寒蔥咀嚼片的制備及其對肝損傷小鼠轉(zhuǎn)氨酶活性的影響

韓 蕊， 王思涵， 張 先， 李范洙

(延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉 133002)

寒蔥(Allium Victorialis L.)學(xué)名茖蔥，別名旱蔥、鹿耳蔥，為百合科多年生草本植物[1]，多鱗莖長橢圓形，鱗莖皮成絲網(wǎng)狀，葉具長柄，長卵形或長橢圓形，全緣，質(zhì)軟而平滑，稍帶粉白色，平行脈。主要分布在東北的長白山地區(qū)和大小興安嶺，生于陰濕山坡、林下、草地或溝邊，地上部植株可供食用[2]，具備獨特的大蒜、韭菜和大蔥等風(fēng)味，作為山野菜鮮食或做成腌制菜被廣為食用。

寒蔥營養(yǎng)豐富，鮮葉中蛋白質(zhì)含量約4%，Vc含量250 mg/100g，脂肪含量0.4 mg/100g，還含有豐富的礦物質(zhì)[3-5]。且寒蔥中含有多種活性成分，主要為含硫化合物、黃酮類化合物、甾體化合物、皂苷等[6]，對寒蔥提取物或活性成分功能性研究結(jié)果表明，寒蔥具有良好的抗氧化和抗菌活性[7-9]、抗動脈硬化[10]、降血脂和降膽固醇作用[11]，并且黃翠菊[12]研究發(fā)現(xiàn)，寒蔥提取物對酒精導(dǎo)致的小鼠肝損傷具有良好的保護作用。雖然對寒蔥化學(xué)成分及活性研究有了一定的進展，但對寒蔥深加工方面的研究寥寥無幾。該文探討了利用寒蔥提取物制備咀嚼片的工藝，并進一步研究了寒蔥咀嚼片對急性肝損傷的輔助保護作用，為寒蔥保健食品的開發(fā)提供有效的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

1) 寒蔥 于2018年采自吉林省延邊地區(qū)的野生寒蔥；乳糖、糊精、甘露醇、MCC均為食品級。

2) 雄性小鼠 33只昆明鼠，月齡約4月，體重(28±4.5) g，購于吉林省延邊大學(xué)動物飼養(yǎng)中心。將小鼠飼養(yǎng)在干凈、環(huán)境適宜的代謝籠里，溫度保持在22 ～26 ℃，濕度約40%～50%，自然光照，定期更換便料，自由飲食。

3) 試劑 蘆丁、槲皮素、山奈酚標(biāo)準(zhǔn)品、色譜級甲醇購自sigma 公司；ALT試劑盒、AST試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；水飛薊素購自湖南千金協(xié)力藥業(yè)有限公司；四氯化碳購自天津格里斯醫(yī)藥化學(xué)技術(shù)有限公司。

1.2 主要儀器與設(shè)備

1) HP 1100高效液相色譜系統(tǒng) 配有可變波長紫外檢測器和Rev.A.06.03色譜工作站，美國惠普公司。

2) 質(zhì)構(gòu)儀 TMS-PR，美國FTC公司。

3) 片劑脆碎度測定儀 CS-2，天津天河分析儀器有限公司。

1.3 寒蔥提取物的制備

取寒蔥鮮葉1 kg，用15 L蒸餾水浸泡24 h后回流提取2 h，過濾；過濾后的濾渣加入10 L蒸餾水中2次回流提取1 h，過濾；所得濾渣加入5 L蒸餾水中再次回流提取30 min，過濾；合并3次濾液，減壓濃縮至浸膏狀，將所得浸膏冷凍干燥，粉碎，過120目篩備用。

1.4 寒蔥提取物中黃酮類物質(zhì)含量的測定

1) 色譜條件 色譜柱：C18柱(4.6 mm×250 mm, 5 μm)；流動相：0.3%磷酸-甲醇(35∶65)；檢測波長：360 nm；流速：1 mL/min；循環(huán)時間：40 min；進樣量：10 μL；柱溫：40℃。

