槐角配方顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

張彩虹，余志芳，班朝旭，陳 蓉，張 晨，張開元，黃美華，胡昌江

(四川新綠色藥業(yè)科技發(fā)展有限公司 國家中醫(yī)藥管理局 “中藥配方顆粒質(zhì)量與療效評價”重點(diǎn)研究室，四川 成都 611900)

槐角為豆科植物槐SophorajaponicaL.的干燥成熟果實(shí)，具有清熱瀉火、涼血止血的功效，主要用于治療腸熱便血、痔腫出血、肝熱頭痛、眩暈?zāi)砍嗟茸C[1]?；苯菫槲覈鴤鹘y(tǒng)中藥，臨床應(yīng)用廣泛，水煎湯劑作為槐角的傳統(tǒng)應(yīng)用形式，存在服藥量大、利用率低、煎煮時間長等問題[2-3]。槐角配方顆粒是用符合炮制規(guī)范的傳統(tǒng)槐角飲片作為原料，經(jīng)現(xiàn)代制藥技術(shù)提取、濃縮、分離、干燥、制粒、包裝精致而成的純中藥顆粒劑，具有不用煎煮、容易調(diào)配、方便攜帶、一沖即服的特點(diǎn)[4-5]。但將中藥飲片制成中藥配方顆粒后失去了原飲片的性狀鑒別特征，中藥配方顆粒也存在對其療效認(rèn)識不足、缺乏統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)、基礎(chǔ)研究薄弱等問題[6-7]。為了控制中藥配方顆粒質(zhì)量，本研究采用薄層色譜法和高效液相色譜法建立了以對照藥材為隨行對照的特征圖譜和薄層鑒別，對槐角配方顆粒進(jìn)行了多成分、全面的定性鑒別，為健全槐角配方顆粒質(zhì)量控制評價體系提供技術(shù)支撐。

1 儀器與材料

1.1 儀器

高效液相色譜儀：島津LC-20AD型高效液相色譜儀、Agilent1200型高效液相色譜儀、Agilent1260型高效液相色譜儀；電子天平：ME204E/02、MS205DU、XP26(梅特勒-托利多儀器有限公司)；超純水機(jī)：細(xì)胞型1810A(上海摩勒科學(xué)儀器有限公司)；超聲波清洗器：KQ5200DB型(600 W，40 kHz；昆山市超聲儀器有限公司)；電熱恒溫水浴鍋：DZKW-4型(北京中興偉業(yè)儀器有限公司)。

色譜柱：Agilent Eclipse Plus C18250×4.6 mm、phenomenex Luna 5 μm C18(2)100A 4.6×250 mm、Inertsustain C185 μm 4.6×250 mm、Waters XBridge C185 μm 4.6×250 mm；半自動薄層點(diǎn)樣儀：CAMAG Lionmat-5；薄層成像系統(tǒng)：CAMAG TLC Visualizer；硅膠G薄層板(青島海洋化工廠分廠，天津思利達(dá)科技有限公司)。

1.2 試劑及材料

乙腈、磷酸為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。槐角苷對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：111695-201703，含量以99.6%計(jì))；蘆丁對照品(四川省維克奇生物科技有限公司，批號：wkq18012501)；槐角對照藥材(中國食品藥品檢定研究院，批號：121214-201512)?；苯桥浞筋w粒(批號：SY1806001、SY1806002、SY1806003，四川新綠色藥業(yè)科技發(fā)展有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層鑒別

2.1.1 薄層鑒別方法 取本品，研細(xì)，取約1 g，加甲醇20 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状?0 mL使溶解，作為供試品溶液。取槐角對照藥材0.5 g，加甲醇20 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為對照藥材溶液。另取槐角苷對照品與蘆丁對照品，加甲醇制成每1 mL各含1 mg的混合溶液，作為對照品溶液。按照薄層色譜法(《中國藥典》2015年版四部通則0502)試驗(yàn)，分別吸取上述溶液3 μL、0.5 μL、5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-甲酸-水(8∶1∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以1%三氯化鋁乙醇溶液，置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照品色譜、對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。

