趙 洋, 馮藝川, 哈 洋, 吳松權(quán), 全雪麗
(延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院,吉林 延吉 133000)
膜莢黃芪(Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.)為豆科多年生草本植物,國家三級瀕危保護植物,具有補氣升陽、生津養(yǎng)血、行滯通痹等功效[1]。據(jù)已有文獻報道,膜莢黃芪中的主要藥用活性成分為黃酮類、皂苷類等化合物[2-5]?!吨腥A人民共和國藥典(第一部)》[1]規(guī)定毛蕊異黃酮葡萄糖苷是其主要活性指標成分之一,具有增強機體免疫力、抗炎、降血糖和保護肝臟等作用[6-9]。目前,黃芪毛蕊異黃酮葡萄糖苷的生物合成研究已成為研究熱點。
4-香豆酸輔酶A連接酶(4-coumarate:CoA lig-ase,4CL)是植物類黃酮類化合物和木質(zhì)素等生物合成途徑的一種關(guān)鍵酶。據(jù)已有文獻報道,擬南芥、黑麥草、歐洲山楊、覆盆子、毛白楊、亞麻、青稞、甜高粱等多種植物中已成功克隆出了4CL基因[10-11]。此外,4CL基因既在植物生命世代初期開始由植物自身的發(fā)育調(diào)控,還能被多種誘導(dǎo)子及環(huán)境因子激活[12]。而有關(guān)膜莢黃芪4CL全長基因克隆的研究尚未見報道。本研究以膜莢黃芪為材料,通過RACE法克隆了4CL全長cDNA序列,并利用生物信息學(xué)和qPCR轉(zhuǎn)錄表達方法[13]對其功能進行了分析。
1) 植物材料 2年生膜莢黃芪。選取一部分的根、莖、葉,用液氮冷凍處理后置于-80 ℃的超低溫冰箱中,另一部分樣品置于50 ℃恒溫干燥箱中烘干至恒定后用于成分分析。
2) 試劑及儀器 Trizol試劑,購自Invitrogen公司;合成cDNA第一條鏈的試劑盒,購自Toyobo公司;SMARTerTMRACE cDNA 5’和3’RACE試劑盒,購自Clontech公司;DNA凝膠回收試劑盒和PMD-19T載體試劑盒,購于寶生物工程(大連)有限公司;對照品毛蕊異黃酮葡萄糖苷(批號110907),購自上海融禾醫(yī)藥科技有限公司;乙腈和甲醇為色譜級,水為超純水,其他試劑分析純,購于國內(nèi)各公司。
1.2.1 引物設(shè)計
在NCBI網(wǎng)站上搜索已經(jīng)在Genbank上登陸的豆科植物及擬南芥等模式植物的4CL的mRNA和蛋白質(zhì)的完整或部分序列并下載,使用MegAlign軟件確定其保守區(qū)域后,利用Primer Premier 5.1軟件設(shè)計1對Am4CL基因的簡并引物Am4CLu1和Am4CLd1(引物的合成由上海英駿生物合成公司完成)。該試驗所用引物如表1所示。
表1 引物序列
1.2.2 總RNA提取與cDNA的合成
采用Invitrogen公司的Trizol一步法提取膜莢黃芪根總RNA,具體步驟參照其說明書,將提取的總RNA保存于-80 ℃超低溫冰箱中。在150 V電壓、1.2%瓊脂糖凝膠電泳15 min和NanoDrop 2 000 C超微量分光光度計檢測其質(zhì)量與濃度;按照TOYOBO公司的ReverTra Ace qPCR RT Master Mix with gDNA Remover反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書的步驟合成膜莢黃芪cDNA第1條鏈。
1.2.34CL基因保守區(qū)克隆
以合成的cDNA第1條鏈為模板,進行PCR擴增,反應(yīng)體系共20.0 μL:10×PCR Buffer 2.0 μL,25 mmol/L MgCl22.0 μL,2 mmol/L dNTP 2.0 μL,cDNA 1 μmol/L 2.0 μL,Am4CLu1 2.0 μL,Am4CLd1 2.0 μL,5 U ExTaq 0.2 μL,dd H2O 7.8 μL。使用快速瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(康為世紀公司)回收PCR產(chǎn)物的DNA片段;將目的片段與pMD18-T載體在16 ℃條件下進行過夜連接;將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)JM109;將提取的重組質(zhì)粒DNA原液稀釋50倍后,使用M13引物(表1)進行PCR檢測;將PCR產(chǎn)物在1.2%的瓊脂糖膠上電泳,將陽性克隆菌株進行測序。測序工作由上海英駿生物公司完成。
1.2.4 5’RACE 和 3’RACE 擴增
參照Clontech公司的SMARTerTMRACE cDNA擴增試劑盒說明書,分別合成目的基因片段的5’端和3’端。根據(jù) 2個4CL基因家族的保守序列分別設(shè)計1對 5’-RACE 和 3’-RACE 的特異引物Am4CLgsp1和Am4CLgsp2,引物序列如表1所示。PCR 產(chǎn)物的克隆與測序,方法同1.2.3
