鴻雁骨膠原多肽制備及其抗氧化活性研究

熊明澤，孫堯，*，崔本海，高冷，*

（1.長(zhǎng)春工業(yè)大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，吉林長(zhǎng)春130012；2.通榆縣向海崔成大雁養(yǎng)殖有限公司，吉林白城137000）

鴻雁（Anser cygnoides）是我國(guó)傳統(tǒng)狩獵鳥(niǎo)類(lèi)，其肉品野味濃郁、營(yíng)養(yǎng)豐富、脂肪和膽固醇含量低，且具有祛風(fēng)、舒筋、壯骨之保健功能，深受人們喜愛(ài)，現(xiàn)已在多個(gè)省份進(jìn)行人工馴化養(yǎng)殖，并形成一定規(guī)模[1]。目前，我國(guó)對(duì)于鴻雁的開(kāi)發(fā)僅局限于肉類(lèi)食用，關(guān)于雁骨的利用并沒(méi)有好的方法，造成了大量骨資源浪費(fèi)。

畜禽骨骼中含有如蛋白質(zhì)、氨基酸、礦物質(zhì)、軟骨素、骨膠等具有保健作用的功能物質(zhì)[2]，其所含的蛋白質(zhì)中，膠原蛋白占到90%以上，能夠促進(jìn)人體皮下組織的代謝功能，還可以延緩衰老[3]。膠原蛋白主要為三螺旋結(jié)構(gòu)，不易被生物體利用，酶解會(huì)使其轉(zhuǎn)變?yōu)殡暮陀坞x氨基酸[4]。近年來(lái)，骨膠原多肽因其豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和生理功能成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)，國(guó)內(nèi)外對(duì)于骨骼酶解的報(bào)道較多，主要集中在豬骨[5]、牛骨[6]、魚(yú)骨[7]等，酶解雁骨制備膠原多肽的研究卻鮮見(jiàn)報(bào)道。大量研究表明：酶解動(dòng)物骨蛋白得到的膠原多肽具有降血壓[8]、抗氧化[9]、抗骨質(zhì)疏松[10]等生理活性。莊本慶等[11]以牛骨粉為原料，以水解度為指標(biāo)，選用兩種酶酶解制備膠原多肽，采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化了酶解工藝條件。郭冰潔等[12]采用熱水抽提法提取鹿骨中的膠原蛋白，再經(jīng)胃、胰蛋白酶酶解，制得鹿骨多肽，然后以鹿骨多肽的水解度為指標(biāo)，通過(guò)單因素和正交試驗(yàn)優(yōu)化鹿骨多肽的胰蛋白酶酶解工藝。

本文采用復(fù)合酶酶解制備雁骨膠原多肽，利用響應(yīng)面分析對(duì)酶解工藝進(jìn)行優(yōu)化，確定雁骨膠原多肽制備的最佳工藝，通過(guò)不同的體外抗氧化指標(biāo)對(duì)鴻雁骨膠原多肽的抗氧化活性進(jìn)行測(cè)定，同時(shí)分析其氨基酸組成和相對(duì)分子質(zhì)量，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用雁骨膠原多肽提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鴻雁雁骨：通榆縣向海崔成大雁養(yǎng)殖有限公司提供。

木瓜蛋白酶（400 U/mg）：北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；中性蛋白酶（200 U/mg）、堿性蛋白酶（60 U/mg）：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；胰蛋白酶（250 U/mg）、胃蛋白酶（3 000 U/mg）：北京索萊寶科技有限公司；30%Acr-Bis：博士德生物工程有限公司；考馬斯亮藍(lán)R-250：美國(guó)Sigma-Aldrich公司；彩色預(yù)染標(biāo)準(zhǔn)蛋白 Marker（10 kDa～250 kDa）：美國(guó)賽默飛世爾科技公司；鄰苯三酚、30%過(guò)氧化氫溶液：南京化學(xué)試劑有限公司；其他化學(xué)試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