2.1.2 方法學(xué)考察 專屬性考察：按照擬定的薄層鑒別方法，制備缺槐角配方顆粒的空白對照溶液、槐角苷對照品溶液、蘆丁對照品溶液、槐角對照藥材溶液、供試品溶液，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，展開，取出，晾干，噴以1%三氯化鋁乙醇溶液，置紫外燈下365 nm下檢視。結(jié)果顯示，空白溶劑對色譜鑒別無干擾，供試品色譜中在與對照品色譜、對照藥材色譜相應(yīng)位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，說明該方法專屬性好。見圖1。

注：從左至右依次為空白對照；槐角苷對照品；蘆丁對照品；槐角對照藥材；槐角配方顆粒(SY1806001)

點(diǎn)樣量考察：按照擬定的薄層鑒別方法，取對照品溶液5 μL、對照藥材溶液0.5 μL，供試品溶液3 μL、4 μL、5 μL、6 μL、7 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，展開，取出，晾干，噴以1%三氯化鋁乙醇溶液，置紫外燈下365 nm下檢視。由供試品溶液不同點(diǎn)樣量的薄層色譜圖可知，點(diǎn)樣3 μL時主斑點(diǎn)較清晰，且分離度較好，故確定本品供試品溶液的點(diǎn)樣量為3 μL。見圖2。

注：從左至右依次為槐角苷對照品；蘆丁對照品；槐角對照藥材；槐角配方顆粒(SY1806001)3 μL；槐角配方顆粒(SY1806001)4 μL；槐角配方顆粒(SY1806001)5 μL；槐角配方顆粒(SY1806001)6 μL；槐角配方顆粒(SY1806001)7 μL。

耐用性考察：不同薄層板比較：選取青島海洋化工廠分廠預(yù)制硅膠G板、天津思利達(dá)科技有限公司可剪裁型薄層層析板(硅膠G板)，分別按擬定的試驗(yàn)方法試驗(yàn)。分析比較不同薄層板展開的薄層色譜圖，結(jié)果表明在已選定的薄層色譜條件下，不同薄層板均能達(dá)到鑒別目的。見圖3、圖4。

圖3 青島海洋硅膠G板下薄層色譜

注：從左至右依次為槐角苷對照品；蘆丁對照品；槐角對照藥材；槐角配方顆粒(SY1806001)

不同溫度比較：取點(diǎn)樣后的薄層板，分別在低溫8 ℃和常溫25 ℃的溫度環(huán)境下進(jìn)行展開。結(jié)果表明，在8 ℃和25 ℃環(huán)境中展開的薄層色譜圖各主斑點(diǎn)清晰，且分離度較好；均可達(dá)到鑒別目的，故該薄層鑒別方法在8～25 ℃耐用性良好。見圖5、圖6。

圖5 8 ℃下薄層色譜

注：從左至右依次為槐角苷對照品；蘆丁對照品；槐角對照藥材；槐角配方顆粒(SY1806001)

不同濕度比較：取點(diǎn)樣后的薄層板，分別在32%和75%的濕度環(huán)境下進(jìn)行展開。結(jié)果表明該方法對不同濕度的適應(yīng)性較好。見圖7、圖8。

圖7 32%濕度下色譜

注：從左至右依次為槐角苷對照品；蘆丁對照品；槐角對照藥材；槐角配方顆粒(SY1806001)

由圖7、圖8可知，該薄層展開在相對濕度32%和75%環(huán)境中主斑點(diǎn)清晰，分離度好，表明該方法在相對濕度32%～75%環(huán)境中耐用性良好。

