活血消異方對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥大鼠胎仔圍產(chǎn)期發(fā)育毒性的初步研究

孫偉偉，常 歡.2，趙瑞華*

（1.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院，北京 100053；2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京康復(fù)醫(yī)院，北京 100069）

子宮內(nèi)膜異位癥（endometriosis,EM）是婦科的疑難病，好發(fā)于育齡期女性，所導(dǎo)致的盆腔局部黏連、疼痛以及不孕嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量及身心健康。血瘀為子宮內(nèi)膜異位癥的病理實(shí)質(zhì)，臨床辨證時(shí)使用活血消癥藥物較多?；钛惙绞窃趥鞒惺锥紘?guó)醫(yī)名師李光榮教授治療子宮內(nèi)膜異位癥學(xué)術(shù)思想基礎(chǔ)上，由趙瑞華教授凝練而成的治療子宮內(nèi)膜異位癥、抑制子宮內(nèi)膜異位癥復(fù)發(fā)的核心方藥。為確保臨床用藥安全性，課題組在評(píng)價(jià)活血消異方是否具有生殖毒性方面進(jìn)行了系列工作和初步探討。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 性成熟、健康未孕的 SD 雌性大鼠，體質(zhì)量（200±20）g。購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物合格證編號(hào) SCXK（京）2012-0001。飼養(yǎng)條件：清潔級(jí)動(dòng)物房，溫度 （22±3）℃，相對(duì)濕度 50%～60%，人工照明，12 h 光照，12 h 黑暗，食用標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料，飲水自由。

1.2 試劑及藥物 注射用青霉素鈉（批號(hào)：F3092117，華北制藥股份有限公司）、水合氯醛（批號(hào)：20140304，北京化工廠）、茜素紅（批號(hào)：130-22-3，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限責(zé)任公司）、氫氧化鉀（批號(hào)：10017092，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限責(zé)任公司）?；钛惙接刹窈?、制香附、丹參、赤芍、莪術(shù)、皂刺等藥物組成，由中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院制劑室提供。以上藥物加 10 倍水，煎煮 3 次，每次 1 h，合并煎液，過濾，放置 24 h 后濃縮。中藥低劑量組藥物濃度為 每毫升1.8 g 生藥，中藥高劑量組藥物濃度為 每毫升3.6 g生藥，藥液在 4 ℃冰箱保存。

1.3 造模與分組 造模前，連續(xù)1 周每日定時(shí)做陰道涂片檢查，動(dòng)情周期為4～5 日，選擇動(dòng)情周期正常的SD 雌性大鼠。采用改良同種異體移植法建立子宮內(nèi)膜異位癥大鼠模型[1]。造模1 周后，隨機(jī)選取3 只大鼠脫頸處死，固定于手術(shù)板上，常規(guī)消毒后，打開腹腔，肉眼觀察并取出造模大鼠腹腔內(nèi)異位組織，用生理鹽水沖洗2～3 次，清洗掉血塊和多余的脂肪組織，放置在4%甲醛中以固定，隨后進(jìn)行石蠟切片HE染色，在顯微鏡下觀察異位組織的形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)和特點(diǎn)，鏡下顯示有豐富的血管生成，并有大量腺體存在，說明造模成功。將造模成功的子宮內(nèi)膜異位癥大鼠隨機(jī)分為模型組、中藥低劑量組、中藥高劑量組，行假手術(shù)操作的大鼠為假手術(shù)組，未經(jīng)過任何處理的大鼠為空白組。

1.4 給藥方法 中藥低劑量組：每日灌服中藥低劑量組藥物（相當(dāng)于人臨床用藥量10 倍）1 mL/100 g 大鼠，連續(xù)給藥至處死；中藥高劑量組：每日灌服中藥高劑量組藥物（相當(dāng)于人臨床用藥量20倍）1 mL/100 g大鼠，連續(xù)給藥至處死；空白組、假手術(shù)組、模型組：與其他組同時(shí)開始灌服蒸餾水1 mL/100 g 大鼠，連續(xù)灌服至處死。