冷凍干燥機(jī)（LGJ-30）：北京松源華興科技發(fā)展有限公司；電熱恒溫水浴鍋（DK-S26）：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；中草藥粉碎機(jī)（FW135）：天津市泰斯特儀器有限公司；高速臺(tái)式離心機(jī)（TGL-IGC）：上海安亭科學(xué)儀器廠(chǎng)；電子天平（HX2002T）：慈溪市天東衡器廠(chǎng)；紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（TU-1800PC）：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；冷凍高速離心機(jī)（GL-10MC）：長(zhǎng)沙湘銳離心機(jī)有限公司；微型漩渦混合儀（XW-80A）：上海滬西分析儀器廠(chǎng)；培養(yǎng)箱/干燥箱（PH-050A）：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；電泳儀（DYY-10C）：北京六一生物科技有限公司；TSK gel Super SW2000凝膠過(guò)濾色譜柱（300 mm×4.6 mm，4 μm）：上海東曹生物科技有限公司；氨基酸分析儀（L-8900）：日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 雁骨粉的制備

將去肉雁骨切成1 cm～2 cm的骨段，將骨段與石油醚以1∶2（g/mL）的骨/溶液比混合，用超聲輔助提取油脂6 h，每2 h更換溶劑并去除油脂，然后用純水以1∶20（g/mL）的比例洗滌去除油脂后的骨段3次。然后將骨段用0.05mol/L乙二胺四乙酸-二鈉（ethylene diamine tetraacetic acid-2Na，EDTA-2Na）溶液以 1 ∶10（g/mL）的比例脫礦質(zhì)24 h，并且每12 h更換溶液，然后將脫礦質(zhì)骨段用純水以1∶20（g/mL）的比例洗滌10 min，并進(jìn)行3次洗滌。將脫礦物質(zhì)后的骨段置于2%NaCl溶液中[質(zhì)量體積比為 1 ∶5（g/mL）]，25 ℃條件下靜置10 h，取出雜蛋白，并用純水清洗骨段3次。將處理后的骨段在超低溫冰箱中凍存，然后置于真空冷凍干燥機(jī)中進(jìn)行干燥，最后通過(guò)萬(wàn)能粉碎機(jī)對(duì)凍干后的雁骨進(jìn)行粉碎，過(guò)40目篩，制備得到雁骨粉。

1.3.2 雁骨膠原蛋白及膠原多肽的制備工藝

骨粉水浴溶解→離心分離→真空抽濾→蒸發(fā)濃縮→膠原蛋白濃縮液→真空冷凍干燥→膠原蛋白粉。

骨粉溶解→調(diào)節(jié)pH值→加酶水浴酶解→95℃滅酶→冷卻后離心分離→真空抽濾→蒸發(fā)濃縮→膠原多肽濃縮液→真空冷凍干燥→膠原多肽粉。

1.3.3 酶解工藝

1.3.3.1 蛋白酶篩選

由于蛋白酶具有底物特異性、作用位點(diǎn)專(zhuān)一性的特點(diǎn)，因此不同蛋白酶對(duì)鴻雁雁骨的水解程度不同，且酶解產(chǎn)物的功能性質(zhì)也有所不同[13]。本試驗(yàn)選用木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶、胰蛋白酶和胃蛋白酶5種蛋白酶進(jìn)行酶解試驗(yàn)，配置5%的雁骨粉溶液，按照表1條件調(diào)節(jié)起始pH值（磷酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)pH值），酶解5 h，95℃滅酶10 min，5 000 r/min離心10 min，取上清液測(cè)定酶解液水解度。同時(shí)設(shè)置空白組，不添加酶酶解，提取雁骨膠原蛋白。

采用兩種方式調(diào)節(jié)酶解pH值：一種是調(diào)節(jié)起始pH值；另一種是加入磷酸鹽緩沖液，維持酶解過(guò)程pH值不變。以水解度為指標(biāo)，將這兩種方式進(jìn)行試驗(yàn)對(duì)比，選出3種最佳酶組成復(fù)合酶和最佳pH值調(diào)節(jié)方式。具體酶解條件見(jiàn)表1。

