(yīng)性強(qiáng)于蒙古黃芪。因此，在干旱多鹽堿的河西走廊種植區(qū)，可通過適宜濃度的外源GB 調(diào)節(jié)來提高黃芪的耐鹽性，并根據(jù)實(shí)際情況選擇合適品種種植，以減輕鹽脅迫對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育的影響。