1.5 合籠 給藥3 周后，將各組雌鼠分別與平行喂養(yǎng)的雄鼠以2:1 合籠交配，第2 天8:00 am 檢查，如果陰道涂片顯示有精子者視為交配成功，記錄為孕0 天。交配期為2～3 周。

1.6 觀察指標(biāo)及判斷標(biāo)準(zhǔn)

1.6.1 一般狀態(tài) 試驗(yàn)期間每天觀察已孕大鼠的活動(dòng)、行為、步態(tài)和對(duì)外界的反應(yīng)情況，記錄死亡情況，記錄攝食量，每周 2 次測(cè)量并記錄體質(zhì)量。

1.6.2 胎仔發(fā)育毒性 在已孕母鼠孕20 d 時(shí)，每組隨機(jī)選取8 只，采用頸椎脫臼法處死，檢查所有胎仔的存活和畸形情況。觀察胚胎顏色和外形。將胎盤與胎鼠剝離后，稱體質(zhì)量。從頭向肛門檢查胎鼠的外觀是否存在畸形；測(cè)量胎鼠身長(zhǎng)、尾長(zhǎng)。將一部分胎鼠置于濃度為95%的乙醇液中固定48 h 后，移入到1% 的KOH 溶液中，2 d 后去除內(nèi)臟和脂肪，再移入1%的KOH 溶液中透明3～5 d，直至骨骼清楚，將胎仔再移入0.005%的茜素紅溶液中染至桃紅色，最后再次移入透明液中，2 d 后在顯微鏡下觀察各部位骨骼形態(tài)是否存在異常的情況。外觀畸形判斷標(biāo)準(zhǔn)[2]，見表1。

表1 大鼠、小鼠常見外觀畸形特征

1.6.3 圍產(chǎn)期發(fā)育毒性 每組隨機(jī)留取8 只妊娠母鼠自然分娩并飼養(yǎng)其子代至21 d 離乳，觀察其存活率和生長(zhǎng)發(fā)育情況。離乳前體格發(fā)育正常的標(biāo)志有耳廓張開、毛發(fā)生長(zhǎng)、門齒萌出等。從每窩中隨機(jī)選擇雌、雄子代各1只，常規(guī)飼養(yǎng)至成年，期間不接觸任何藥物，然后進(jìn)行交配以檢測(cè)其生殖能力。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 17.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料滿足方差分析條件者（各組均服從正態(tài)分布且方差齊），采用單因素方差分析檢驗(yàn)，兩兩比較用SNK法或LSD法；若不滿足方差分析條件者（不服從正態(tài)或方差不齊），采用多個(gè)獨(dú)立樣本的非參數(shù)檢驗(yàn)。數(shù)據(jù)描述均采用均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差（）表示。計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 子宮內(nèi)膜異位癥大鼠造模結(jié)局判定 造模1 周后隨機(jī)抽取3 只造模大鼠處死判定造模結(jié)局，結(jié)果顯示：3 只大鼠肉眼觀察均可見異位內(nèi)膜在腸系膜上生長(zhǎng)良好，呈隆起囊狀小包塊，活動(dòng)度小，內(nèi)含黏液，上有豐富的血管。HE 染色顯微鏡下顯示異位病灶組織有豐富的血管生成，并有大量腺體存在，說明造模成功，造模成功率100%。

2.2 一般狀態(tài) 試驗(yàn)期間各組孕鼠的活動(dòng)、行為、步態(tài)和對(duì)外界的反應(yīng)情況正常，攝食量各組比較無明顯差異。孕期各組大鼠體質(zhì)量平穩(wěn)增長(zhǎng)，各組間體質(zhì)量比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。各組均未見大鼠死亡情況。見表2。

2.3 大鼠胎仔發(fā)育毒性結(jié)果比較 孕20 d 每組選取8只孕鼠處死，對(duì)各組大鼠平均胎鼠數(shù)、胚胎體質(zhì)量、胚胎身長(zhǎng)、胚胎尾長(zhǎng)進(jìn)行比較；將各組胎鼠制作成胎仔骨骼標(biāo)本以觀察骨骼缺失、畸形情況。