表1 各蛋白酶反應(yīng)條件Table 1 Reaction conditions of different enzymes

1.3.3.2 復(fù)合酶配比選擇

配制5%的雁骨粉溶液，加入磷酸鹽溶液調(diào)節(jié)pH值為7，加酶量5 000 U/g（木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶質(zhì)量比分別為 2∶1∶1、1∶2∶1、1 ∶1 ∶2），在50℃的水浴鍋中酶解5 h，測(cè)定其水解度。并以3種單一酶作為對(duì)照，選擇最佳復(fù)合酶配比。

1.3.3.3 單因素試驗(yàn)

將雁骨粉配制成5%的溶液，分別在酶解溫度35、40、45、50、55、60 ℃，pH 值 4、5、6、7、8、9，加酶量 3 000、4 000、5 000、6 000、7 000、8 000 U/g，酶解時(shí)間 1、2、3、4、5、6 h的條件下進(jìn)行單因素試驗(yàn)，以水解度為指標(biāo)篩選出最佳的酶解條件。

1.3.3.4 響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化酶解工藝

以酶解溫度、加酶量、pH值為影響因素，以水解度為響應(yīng)值，采用Box-Behnken組合方法進(jìn)行三因素三水平響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，Design-Expert 8.1軟件設(shè)計(jì)試驗(yàn)并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，設(shè)計(jì)如表2。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)因素水平Table 2 Box-Behnken test factor levels

1.3.4 水解度測(cè)定

采用甲醛滴定法測(cè)定氨基態(tài)氮含量，凱氏定氮法測(cè)定總氮含量[14]。水解度（DH）按式（1）計(jì)算：

式中：DH為水解度，%；N1為上清液中氨基態(tài)氮含量，mol/L；N0為樣品中總氮含量，mol/L。

1.3.5 雁骨膠原多肽抗氧化能力測(cè)定

在本研究中選取VC為對(duì)照樣品，對(duì)未酶解的膠原蛋白和經(jīng)木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶、復(fù)合酶酶解制備的雁骨膠原多肽分別進(jìn)行抗氧化能力測(cè)定，比較經(jīng)復(fù)合酶酶解制備的雁骨膠原多肽抗氧化能力的強(qiáng)弱，并計(jì)算其IC50值。體外試驗(yàn)設(shè)置的底物質(zhì)量濃度梯度為 1、2、3、4、5、6 mg/mL。

1.3.5.1 清除O2-·的能力測(cè)定

采用鄰苯三酚自氧化法[15]，鄰苯三酚在堿性條件下會(huì)發(fā)生自氧化，生成有色中間產(chǎn)物和超氧陰離子自由基，O2-·對(duì)自氧化有催化作用。具體操作：取不同組分樣品1 mL，加入0.05 mol/L的Tris-HCl緩沖液（pH 8.2）4.5 mL，蒸餾水2 mL，2.5 mmol/L鄰苯三酚溶液0.5 mL，混勻后在25℃水浴中反應(yīng)20 min，測(cè)定產(chǎn)物在299 nm處吸光度。以蒸餾水代替樣品做空白組，按式（2）計(jì)算超氧陰離子自由基清除率。

式中：A樣品為樣品吸光度；A空白為空白的吸光度。

1.3.5.2 清除·OH的能力測(cè)定

先取不同組分樣品1 mL放入試管中，然后取0.025 mol/L、pH 7.4 的磷酸緩沖液 1 mL、40 μg/mL 番紅花紅1 mL、3%過(guò)氧化氫1mL（新鮮配制）、0.945 mmol/L乙二胺四乙酸鐵（Ⅱ）鈉鹽[ethylene diamine tetraacetic acid-Fe（Ⅱ），EDTA-Fe（Ⅱ）]溶液（新鮮配制）1 mL，均勻混合后在37℃水浴中反應(yīng)45 min，然后在520 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度?？瞻捉M以1 mL蒸餾水代替樣品，對(duì)照組以2 mL蒸餾水代替EDTA-Fe（Ⅱ）和樣品，并按式（3）計(jì)算·OH 清除率[16]。

