朱曉東,張佳佳,王 瑩,蘭 衛(wèi)
(1.新疆醫(yī)科大學(xué)烏魯木齊市中醫(yī)醫(yī)院,新疆 烏魯木齊830011;2.新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院, 新疆 烏魯木齊 830002;3.新疆醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院,新疆 烏魯木齊 830011)
消渴健脾膠囊是由葛根、白術(shù)、大黃、車前子、茯苓、蒼術(shù)、茵陳、梔子、丹參、土茯苓、萊菔子、厚樸、木瓜等十三味藥材組成的復(fù)方制劑,具有健脾燥濕、行氣和胃、祛濁化郁的功效。梔子具有利膽、鎮(zhèn)痛、降壓和抑菌抗炎的功效[1],其主要成分有梔子苷、梔子苷酸、京尼平等[2]。研究表明,梔子苷具有抑菌[3]、利膽[4]、鎮(zhèn)痛[5]、保肝[6]、消炎[7]等作用。
消渴健脾膠囊中的蒼術(shù)、茵陳、梔子、丹參、土茯苓、萊菔子、厚樸、木瓜等八味藥材采用水提取,葛根、白術(shù)、大黃、車前子、茯苓等五味藥材粉碎。水提取的藥材中梔子苷等成分為水溶性,具有較強的生物活性,故以梔子苷含量為提取工藝的評價指標(biāo)。
作者采用單因素實驗和正交實驗優(yōu)化消渴健脾膠囊中梔子苷的提取工藝,以最大程度保留梔子苷成分,從而保證消渴健脾膠囊的藥效。
葛根、白術(shù)、大黃、車前子、茯苓、蒼術(shù)、茵陳、梔子、丹參、土茯苓、萊菔子、厚樸、木瓜,購自安徽亳州中藥材飲片有限公司,經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)姚藍副教授鑒定。
梔子苷標(biāo)準(zhǔn)品(批號:110749-200309),中國藥品生物制品檢定所;乙腈,色譜純,Sigma公司;超純水。
Agilent 1200-DAD型高效液相色譜儀,美國安捷倫科技有限公司;KQ-200KD型數(shù)控超聲波清洗器,昆山超聲儀器有限公司;AL204型電子分析天平,梅特勒-托利多儀器有限公司;HH-S4型數(shù)顯恒溫水浴鍋,金壇醫(yī)療儀器廠;DL-1型電子萬用爐,北京永光明醫(yī)療儀器廠。
1.2.1 梔子苷標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備
精密稱取梔子苷標(biāo)準(zhǔn)品0.62 mg,用甲醇定容于10 mL容量瓶中,得0.062 mg·mL-1梔子苷標(biāo)準(zhǔn)溶液。
1.2.2 梔子苷的提取
稱取蒼術(shù)23.0 g、茵陳23.0 g、梔子13.8 g、丹參23.0 g、土茯苓23.0 g、萊菔子34.5 g、厚樸13.8 g、木瓜34.5 g,加入一定量水浸泡30~60 min,煎煮2次,每次45 min,過濾,合并濾液,即得梔子苷提取液。
分別采用單因素實驗和正交實驗優(yōu)化梔子苷提取工藝條件。
1.2.3 供試溶液的制備
將梔子苷提取液濃縮定容至200 mL容量瓶中。取1 mL濃縮液用超純水定容至10 mL容量瓶中,搖勻,經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后,取續(xù)濾液作為供試溶液。
1.2.4 色譜條件與梔子苷含量的測定
色譜柱為Column XB C18(250 mm×4.6 mm,5 μm),流動相為乙腈-水(15∶85,體積比,下同),柱溫為30 ℃,流速為1.0 mL·min-1,檢測波長為238 nm,進樣量為10 μL。
分別精密吸取梔子苷標(biāo)準(zhǔn)溶液與供試溶液各10 μL,注入高效液相色譜儀進行分析,測定梔子苷含量。消渴健脾膠囊按干燥品計算,梔子苷含量不得少于1.8%[8]。 梔子苷標(biāo)準(zhǔn)溶液和供試溶液的高效液相色譜圖見圖1。
圖1 梔子苷標(biāo)準(zhǔn)溶液(a)和供試溶液(b)的高效液相色譜圖
2.1.1 煎煮時間對梔子苷含量的影響
將藥材按加水量10倍加水浸泡30~60 min,分別煎煮30 min、45 min、60 min、90 min,煎煮2次,測定梔子苷含量,結(jié)果見圖2。
從圖2可以看出,煎煮45 min時,梔子苷含量最高。
2.1.2 加水量對梔子苷含量的影響
將藥材分別按加水量8倍、10倍、12倍、16倍加水浸泡30~60 min,煎煮2次,每次45 min,測定梔子苷含量,結(jié)果見圖3。