2.3.1 各組大鼠胎仔生長(zhǎng)發(fā)育主要指標(biāo)比較 各組大鼠平均胎鼠數(shù)比較，結(jié)果顯示：模型組平均胎鼠數(shù)明顯低于空白組、假手術(shù)組、中藥低劑量組、中藥高劑量組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；中藥低劑量組平均胎鼠數(shù)與空白組、假手術(shù)組比較無明顯差異（P＞0.05），但中藥高劑量組平均胎鼠數(shù)高于空白組（P＜0.05）。各組大鼠胎仔體質(zhì)量比較，結(jié)果顯示：模型組胎鼠體質(zhì)量與空白組、假手術(shù)組相比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；中藥低劑量組、中藥高劑量組胎鼠體質(zhì)量低于空白組、假手術(shù)組、模型組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；中藥低劑量組與中藥高劑量組胎鼠體質(zhì)量相比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

各組大鼠胎仔身長(zhǎng)比較，結(jié)果顯示：模型組胎鼠身長(zhǎng)與空白組、假手術(shù)組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；中藥低劑量組、中藥高劑量組胎鼠身長(zhǎng)低于空白組、模型組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；中藥低劑量組與中藥高劑量組胎鼠身長(zhǎng)相比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

各組大鼠胎仔尾長(zhǎng)比較，結(jié)果顯示：模型組與空白組、假手術(shù)組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；中藥低劑量組尾長(zhǎng)低于模型組（P＜0.05），中藥高劑量組尾長(zhǎng)低于空白組、模型組（P＜0.05）；中藥低劑量組與中藥高劑量組胎鼠尾長(zhǎng)相比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表3。

表2 各組大鼠體質(zhì)量比較（，n =8） g

表2 各組大鼠體質(zhì)量比較（，n =8） g

表3 各組大鼠孕20 d 胚胎生長(zhǎng)發(fā)育主要指標(biāo)比較（，n =8）

表3 各組大鼠孕20 d 胚胎生長(zhǎng)發(fā)育主要指標(biāo)比較（，n =8）

注：與空白組比較，# P ＜0.05；與模型組比較，△P ＜0.05

2.3.2 各組大鼠的胎仔骨骼標(biāo)本觀察 妊娠20 d 大鼠的胎仔骨骼標(biāo)本觀察結(jié)果顯示，各組胎仔骨骼均并未出現(xiàn)明顯缺失和畸形。

2.4 大鼠圍產(chǎn)期毒性結(jié)果比較

2.4.1 大鼠子代斷乳后存活率比較 各組留取8 只孕鼠自然分娩，大鼠子代在哺乳21 d 后斷乳，比較各組大鼠子代存活率、畸形率、死亡率。結(jié)果顯示：離乳前各組子代大鼠體格發(fā)育正常，均可見耳廓張開、毛發(fā)生長(zhǎng)、門齒萌出；各組大鼠子代畸形率、死亡率、存活率之間無明顯差異（P＞0.05）。見表4。

表4 各組大鼠子代斷乳后存活率比較（）

表4 各組大鼠子代斷乳后存活率比較（）

2.4.2 各組大鼠子代斷乳后體質(zhì)量比較 各組大鼠子代斷乳后體質(zhì)量比較，結(jié)果顯示：空白組、假手術(shù)組、模型組之間體質(zhì)量無明顯差異（P＞0.05）；中藥低、高劑量組子代大鼠體質(zhì)量高于空白組、假手術(shù)組、模型組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；中藥高、低劑量組之間無明顯差異（P＞0.05）。見表5。