式中：A樣品、A空白、A對(duì)照分別為樣品、空白和對(duì)照組的吸光度。

1.3.6 雁骨膠原多肽分子量測(cè)定

1.3.6.1 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳測(cè)定方法

對(duì)復(fù)合酶酶解制備的雁骨膠原多肽進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分析。將樣品于0.5 mol/L的乙酸溶液中溶解后調(diào)至中性，將中性樣品與上樣緩沖液以體積比為4∶1的比例混合，沸水浴5 min，冷卻后12 000 r/min離心5 min，取10 μL上清液上樣。采用12%的分離膠和5%的濃縮膠，用考馬斯亮藍(lán)染色液染色。

1.3.6.2 分子排阻色譜法

精密稱(chēng)取經(jīng)復(fù)合酶最優(yōu)條件下酶解制備的雁骨膠原多肽粉100 mg，置于10 mL容量瓶中，加水溶解并定容至刻度，搖勻得濃度為10 mg/mL的膠原多肽水溶液，作為供試品溶液。TSk gel Super SW2000色譜柱（300 mm×4.6 mm，4 μm），流動(dòng)相：0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS）（pH=7.0）+0.1 mol/L硫酸鈉溶液；檢測(cè)波長(zhǎng)：214 nm；流速：1 mL/min；進(jìn)樣量：5 μL。采用分子量標(biāo)準(zhǔn)品：肌球蛋白（16 950 Da）、抑肽酶（6 512 Da）、胰島素 B（3 496 Da）、生長(zhǎng)激素釋放抑制因子（1 521 Da）、苯丙氨酸（165 Da）。依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的分子量，采用外標(biāo)法計(jì)算獲得經(jīng)復(fù)合酶在最優(yōu)條件下酶解制備的雁骨膠原多肽的分子量大小[17]。

1.3.7 氨基酸組成測(cè)定

樣品處理：準(zhǔn)確稱(chēng)取0.02 g雁骨膠原多肽凍干樣品于水解管中，加入10 mL 6 mol/L HCl，加入3滴～4滴苯酚溶液，將水解管放入冷凍劑中，冷凍3 min～5 min，抽真空充入氮?dú)夂蠓饪?，?10℃的恒溫鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)水解22 h，取出冷卻，將水解液過(guò)濾，用去離子水多次沖洗水解管，將水解液轉(zhuǎn)移到50 mL容量瓶?jī)?nèi)并定容。取1mL水解液于5 mL容量瓶中，用真空干燥器在40℃～50℃干燥，殘留物用1 mL～2 mL純水溶解，再干燥，反復(fù)進(jìn)行兩次，最后蒸干，用1mL pH2.2的緩沖液溶解，供儀器測(cè)定用[18]。

測(cè)定：準(zhǔn)確吸取0.200 mL混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)，用pH2.2的緩沖液稀釋到5 mL，此標(biāo)準(zhǔn)稀釋液濃度為5.00 nmol/μL，作為上機(jī)測(cè)定用的氨基酸標(biāo)準(zhǔn)，用氨基酸自動(dòng)分析儀以外標(biāo)法測(cè)定樣品的氨基酸種類(lèi)和含量。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Origin 9.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理以及作圖，響應(yīng)面優(yōu)化采用Design Expert 8.1，數(shù)據(jù)為3次試驗(yàn)的平均值。顯著性分析采用SPSS16.0，p＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白酶的篩選

不同蛋白酶的水解效果比較見(jiàn)圖1。

圖1 不同蛋白酶的水解效果比較Fig.1 Comparison of hydrolysis effects of different proteases

由圖1看出，加緩沖液調(diào)節(jié)pH值的水解度略高于只調(diào)節(jié)起始pH值的水解度，其中木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶在緩沖液調(diào)節(jié)pH值的條件下測(cè)得的水解度明顯要高于胰蛋白酶和胃蛋白酶的水解度（p＜0.05），所以本試驗(yàn)選擇木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和堿性蛋白酶組成復(fù)合酶進(jìn)行第一步酶解。