2) 供試溶液制備 蘆丁、槲皮素和山奈酚標(biāo)準(zhǔn)品用色譜級甲醇溶液配制成1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液待測。精密秤取寒蔥提取物100 mg，加入1 mL色譜級甲醇超聲加熱溶解，待冷卻，離心后過0.45 μm的微孔濾膜，得到供試樣品溶液。

1.5 寒蔥咀嚼片制備工藝研究

1) 咀嚼片制備工藝流程 該試驗采用濕法制粒的方法制備咀嚼片[13-15]，在原輔料經(jīng)潤濕劑70%乙醇粘合后進行濕法制粒。制備工藝流程如下：

寒蔥粉、填充劑→混合→制濕?！稍铩！鷫浩善?/p>

2) 咀嚼片填充劑種類和比例的篩選 在預(yù)實驗的基礎(chǔ)上，選取的填充劑以乳糖為主，并用糊精或者MCC(微晶纖維素)作為復(fù)配。該實驗中，控制寒蔥提取物的添加量為10%，其余部分用填充劑按照不同的比例補足[16]。

3) 寒蔥提取物添加量的篩選 寒蔥提取物為黃褐色，寒蔥的特征味濃郁，黏性較大，在使用過程中需考察其用量。主要通過感官評價以及硬度指標(biāo)，篩選出寒蔥提取物的適宜添加量。

4) 甘露醇添加量的篩選 為掩蓋寒蔥提取物的刺激性氣味，增強寒蔥提取物咀嚼片的可食性，添加一定量的甘露醇，用于調(diào)整咀嚼片的口感味道。通過感官評價以及硬度指標(biāo)，確定適宜的添加量。

5) 殺菌工藝的研究 采用微波、紫外線、臭氧及其復(fù)配的處理，對壓片前的顆粒進行殺菌處理，同時設(shè)置空白處理組，測定咀嚼片的菌落總數(shù)和大腸菌群數(shù)。

6) 咀嚼片的質(zhì)量檢查 按照中國藥典的相應(yīng)規(guī)定對咀嚼片的片重差異限度、硬度和脆碎度進行測定。

7) 指標(biāo)的測定方法 ①硬度的測定：用質(zhì)構(gòu)儀測定片劑硬度。具體參數(shù)如下:預(yù)測試速度1 mm/s；觸發(fā)力5.0 g；測試速度2 mm/s；返回速度5.0 mm/ s；測試距離1 mm；測試周期1。②休止角的測定：取壓片前的顆粒5 g，自具0.75 cm小孔的漏斗中距平板玻璃平面10 cm高度落于玻璃平面上，測定堆積高度(H)和堆積半徑(r)，并按tanφ=H/r求出休止角φ，以φ表示顆粒的流動性，φ ≤30°且φ愈小，流動性愈好[17]。③片重差異限度測定：隨機取10片寒蔥咀嚼片，用分析天平精確稱每片的質(zhì)量，即片重差異= (每片片重-平均片重) /平均片重×100%。 ④脆碎度的測定：取若干片咀嚼片使其總重約為6.5 g，用吹風(fēng)機吹去片劑脫落的粉末，精密稱重，置片劑脆碎度測定儀筒中，轉(zhuǎn)動100次。取出，同法除去粉末，精密稱重, 計算減失重量百分比[18]，即為脆碎度。⑤菌落總數(shù)和大腸菌群數(shù)的測定：按照GB4789.2-2010和GB4789.3-2010中的方法分別測定菌落總數(shù)和大腸菌群數(shù)。

8) 感官評價方法及標(biāo)準(zhǔn) 由從事食品專業(yè)的人員組成10人評定小組，主要針對寒蔥咀嚼片口感、味道、組織形態(tài)進行評定[19]，評分標(biāo)準(zhǔn)如表1所示，按照相應(yīng)權(quán)重計算感官評分，取平均值。

表1 寒蔥咀嚼片感官品質(zhì)評分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Sensory quality scoring standards for Allium Victorialis chewable tablets