圖2 煎煮時間對梔子苷含量的影響
從圖3可以看出,加水量10倍時,梔子苷含量最高。
2.1.3 煎煮次數(shù)對梔子苷含量的影響
圖3 加水量對梔子苷含量的影響
將藥材按加水量10倍加水浸泡30~60 min,分別煎煮1次、2次、3次、4次,每次45 min,測定梔子苷含量,結(jié)果見圖4。
圖4 煎煮次數(shù)對梔子苷含量的影響
從圖4可以看出,煎煮2次,梔子苷含量最高。
以梔子苷含量為評價指標(biāo),以煎煮次數(shù)(A)、煎煮時間(B)和加水量(C)為考察因素,采取L9(34)正交實驗進行梔子苷提取實驗,因素與水平見表1,正交實驗的結(jié)果與分析見表2,方差分析見表3。
表1 正交實驗的因素與水平
從表2、3可以看出,以梔子苷含量為評價指標(biāo)時,直觀分析結(jié)果顯示3個因素對提取工藝影響的順序為:煎煮次數(shù)>加水量>煎煮時間;方差分析顯示,煎煮次數(shù)對梔子苷含量有極顯著性影響,加水量對梔子苷含量有顯著性影響,煎煮時間對梔子苷含量無顯著性影響。因此,確定最佳提取工藝條件為A2B1C2,即加水量10倍、煎煮2次、每次30 min。
表2 正交實驗的結(jié)果與分析
表3 正交實驗的方差分析
在最佳提取工藝條件下,平行煎煮藥材3份,測得梔子苷含量(mg·g-1)分別為0.279、0.286、0.281,平均值為0.282 mg·g-1,RSD值為1.28%。
經(jīng)過驗證實驗,現(xiàn)提取工藝與原工藝(加水量10倍、煎煮2次、每次45 min)相比,提取的梔子苷含量相當(dāng),無顯著差異?,F(xiàn)提取工藝煎煮時間短,減少了高溫對梔子苷的損耗。
煎藥用水應(yīng)選用潔凈澄清、無異味、雜質(zhì)及礦物質(zhì)含量少的水,一般生活飲用水即可。加水量應(yīng)視藥材的質(zhì)地、吸水量的多少、煎煮過程中的蒸發(fā)量及煎煮后所需的藥液量進行綜合考慮。加水量過少,藥材的有效成分不易煎出;加水量過多則煎煮時間勢必延長,使部分成分散失甚至破壞,正如《本草綱目》所云:“劑多水少,則藥味不出;劑少水多,又煎耗藥力”。實際應(yīng)用時,一般加水量為將飲片適當(dāng)加壓后,液面高出飲片約2 cm為宜。
中藥材大多是干燥品,有效成分多沉積于干涸、皺縮的藥材組織內(nèi),為了縮短煎煮時間,便于有效成分的煎出,通常煎煮前須加水浸泡30~60 min,煎煮過程中應(yīng)根據(jù)藥材的質(zhì)地和藥物的性質(zhì),控制火候及時間。一般煎藥宜先“武”后“文”,即用大火使藥液盡快沸騰, 然后改用小火保持微沸狀態(tài)30 min[9]。
本實驗選擇HPLC流動相時,首先采用了曲琰等[10]的條件,流動相為乙腈-水(13∶87),流速1.0 mL·min-1,檢測波長238 nm。然后,采用了賀鵬等[11]的條件,流動相為乙腈-水(15∶85),柱溫40 ℃,流速0.7 mL·min-1,進樣量5 μL;康艷萍等[12]的條件,流動相為甲醇-水(25∶75),流速:泵A 0.25 mL·min-1、泵B 0.75 mL·min-1,檢測波長240 nm,進樣量20 μL;王謙等[13]的條件,流動相為乙腈-水(10∶90),流速1.0 mL·min-1,柱溫25 ℃;朱慧慧等[14]的條件,流動相為甲醇-水(30∶70),流速1.0 mL·min-1,柱溫25 ℃,檢測波長240 nm,進樣量10 μL。以上條件都存在不出峰、分離度不達標(biāo)、色譜圖不達標(biāo)等問題,不適于消渴健脾膠囊中梔子苷含量測定。
本實驗確定的色譜條件:色譜柱為Column XB C18(250 mm×4.6 mm,5 μm),流動相為乙腈-水(15∶85),柱溫為30 ℃,流速為1.0 mL·min-1,檢測波長為238 nm,進樣量為10 μL。在此色譜條件下,色譜圖達標(biāo),分離度及理論塔板數(shù)良好。
消渴健脾膠囊中的蒼術(shù)、茵陳、梔子、丹參、土茯苓、萊菔子、厚樸、木瓜等八味藥材采用水提取梔子苷。以梔子苷含量為評價指標(biāo),利用HPLC法測定梔子苷含量,采用單因素實驗和正交實驗優(yōu)化梔子苷提取工藝條件。確定優(yōu)化的提取工藝條件為:加水量10倍、煎煮2次、每次30 min,在此條件下,梔子苷含量為0.282 mg·g-1,正交實驗結(jié)果與驗證實驗結(jié)果一致。該提取工藝穩(wěn)定、可靠、可行,可為消渴健脾膠囊中梔子苷含量測定和質(zhì)量控制提供依據(jù)。