2.1.3 方法驗(yàn)證 按上述方法分別對多批槐角配方顆粒樣品進(jìn)行薄層鑒別。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，上述薄層鑒別方法能夠?qū)苯桥浞筋w粒成品進(jìn)行有效鑒別，耐用性良好，可用于槐角配方顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究。見圖9。

注：從左往右依次為：混合對照品(槐角苷(上)、蘆丁(下))；槐角對照藥材；槐角配方顆粒SY1806001；槐角配方顆粒SY1806002；槐角配方顆粒SY1806003。

2.2 特征圖譜

2.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑(柱長為250 mm，內(nèi)徑為4.6 mm，粒度為5 μm)以乙腈為流動相A，以0.1%磷酸溶液為流動相B，按“表1”中的規(guī)定進(jìn)行梯度洗脫；柱溫為30 ℃；流速為1.0 mL/min；檢測波長為282 nm。理論塔板數(shù)按蘆丁峰計(jì)算應(yīng)不低于3 000。

表1 流動相梯度

2.2.2 參照物溶液的制備 取槐角對照藥材0.5 g，置具塞錐形瓶中，加入50%甲醇50 mL，密塞，超聲處理(功率600 W，頻率40 kHz)20 min，放冷，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，作為對照藥材參照物溶液。另取蘆丁對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含0.2 mg的溶液，作為對照品參照物溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 取槐角配方顆粒研細(xì)，取約0.1 g，置具塞錐形瓶中，加入50%甲醇50 mL，密塞，超聲處理(功率600 W，頻率40 kHz)20 min，放冷，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4 方法學(xué)考察 色譜峰指認(rèn)：供試品溶液的制備：按以上擬定的實(shí)驗(yàn)條件，制備槐角配方顆粒供試品溶液。

對照品參照物溶液的制備：取槐角苷、蘆丁對照品適量，加甲醇分別制成每1 mL各含0.2 mg的溶液，即得。

陰性對照溶液的制備：按以上擬定的實(shí)驗(yàn)條件，制備缺槐角配方顆粒陰性對照溶液。對槐角配方顆粒特征圖譜峰進(jìn)行定位。見圖10。

圖10 槐角配方顆粒特征圖譜色譜峰指認(rèn)

結(jié)果表明，峰8為蘆丁，峰12為槐角苷。在以下方法學(xué)考察中，對樣品圖譜中的12個峰進(jìn)行考察。

精密度試驗(yàn)：取槐角配方顆粒(批號：SY1806001)約0.1 g，按擬定實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行制備及測定，連續(xù)進(jìn)樣6次，每次10 μL，進(jìn)行測定。結(jié)果見表2、表3。

表2 精密度-特征峰相對保留時間

表3 精密度-特征峰相對峰面積

結(jié)果表明，各特征峰相對保留時間的RSD在0.01%～0.07%，各特征峰相對峰面積的RSD在0.15%～0.55%，說明該儀器精密度良好。

重復(fù)性考察：取槐角配方顆粒(批號：SY1806001)約0.1 g，稱定6份，按擬定實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行制備及測定。見表4、表5。

表4 重復(fù)性考察-特征峰相對保留時間比值

表5 重復(fù)性考察-特征峰相對峰面積比值

結(jié)果表明，各特征峰相對保留時間的RSD在0.01%～0.15%，各特征峰相對峰面積的RSD在0.50%～1.03%，說明該儀器重復(fù)性良好。

中間精密度考察：不同制備人員和不同制備時間考察：在以上擬定的實(shí)驗(yàn)條件基礎(chǔ)上，分別在不同人員(A、B)和不同時間(T1 、T2)條件下精密稱取槐角配方顆粒(批號：SY1806001)約0.1 g，按擬定實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行制備及測定。結(jié)果見表6、表7。

表6 不同人員與時間考察-特征峰相對保留時間比值

表7 不同人員與時間考察-特征峰相對峰面積比值

結(jié)果表明，不同樣品制備人員和不同樣品制備時間下，各特征峰相對保留時間的RSD在0.01%～0.09%，各特征峰相對峰面積的RSD在0.15%～1.78%，說明該方法適用性較好。