1.6 寒蔥咀嚼片肝保護作用研究

1.6.1 小鼠急性肝臟損傷模型的建立

將雄性小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d，之后隨機把33只小鼠分為正常組(n=5)、模型組(n=10)、陽性組(n=9)、咀嚼片組(n=9)。每天早上8點對小鼠經(jīng)口灌胃，正常組與模型組每日灌胃等體積的生理鹽水，陽性組、咀嚼片組灌胃劑量分別為0.1 g/kg·d和3 g/kg·d，連續(xù)灌胃30 d后，除正常組外其余各組腹腔注射10%四氯化碳2 mL/kg[20]。陽性組所用藥物為水飛薊素。

1.6.2 小鼠肝臟系數(shù)的測定

腹腔注射四氯化碳16 h后，對各組小鼠經(jīng)眼球取血后，頸椎脫臼處死小鼠，迅速取出肝臟，置于4 ℃生理鹽水中洗去殘血并除去表面結(jié)締組織，濾紙吸凈表面水分后，采用精密天平稱取各組織濕重并記錄；稱重之后，部分肝臟浸泡于10%的甲醛中，部分冷存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

肝臟系數(shù)計算方法：肝臟系數(shù)=肝臟重量/體重×100%

1.6.3 小鼠血清中轉(zhuǎn)氨酶活性的測定

1) 血清的采集 腹腔注射16 h后，對各組小鼠進行摘除眼球取血，采血時間為上午9:00～11:00。每只采血量5～10 mL,靜置4 h以上，待血液凝固、纖維蛋白收縮后于15 mL離心管中，利用離心機在4 000 r/min條件下離心10 min，取上層血清約1 mL，平均分放在4個EP管，貼好標(biāo)簽，最后將血清樣本儲藏于-20 ℃冰箱。

2) 轉(zhuǎn)氨酶活性的檢測 血清中的谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)的測定按照Elisa試劑盒說明書進行操作。

1.6.4 小鼠肝臟組織形態(tài)的觀察

將各組小鼠肝臟取出清洗后，先放在培養(yǎng)皿的中心，然后把培養(yǎng)皿放在標(biāo)準(zhǔn)紙上，讓培養(yǎng)皿與已標(biāo)定的兩條互相垂直的線相切，然后進行拍照，每個樣品拍3張照片。

1.6.5 小鼠肝臟組織病理的觀察

各組小鼠肝臟先放入10%的甲醛溶液里浸泡4 d，浸泡后肝臟組織切成3 mm2大小，脫水，利用石蠟包埋機完成灌蠟操作，然后切片機切成5 μm薄片，最后進行HE染色。制作好的肝臟切片置入光學(xué)顯微鏡(Ti2，日本尼康公司)下觀察即可。

1.7 試驗數(shù)據(jù)分析

實驗數(shù)據(jù)用Graphab Prism program5.0的軟件處理，采用Column方法進行數(shù)據(jù)間的顯著性分析，以*(P<0.05)、**(P<0.01)、***(P<0.001)表示顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 寒蔥提取物中黃酮類化合物的含量

黃酮類化合物是植物源天然次生代謝產(chǎn)物, 是蔥屬植物中的一種重要的生物活性物質(zhì)，蔥屬黃酮以蘆丁、槲皮素與山奈酚為主[21]。因此采用HPLC法對寒蔥提取物中黃酮類化合物進行了分析。由圖1可以看出，在寒蔥提取物中檢測出蘆丁、槲皮素、山萘酚這3種成分，這3種物質(zhì)的含量分別為4.997、0.695和2.481 μg/g，蘆丁含量最多，其次是山奈酚，槲皮素含量最低(表2)。

圖1 寒蔥提取物與蘆丁、槲皮素、山奈酚標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜分析圖Fig.1 The chromatographic analysis diagram of the extract of Allium Victorialis and the standard solution of rutin, quercetin and kaem pferol