2.2 復(fù)合酶配比的選擇

復(fù)合酶配比對(duì)水解度的影響見(jiàn)圖2。

圖2 復(fù)合酶配比對(duì)水解度的影響Fig.2 Effect of enzyme ratio on hydrolysis degree

由圖2可知，采用復(fù)合酶酶解雁骨的水解度要優(yōu)于單一酶（p＜0.05），而且不同配比的復(fù)合酶酶解雁骨的水解度大小順序?yàn)?1∶2∶1＞1∶1∶2＞2∶1∶1，當(dāng) 3種酶的質(zhì)量比為1∶2∶1時(shí)，水解度最大為24.34%，故木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和堿性蛋白酶復(fù)合的比例選用1 ∶2 ∶1。

2.3 單因素試驗(yàn)

不同酶解條件對(duì)水解度的影響見(jiàn)圖3。

圖3 不同酶解條件對(duì)水解度的影響Fig.3 Effect of different enzymatic hydrolysis conditions on hydrolysis degree

由圖3（a）可知，當(dāng)溫度小于50℃時(shí)，隨著溫度的升高，水解度逐漸上升；在50℃時(shí)，水解度達(dá)到最大值。當(dāng)溫度大于50℃時(shí)，水解度下降，可能是溫度過(guò)高導(dǎo)致蛋白酶變性，從而使酶解反應(yīng)速率降低[19]。所以，酶解溫度選定為50℃。

由圖3（b）可知，當(dāng)pH＜7時(shí)，水解度隨著pH值升高而升高；當(dāng)pH＞7時(shí)，水解度隨著pH值的升高而下降；當(dāng)pH值為7時(shí)，水解度達(dá)到最大值。當(dāng)pH＞7時(shí)，酶的活性受到影響，水解度降低，因此雁骨的酶解pH值為7。

由圖3（c）可知，水解度隨著加酶量的增加，呈先增加后減少的趨勢(shì)。原因是隨著加酶量的增加，酶與底物結(jié)合的幾率增大，反應(yīng)速率升高，水解度相應(yīng)增大；但隨著加酶量的增多，底物蛋白相對(duì)不足，導(dǎo)致反應(yīng)進(jìn)程減弱，水解度逐漸減小。因此，加酶量選定為6 000 U/g。

由圖3（d）可知，水解度隨著雁骨粉酶解時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增高，然后趨于平衡，當(dāng)酶解時(shí)間到5 h時(shí)，水解度到達(dá)最大值，因此酶解時(shí)間選擇5 h。

2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.4.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

以水解度為響應(yīng)值，綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果選取酶解溫度、pH值和加酶量3個(gè)因素進(jìn)行Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表3所示。方差分析見(jiàn)表4。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Experimental design and results for response surface analysis

表4 響應(yīng)面試驗(yàn)方差分析Table 4 Analysis of variance（ANOVA）of response surface regression model

用Design-Expert 8.1軟件對(duì)結(jié)果中的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合回歸，以酶解溫度（X1）、pH 值（X2）、加酶量（X3）為自變量，水解度為因變量（響應(yīng)值Y），建立二次多元回歸方程模型：

Y=26.42+0.74X1+0.69X2+0.75X3+0.013X1X2+0.077X1X3+0.12X2X3-4.52X12-3.59X22-3.99X32

從表4可知水解度結(jié)果的方差分析：使用二次模型擬合各因素與水解度的關(guān)系，模型的p＜0.000 1，說(shuō)明這個(gè)試驗(yàn)?zāi)Ｐ蜆O顯著。失擬項(xiàng)p=0.372 8＞0.05，表明結(jié)果不顯著，但是該方程對(duì)試驗(yàn)的擬合程度好，該試驗(yàn)方案可行。因素X1、X2與X3三者的線(xiàn)性效應(yīng)以及平方效應(yīng)對(duì)水解度的影響呈極顯著水平（p＜0.000 1），水解度受因素X1X2、X1X3、X2X3的交互作用后的結(jié)果不明顯。根據(jù)一次回歸方程系數(shù)的絕對(duì)值比較可得，各因素對(duì)水解度影響大小的主次為：加酶量＞酶解溫度＞pH值。各因素交互作用對(duì)水解度的影響見(jiàn)圖4。