不同儀器考察：在以上擬定的實(shí)驗(yàn)條件基礎(chǔ)上，分別精密稱取槐角配方顆粒(批號：SY1806001)兩份，制備供試品溶液，分別在島津LC-2040C、島津LC-30AD、安捷倫1260型高效液相色譜儀上進(jìn)行測定。計(jì)算所得結(jié)果，見表8、表9和圖11。

表8 不同儀器考察-特征峰相對保留時間比值

表9 不同儀器考察-特征峰相對峰面積比值

圖11 不同儀器考察

結(jié)果表明，用上述3種儀器對供試品進(jìn)行檢測時，各特征峰相對保留時間的RSD為0.21%～1.72%，各特征峰相對峰面積的RSD為2.09%～29.70%。

耐用性考察：色譜柱耐用性考察：在以上擬定的實(shí)驗(yàn)條件基礎(chǔ)上，分別對色譜柱為Agilent TC-C18250 mm×4.6 mm、Inertsustain C185 μm 4.6 mm×250 mm、Waters XBridge C185 μm 4.6 mm×250 mm進(jìn)行考察。見圖12和表10、表11。

圖12 槐角配方顆粒色譜柱耐用性考察

表10 色譜柱耐用性考察-特征峰相對保留時間

表11 色譜柱耐用性考察-特征峰相對峰面積比值

結(jié)果表明，由表10、表11可知，用上述3種色譜柱對樣品進(jìn)行檢測時，各特征峰相對保留時間的RSD為0.17%～5.60%，各特征峰相對峰面積的RSD為5.74%～53.83%，說明本方法具有適用性。由圖31可知，Agilent TC-C18色譜柱分離度較差，其將峰4和峰5合并為了一個峰，Waters XBridge C18色譜柱可以將12個特征峰分離出來，Waters XBridge C18色譜柱和Inertsustain C18色譜柱峰1和峰2錯位，不利于特征峰的鑒定。Inertsustain C18色譜柱可以將12個特征峰有效分離，且色譜信息豐富，故該特征圖譜方法推薦使用Inertsustain C18色譜柱。

24 h穩(wěn)定性考察：在以上擬定的實(shí)驗(yàn)條件基礎(chǔ)上，取同一供試品溶液，分別于0 h、2 h、6 h、10 h、16 h、24 h測定。見表12、表13。

表12 24 h穩(wěn)定性考察-特征峰保留時間

表13 24 h穩(wěn)定性考察-特征峰峰面積比值

結(jié)果表明，其相對應(yīng)的特征峰相對保留時間的RSD為0.01%～0.12%，特征峰相對峰面積的RSD為0.30%～2.64%，說明樣品溶液在24 h內(nèi)較穩(wěn)定。

2.2.5 測定 采用擬定的方法分別對3批槐角配方顆粒進(jìn)行測定，計(jì)算相對保留時間和相對峰面積。見圖13和表14、表15。

圖13 槐角配方顆粒特征圖譜

表14 3批槐角配方顆粒相對保留時間

由圖13、表14、表15可知，該特征圖譜方法能夠?qū)苯桥浞筋w粒進(jìn)行有效檢測，故該方法可用于槐角配方顆粒的研究。

根據(jù)相對保留時間穩(wěn)定及各批次樣品均能檢出且峰相對較高的原則，共選擇了12個重復(fù)性較好的峰作為特征峰。結(jié)果表明，3批次槐角配方顆粒各特征峰相對峰面積RSD差異太大，因此不納入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究。3批次槐角配方顆粒12個特征峰相對保留時間RSD均小于1.0%。最終規(guī)定：供試品特征圖譜中應(yīng)呈現(xiàn)12個特征峰，與蘆丁參照物相應(yīng)的峰為S峰，計(jì)算各特征峰與S峰的相對保留時間，其相對保留時間應(yīng)在規(guī)定值的±5%之內(nèi)。規(guī)定值為：0.34(峰1)、0.35(峰2)、0.68(峰3)、0.70(峰4)、0.71(峰5)、0.84(峰6)、0.95(峰7)、1.00(峰8，S)、1.17(峰9)、1.22(峰10)、1.36(峰11)、1.41(峰12)。