表2 寒蔥提取物中黃酮類物質(zhì)含量

2.2 寒蔥咀嚼片的制備

2.2.1 填充劑的篩選

該試驗中選用寒蔥提取物為原料進行咀嚼片的制備，由于寒蔥提取物經(jīng)水提取，濃縮，干燥，其形態(tài)和成分發(fā)生了較大的改變，因此需要篩選適宜的填充劑種類及其比例。首先，選取乳糖和糊精進行復(fù)配作為填充劑使用，由表3可以看出，隨著乳糖比例的減少，即糊精比例的增加，咀嚼片的硬度逐漸提高，但是在乳糖和糊精比例達(dá)到1∶1時，顆粒的休止角超過了30°，這說明乳糖的比例降低，所制得的顆粒流動性較差，在加工過程中，出現(xiàn)粘沖的現(xiàn)象。這是因為寒蔥水提物本身有粘性，加上糊精的吸水性較好，在加工過程中，兩者粘合性過強，導(dǎo)致片劑硬度過大，顆粒流動性較差。為了改善加工過程中粘沖的現(xiàn)象，調(diào)整糊精的比例，引入MCC進行3者復(fù)配。通過表3可以看出，由于糊精比例的下降，咀嚼片的硬度和顆粒的流動性都有了改善，但是在加工過程中，仍然存在有粘沖的現(xiàn)象，因此舍棄糊精，僅使用乳糖和MCC復(fù)配作為填充劑。調(diào)整乳糖和MCC比例時，咀嚼片的硬度為43.1～50.3 N，顆粒的休止角為30°以下，均在適宜的范圍，但是隨著乳糖比例的下降片劑的硬度有所提高，顆粒的流動性有所下降，因此，選取乳糖和MCC比例為2∶1作為適宜的填充劑復(fù)配比例來使用。

表3 寒蔥咀嚼片填充劑種類和比例的篩選

2.2.2 寒蔥提取物添加量的選擇

寒蔥水提物為黃褐色粉末，有較強的寒蔥刺激性氣味，且粘度較大，因此，寒蔥提取物的添加量不宜過高。從表4中可以看出，隨著寒蔥提取物比例的升高，咀嚼片的硬度逐漸升高，在寒蔥提取物用量為20%時，咀嚼片的硬度已經(jīng)超出了適宜的范圍，且出現(xiàn)了粘沖的現(xiàn)象。對咀嚼片進行感官評價結(jié)果，寒蔥提取物添加量超過10%，其感官評分降低，因此，確定寒蔥提取物適宜的添加量為10%。

表4 寒蔥提取物添加量對咀嚼片品質(zhì)的影響

2.2.3 甘露醇添加量的篩選

從表5可以看出，隨著甘露醇添加量的增多，咀嚼片的硬度有所增加，但是都處于適宜的范圍中，但是感官品質(zhì)有差異。當(dāng)甘露醇添加量為4%時，就達(dá)到了較好的矯味效果，感官評分達(dá)到最大值4.38，因此選取4%為甘露醇的適宜添加量。

通過試驗，確定利用寒蔥提取物制備咀嚼片的適宜配方為：寒蔥提取物10%，乳糖57.3%，MCC 28.7%，甘露醇4%。

表5 甘露醇添加量對寒蔥咀嚼片品質(zhì)的影響

2.2.4 寒蔥咀嚼片殺菌工藝的研究

該試驗中選擇對壓片前的顆粒進行殺菌處理，再對處理后的顆粒進行壓片操作，最后對所制得的咀嚼片進行微生物指標(biāo)的測定。從表6中可以看出，在微波單獨處理15 s的條件下，殺菌效果較差，使用紫外線長時間處理或者紫外線與微波復(fù)合處理，殺菌效果有了較大的提升，但是仍然沒有得到很好的效果，菌落總數(shù)超過《GB16740-2014保健食品》中的限量要求。采用紫外線輻照與臭氧熏制復(fù)合處理，在無菌和自然條件下壓片，菌落總數(shù)都<600 CFU/g，達(dá)到了理想的效果。在實驗所得的咀嚼片中，均未檢出大腸菌群。