圖4 各因素交互作用對(duì)水解度的影響Fig.4 Influence of each factor interaction on the hydrolysis degree

由圖4a可知，隨著酶解溫度和pH值的逐漸增加，雁骨水解度先急速升高再緩慢下降，等高線(xiàn)的形狀趨近于橢圓形，水解度受酶解溫度和pH值的交互效應(yīng)后變化顯著。由圖4b可知，隨著酶解溫度和加酶量的逐漸升高，水解度先急速上升再勻速下降，等高線(xiàn)的形狀為橢圓形，說(shuō)明水解度受加酶量和酶解溫度交互效應(yīng)后的變化極顯著。由圖4c可知，隨著pH值和加酶量的逐漸延長(zhǎng)，水解度勻速上升然后勻速下降，說(shuō)明水解度受pH值和加酶量的交互效應(yīng)后的變化極顯著。

2.4.2 工藝優(yōu)化驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

通過(guò)單因素試驗(yàn)確定酶解時(shí)間為5 h，通過(guò)Design-Expert 8.1軟件進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)分析，預(yù)測(cè)最優(yōu)酶解工藝：酶解溫度為50.4℃，最佳pH值為7.1，最佳加酶量為6 100 U/g，水解度為26.52%。根據(jù)預(yù)測(cè)試驗(yàn)方案的可操作性，將工藝參數(shù)改為：酶解溫度50℃，pH值7.1，加酶量6 100 U/g，對(duì)該工藝參數(shù)進(jìn)行驗(yàn)證，3次試驗(yàn)測(cè)定計(jì)算平均值，水解度為26.34%，與預(yù)測(cè)值接近，說(shuō)明該響應(yīng)面模型具有有效性。

2.5 抗氧化能力測(cè)定

2.5.1 超氧陰離子自由基清除能力

超氧陰離子自由基清除能力見(jiàn)圖5。

圖5 雁骨膠原多肽對(duì)O2-·的清除能力Fig.5 The ability of Anser cygnoides bone collagen peptide to clear O2-·

超氧陰離子自由基是生物有機(jī)體代謝過(guò)程中能產(chǎn)生強(qiáng)氧化能力的自由基，對(duì)其清除效果可用來(lái)表征樣品的抗氧化能力[20]。由圖5可知，經(jīng)酶解制備的雁骨膠原多肽對(duì)O2-·清除率要比未酶解的膠原蛋白高，且復(fù)合酶酶解制備的膠原多肽對(duì)O2-·清除率比單一酶要高，隨抗氧化劑質(zhì)量濃度的增加，雁骨膠原多肽與VC對(duì)O2-·清除率也隨之增大，但是都比VC對(duì)O2-·清除率低，其中雁骨膠原多肽質(zhì)量濃度為6mg/mL時(shí)，膠原多肽對(duì)O2-·清除率最大為59.21%，其IC50值為2.16mg/mL。

2.5.2 羥基自由基清除能力

羥基自由基清除能力見(jiàn)圖6。

圖6 雁骨膠原多肽對(duì)·OH的清除能力Fig.6 The ability of Anser cygnoides bone collagen peptide to clear·OH

由圖6可以看出，雁骨膠原多肽對(duì)羥基自由基有明顯的清除作用，經(jīng)復(fù)合酶酶解制備的雁骨膠原多肽對(duì)羥基自由基的清除能力比單一酶更好，但其清除效果都低于VC。當(dāng)雁骨膠原多肽的質(zhì)量濃度為6 mg/mL時(shí)，膠原多肽對(duì)·OH清除率最大為51.82%，其IC50值為1.79 mg/mL。

2.6 分子量測(cè)定結(jié)果

2.6.1 SDS-PAGE結(jié)果

雁骨膠原多肽的SDS-PAGE圖譜見(jiàn)圖7。

圖7 雁骨膠原多肽的SDS-PAGE圖譜Fig.7 SDS-PAGE map of collagen peptide from Anser cygnoides bone