采用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2012版)對3批次槐角配方顆粒進(jìn)行合成，建立了槐角配方顆粒特征圖譜的對照圖譜。見圖14。

注：峰(8，S)：蘆丁

3 討論

3.1 薄層色譜鑒別方法

《中國藥典》2015年版一部“槐角”項(xiàng)下無薄層色譜鑒別，只規(guī)定按照“含量測定”項(xiàng)下的方法試驗(yàn)，供試品色譜中應(yīng)呈現(xiàn)出與對照品色譜峰保留時間相一致的色譜峰，該方法僅能鑒定槐角中槐角苷單一成分，信息不夠全面[1]?，F(xiàn)代研究表明黃酮及異黃酮類化合物是槐角的主要有效成分，槐角苷為槐角異黃酮類化合物的代表性成分，蘆丁為槐角黃酮類化合物的代表性成分，兩者具有降血壓、抗生育和抗癌作用，能較好地防治骨質(zhì)疏松[8]。本實(shí)驗(yàn)采用槐角苷、蘆丁和槐角對照藥材同時作為槐角配方顆粒薄層鑒別的對照，使方法具有科學(xué)性，色譜信息更具全面性。

展開劑是薄層色譜鑒別的關(guān)鍵影響因素，為了獲得較好的分離效果，本實(shí)驗(yàn)考察了兩種展開系統(tǒng)，分別為乙酸乙酯-甲酸-水(8∶1∶1)和乙酸乙酯-甲酸-甲醇(8∶2∶1)，結(jié)果顯示在展開系統(tǒng)乙酸乙酯-甲酸-水(8∶1∶1)條件下，對照品、對照藥材、供試品斑點(diǎn)清晰、色譜信息量大、分離度好、Rf值適當(dāng)。

另外，本實(shí)驗(yàn)還考察了甲醇和水作提取溶媒，回流和超聲兩種提取方法，最終確定供試品制備方法為：以甲醇為溶劑，超聲提取。薄層色譜方法學(xué)考察結(jié)果顯示槐角配方顆粒薄層鑒別方法，具有斑點(diǎn)清晰、承載信息量大、專屬性強(qiáng)、操作簡便等優(yōu)點(diǎn)，可用于槐角配方顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究。

3.2 特征圖譜方法的建立

在質(zhì)量控制評價方面，現(xiàn)行的中藥配方顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)多采用對某有效成分進(jìn)行含量測定，而中藥是多成分的整體作用，且由于中藥配方顆粒是經(jīng)過多工序加工而成，失去原有飲片的形態(tài)，在質(zhì)量控制上缺少飲片性狀等重要指標(biāo)，僅靠某有效成分的含量測定無法全面反映配方顆粒質(zhì)量效果，因此在質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)制定中必須加強(qiáng)專屬性鑒別和整體性質(zhì)量控制[9-10]。本研究前期對提取溶劑(50%甲醇，70%甲醇，水)、提取方法(回流，超聲)、提取時間(20 min，30 min，40 min)等進(jìn)行了考察。結(jié)果表明，在相同的色譜條件下，50%甲醇超聲提取20 min制備的供試品，色譜峰信息量大、分離度好。特征圖譜方法學(xué)結(jié)果顯示該方法操作簡便，穩(wěn)定性及重現(xiàn)性良好，能較全面地反映槐角配方顆粒的化學(xué)成分系統(tǒng)，可為槐角配方顆粒的整體質(zhì)量評價提供技術(shù)支撐。