表6 殺菌方法對寒蔥咀嚼片殺菌效果的影響

2.2.5 寒蔥咀嚼片的質(zhì)量檢查

按照中國藥典的相關(guān)規(guī)定對咀嚼片進行質(zhì)量和脆碎度的檢查，所制得咀嚼片的片重差異為1.7%，小于藥典規(guī)定的5.0%，檢驗結(jié)果為合格。經(jīng)脆碎度測定處理后，咀嚼片失重為0.2%，小于藥典規(guī)定的1%，沒有檢出斷裂、龜裂及粉碎的片，不用進行復(fù)檢，檢驗結(jié)果為合格。

2.3 寒蔥咀嚼片肝保護輔助功能

2.3.1 寒蔥咀嚼片對CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝臟系數(shù)的影響

臟器重量的變化可作為粗略反映生物體器官是否正?；蛩ダ铣潭鹊闹笜?biāo)，肝臟重量的降低會直接影響動物的生長發(fā)育。由圖2可知，模型組小鼠的肝臟系數(shù)極顯著低于正常組，說明CCl4嚴(yán)重?fù)p傷了小鼠肝臟，但是經(jīng)過寒蔥咀嚼片灌胃處理的小鼠肝臟系數(shù)顯著高于模型組，且與陽性組無顯著差異。由此可以看出寒蔥咀嚼片對急性肝損傷小鼠的肝臟組織具有保護作用，并且其效果相當(dāng)于水飛薊素。

注：*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001。

2.3.2 寒蔥咀嚼片對CCl4誘導(dǎo)的小鼠血清中轉(zhuǎn)氨酶活性的影響

轉(zhuǎn)氨酶是催化氨基酸與酮酸之間氨基轉(zhuǎn)移的一類酶，其中ALT和AST是最常見的兩種酶，而肝臟損傷往往表現(xiàn)為ALT和AST的活性異常[22]，導(dǎo)致血清中的活性升高。寒蔥咀嚼片對小鼠血清中ALT和AST活性的影響如圖3所示。模型組小鼠血清中的ALT和AST活性顯著高于正常組，說明小鼠肝臟被CCl4損傷。而咀嚼片組血清中ALT和AST的活性顯著低于模型組，可得出寒蔥咀嚼片能夠有效抑制被CCl4誘導(dǎo)的小鼠血清中ALT和AST活性。咀嚼片組小鼠血清中ALT的活性與陽性組無顯著性差異，AST活性也與陽性組無顯著差異，但略低于陽性組，證明寒蔥咀嚼片對被CCl4誘導(dǎo)的小鼠血清中ALT和AST活性的抑制效果相當(dāng)于水飛薊素處理的效果。

2.3.3 寒蔥咀嚼片對CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝臟組織形態(tài)的影響

小鼠肝臟組織形態(tài)觀察結(jié)果如圖4所示，該結(jié)果顯示，正常組小鼠肝臟邊緣銳利、呈深紅色、表面有光澤、質(zhì)地柔軟、富有彈性。模型組的小鼠肝臟出現(xiàn)彌漫性腫大的現(xiàn)象，肝臟質(zhì)地較差，毫無彈性，表面粗糙，沒有光澤，肝臟表面可見乳白色顆粒狀物質(zhì)，可能為壞死細(xì)胞。咀嚼片組與模型組相比，肝臟色澤變得更紅，質(zhì)地更加柔軟，富有彈性，表面光滑，肝臟表面未見乳白色顆粒。通過圖4-C、D可以看出，咀嚼片組小鼠的肝臟色澤、彈性、質(zhì)地略優(yōu)于陽性組，呈現(xiàn)出正常的暗紅色光澤，其狀態(tài)基本接近于正常組。

注：*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001。

A：正常組；B：模型組；C：咀嚼片組；D：陽性組

2.3.4 寒蔥咀嚼片對CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝臟組織病理學(xué)的影響