如圖7所示，未經(jīng)酶解的雁骨膠原蛋白分子量比較大且分布較廣，主要分布在75 kDa～210 kDa之間；木瓜蛋白酶酶解制備的雁骨膠原多肽在18、25 kDa處有清晰條帶；中性蛋白酶酶解制備的雁骨膠原多肽在10、17 kDa處有清晰條帶；堿性蛋白酶酶解制備的雁骨膠原多肽在12、18 kDa處有清晰條帶；復(fù)合酶酶解制備的雁骨膠原多肽在10 kDa處有清晰條帶。相比較之下，經(jīng)復(fù)合酶酶解制備的雁骨膠原多肽分子量更小，酶解效果更好。

2.6.2 分子排阻色譜結(jié)果

根據(jù)5種分子量大小不同的標(biāo)準(zhǔn)品物質(zhì)的色譜結(jié)果，以其保留時(shí)間為橫坐標(biāo)（T），相對(duì)分子量的對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)（lgMW）。計(jì)算得到線(xiàn)性方程lgMW=-0.232 2T+6.488，R2=0.997 3。

經(jīng)復(fù)合酶在最優(yōu)酶解條件下酶解制備的雁骨膠原多肽的分子排阻色譜圖見(jiàn)圖8，由檢測(cè)結(jié)果可知，雁骨膠原多肽的保留時(shí)間在10.521 min～15.315 min，通過(guò)線(xiàn)性方程計(jì)算得到其相應(yīng)的分子量大小為851 Da～11 092 Da。

2.7 雁骨膠原多肽的氨基酸組成分析

對(duì)不同蛋白酶酶解制備的雁骨膠原多肽進(jìn)行氨基酸組成成分分析，測(cè)定結(jié)果如表5所示。

圖8 雁骨膠原多肽分子排阻色譜圖Fig.8 Size exclusion chromatography of collagen peptide from Anser cygnoides bone

表5 不同蛋白酶酶解制備的雁骨膠原多肽氨基酸含量Table 5 Amino acid content of Anser cygnoides bone collagen polypeptide prepared by different protease digestion

半胱氨酸、酪氨酸、異亮氨酸、組氨酸、蛋氨酸的含量很少，但谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、羥脯氨酸的含量較高，雁骨膠原多肽的氨基酸組成與馬面魚(yú)骨[21]膠原多肽的氨基酸組成相似。張英等[22]研究了19種氨基酸對(duì)超氧陰離子和羥基自由基的抑制作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn) Tyr、Asp、Lys、Glu、Met、Gly 和 Asn 等氨基酸對(duì)自由基的清除能力較強(qiáng)，而本試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)這類(lèi)氨基酸的含量達(dá)42.64%以上，從而使雁骨膠原多肽具有較強(qiáng)抗氧化活性。

3 結(jié)論

通過(guò)單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面建模優(yōu)化復(fù)合酶酶解制備雁骨膠原多肽工藝，得到最優(yōu)制備條件為：酶解時(shí)間5 h、酶解溫度50℃、pH值7.1、加酶量6 100 U/g，此條件下水解度為26.34%。通過(guò)對(duì)O2-·和·OH的清除能力的測(cè)定，當(dāng)雁骨膠原多肽的質(zhì)量濃度為6 mg/mL時(shí)，O2-·的清除率和·OH的清除率最大分別為59.21%、51.82%，其 IC50值分別為 2.16、1.79 mg/mL，顯示出雁骨膠原多肽具有很好的抗氧化活性。通過(guò)SDS-PAGE試驗(yàn)及分子排阻色譜法測(cè)定，得到經(jīng)復(fù)合酶酶解制備的雁骨膠原多肽分子量大小在851 Da～11 092 Da。氨基酸分析表明，雁骨膠原多肽富含甘氨酸（Gly）、丙氨酸（Ala）、脯氨酸（Pro）和羥脯氨酸（Hyp），與膠原蛋白氨基酸組成特點(diǎn)相一致，且這些特定的氨基酸與膠原多肽的抗氧化活性相關(guān)。該研究為鴻雁骨膠原多肽的酶解制備工藝提供理論依據(jù)，也為鴻雁骨骼資源的利用提供新思路。