表5 各組大鼠子代斷乳后體質(zhì)量比較（）

表5 各組大鼠子代斷乳后體質(zhì)量比較（）

注：與空白組比較，# P ＜0.05

3 討論

“疼痛、不孕、復(fù)發(fā)”是子宮內(nèi)膜異位癥的三大難題[3-5]，子宮內(nèi)膜異位癥可從排卵、受精、著床等多個(gè)方面對(duì)妊娠產(chǎn)生負(fù)面影響。EM 根據(jù)臨床癥狀，可以歸屬于中醫(yī)的“痛經(jīng)”“不孕”“癥瘕”“月經(jīng)失調(diào)”“血瘕”等范疇[6-8]?！把觥笔亲訉m內(nèi)膜異位癥的公認(rèn)病機(jī)，臨證治療多以活血為主要治則，常用莪術(shù)、三棱、丹參、赤芍等藥物。傳統(tǒng)中醫(yī)藥理論很早就有妊娠禁忌的概念，主要考慮藥物可引發(fā)流產(chǎn)、墮胎等可能，按藥物的副作用大小，分為禁用和慎用兩類[9]?；钛惙皆醋岳罟鈽s教授治療子宮內(nèi)膜異位癥系列經(jīng)驗(yàn)方，由趙瑞華教授結(jié)合子宮內(nèi)膜異位癥現(xiàn)代疾病特點(diǎn)化裁而來，強(qiáng)調(diào)從郁論治，其組方以解郁活血為準(zhǔn)則，包括莪術(shù)、丹參、赤芍等妊娠禁用、慎用的活血消癥類中藥。中醫(yī)藥治療子宮內(nèi)膜異位癥療程一般在3 個(gè)月以上，尤其對(duì)于有生育要求的子宮內(nèi)膜異位癥患者，常根據(jù)患者排卵情況周期用藥，用藥期間允許患者試孕，這就使得中藥的生殖發(fā)育毒性的研究尤為重要[10-12]。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，孕20 d 模型組大鼠平均胎鼠數(shù)量少于其他各組（P＜0.05），模型組胎鼠體質(zhì)量、身長(zhǎng)、尾長(zhǎng)與空白組、假手術(shù)組比較無明顯差異（P＞0.05）；結(jié)合前期生殖力與早期胚胎毒性結(jié)果，提示子宮內(nèi)膜異位癥疾病本身可能通過影響著床從而在一定程度上降低大鼠生殖能力，但對(duì)早期胚胎發(fā)育、胎仔發(fā)育無明顯毒性?；钛惙礁摺⒌蛣┝拷M平均胎鼠數(shù)明顯高于模型組（P＜0.05），活血消異方高劑量組平均胎鼠數(shù)甚至高于空白組（P＜0.05），但活血消異方高、低劑量組胎鼠體質(zhì)量、身長(zhǎng)、尾長(zhǎng)明顯低于空白組及模型組（P＜0.05），考慮可能與胎鼠數(shù)量較多有關(guān)；各組胎仔骨骼均未出現(xiàn)缺失和畸形，離乳前各組子代大鼠體格發(fā)育正常，斷乳后子代畸形率、死亡率、存活率之間無明顯差異（P＞0.05），且中藥低、高劑量組子代斷乳后體質(zhì)量高于空白組、假手術(shù)組、模型組（P＜0.05）。研究結(jié)果初步證實(shí)，活血消異方對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥大鼠胎仔、圍產(chǎn)期發(fā)育并無明顯毒性。

中藥治療疾病以復(fù)方為主，根據(jù)中藥配伍規(guī)律指導(dǎo)，臨床不良反應(yīng)相對(duì)較少。目前中藥復(fù)方研究，仍集中于對(duì)臨床療效的觀察或?qū)ψ饔脵C(jī)制的探討，對(duì)于中藥毒性，尤其是生殖毒性的研究仍比較欠缺。隨著天然藥物中毒事件不斷增多，重新認(rèn)識(shí)中藥生殖毒性的意識(shí)逐漸提高[13]，對(duì)無明顯毒性中藥乃至保胎類方劑、單味藥的胚胎毒性、遺傳毒性安全性研究發(fā)現(xiàn),菟絲子[14]、桑寄生[15]等藥物具有潛在的遺傳毒性，水蛭有顯著墮胎作用[16]，僵蠶能顯著降低小鼠子宮重量及妊娠率[17]，長(zhǎng)期、大量使用大黃可對(duì)卵巢儲(chǔ)備造成影響[18]。生殖毒性的研究，對(duì)保證臨床用藥安全有重大意義，本系列研究就活血消異方的生殖毒性進(jìn)行了初步探討，但使用動(dòng)物模型僅為大鼠，未來仍需進(jìn)一步研究驗(yàn)證。