小鼠肝臟經(jīng)過固定、石蠟切片、HE染色等操作，最終在100、200、400倍光學(xué)顯微鏡下觀察各組小鼠肝臟組織病理學(xué)。由圖5可知，正常組中肝細(xì)胞界限明顯，中央靜脈周圍的細(xì)胞呈放射狀排列。而模型組中，肝細(xì)胞邊界不清晰，中央靜脈周圍的細(xì)胞排列紊亂，出現(xiàn)典型的細(xì)胞凝聚現(xiàn)象。但是咀嚼片組肝細(xì)胞界限比較明顯，中央靜脈周圍的細(xì)胞排列比較整齊，細(xì)胞凝聚現(xiàn)象得到明顯改善，咀嚼片組的肝臟組織與正常組接近，說明小鼠肝損傷進程被寒蔥咀嚼片所控制。

A：正常組；B：模型組；C：咀嚼片組；D：陽性組

3 討論

CCl4急性肝損傷模型是經(jīng)典的肝損傷模型，常被用來篩選具有肝保護作用的藥物[23]。CCl4進入機體后，經(jīng)肝臟細(xì)胞色素 P450代謝產(chǎn)生三氯甲基自由基和過氧三氯甲基自由基，破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，造成肝細(xì)胞脂質(zhì)過氧化損傷。脂質(zhì)過氧化損傷破壞肝細(xì)胞膜的完整性，從而導(dǎo)致肝細(xì)胞的AST和ALT釋放入血，因此血清AST和ALT活性水平被認(rèn)為是肝損傷最敏感的金指標(biāo)，并被廣泛應(yīng)用于對急性肝損傷的診斷[24]。研究結(jié)果顯示，寒蔥咀嚼片灌胃劑量以3 g/kg·d連續(xù)灌胃30 d后，能顯著降低被CCl4誘導(dǎo)的小鼠血清中AST和ALT的活性，說明寒蔥咀嚼片能抑制細(xì)胞色素酶P450的活性，減少自由基的產(chǎn)生，減輕或阻斷由于過氧化而引起的肝細(xì)胞膜、線粒體、溶酶體損傷導(dǎo)致的肝細(xì)胞壞死，從而達(dá)到降低轉(zhuǎn)氨酶的效果。另外肝臟組織形態(tài)和病理學(xué)檢查結(jié)果顯示，寒蔥咀嚼片能夠顯著緩解肝細(xì)胞變性壞死等病理性改變，說明寒蔥咀嚼片對CCl4誘導(dǎo)的急性肝損傷具有顯著的保護作用。

寒蔥咀嚼片中主要活性物質(zhì)來源是寒蔥提取物，而蔥屬植物中大多含有豐富的黃酮類物質(zhì)，而黃酮類物質(zhì)具有清肝、抗菌、治療急性肝炎、慢性肝炎、肝硬化的作用。該實驗中采用HPLC法對寒蔥提取物中蘆丁、槲皮素和山奈酚進行了分析，結(jié)果表明寒蔥提取物中蘆丁含量最高，其次為山奈酚，槲皮素含量最低。通過研究表明，蘆丁、槲皮素和山奈酚對肝損傷小鼠具有一定的保護作用，其機制可能是黃酮類物質(zhì)減少自由基的生成[25-27]。因此，寒蔥咀嚼片對小鼠急性肝損傷的保護作用，可能主要來源于咀嚼片中的蘆丁等黃酮類物質(zhì)。

4 結(jié)論

以寒蔥提取物為原料，通過濕法制粒法制備寒蔥咀嚼片，其最佳制備工藝配方為：寒蔥提取物10%，乳糖57.3%，MCC 28.7%，甘露醇4%；殺菌條件為：壓片前對顆粒進行紫外線照射和臭氧處理各4 h。通過對小鼠的肝臟系數(shù)、血清中轉(zhuǎn)氨酶活性、肝臟組織形態(tài)和病理學(xué)的觀察，可以確認(rèn)寒蔥咀嚼片對CCl4誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷具有很好的保護作用，有望開發(fā)成具有肝保護作用的保健產(chǎn)品。