1.2.54CL基因編碼區(qū)的克隆
依據(jù)已經(jīng)克隆的保守區(qū)域的cDNA序列和5’-RACE 和 3’-RACE 擴增的產(chǎn)物序列,設(shè)計并合成了編碼區(qū)特異引物Am4CLcu1和Am4CLcd1,如表1所示。反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性5 min,94 ℃變性45 s,60 ℃退火45 s,72 ℃延伸 2 min,35個循環(huán);72 ℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物的克隆與測序,方法同1.2.3。
1.2.64CL基因的生物信息學(xué)分析
運用Lasergene軟件包中Protean預(yù)測編碼蛋白分子量和等電點;利用ProtScale(http://web.Expasy.org/protscale/)軟件進行疏水性進行分析;利用Psipred預(yù)測4CL蛋白的二級結(jié)構(gòu);利用TMHMM-2.0在線工具進行4CL蛋白序列跨膜區(qū)的預(yù)測。利用MEGA7軟件進行氨基酸序列比對分析和構(gòu)建4CL氨基酸序列系統(tǒng)進化樹。
1.2.7 膜莢黃芪4CL基因的熒光定量PCR分析
針對獲得的Am4CL特異序列,設(shè)計1對熒光定量PCR引物(表1),所用內(nèi)參基因為黃芪18s基因(表1),進行熒光定量PCR。反應(yīng)體系共20.0 μL,除了SYBR 10.0 μL和ROX 0.5 μL外,其他同1.2.3項。以標準的Am4CL和18S基因拷貝數(shù)的對數(shù)值為橫坐標,以測得的CT值為縱坐標,分別繪制其標準曲線。根據(jù)未知樣品的CT值,可在各自的標準曲線中得到其樣品的拷貝數(shù)再求出內(nèi)參基因18S的相對表達量,每組樣品進行3次重復(fù)檢測。
1.2.8 毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量的測定
毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量采用HPLC方法[14]進行測定,每組樣品的提取和測定操作重復(fù)3次。
1.2.9 統(tǒng)計分析
試驗數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0軟件,多重比較采用Duncan新復(fù)極差法(P<0.05),相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)系數(shù)。
用簡并引物進行PCR反應(yīng)獲得了4CL基因cDNA片斷(圖1A),重組質(zhì)粒進行PCR鑒定得到長度約為500 bp的4CL條帶(圖1B),將其進行測序,并將片段命名為:Am4CL-RT。
A.用簡并引物擴增的4CL基因cDNA片斷; B. Am4CL-RT 質(zhì)粒PCR鑒定
將反轉(zhuǎn)錄合成的第1條鏈,使用設(shè)計的特異性引物(表1)分別進行3’-RACE和5’-RACE,電泳如圖2(A、C),PCR鑒定如圖2(B、D)。Am4CL-3’序列長度為750 bp;Am4CL-5’序列長度為1 300 bp,初步認為Am4CL-3’和Am4CL-5’分別為膜莢黃芪4CL基因的3’端和5’端。
A.Am4CL基因3’端PCR結(jié)果;B.Am4CL -3’質(zhì)粒PCR鑒定;C.Am4CL基因5’端PCR結(jié)果;D.Am4CL-5’質(zhì)粒PCR鑒定
依據(jù)所克隆的膜莢黃芪苯丙烷途徑基因保守區(qū)域序列以及5′-RACE和3′-RACE擴增的產(chǎn)物序列,通過拼接獲得目的基因的全長序列并命名為Am4CL,設(shè)計編碼區(qū)序列引物如(表1),以反轉(zhuǎn)錄的第1條鏈cDNA為模板,PCR獲得目的基因片段(圖3),經(jīng)過回收、連接、轉(zhuǎn)化、提取重組質(zhì)粒PCR鑒定。測序結(jié)果顯示和拼接序列一致。因此,確定獲得了膜莢黃芪苯丙烷途徑的4CL基因的全長。
核苷酸序列和氨基酸序列分析結(jié)果表明,Am4CL的cDNA全長為1 937 bp,其中,ORF為1 641 bp,3’非翻譯區(qū)(3’-UTR)為144 bp,5’非翻譯區(qū)(5’-UTR)為127 bp,以及25 bp的polyA尾。DNA序列中A+T含量為52.50 %,C+G含量為47.5%,推測其編碼546個氨基酸。
登錄NCBI主頁,用Blast在線搜索工具將Am4CL基因序列與其他植物的4CL基因序列進行對比分析。結(jié)果表明,Am4CL豆科的一些植物,比如刺毛黛豆(RDY12997.1)、百脈根(BT139278.1)、紅豆(XP_027330824.1)的相似性分別為79%、87%、81%,與豆科其他屬的相似性也很高,說明Am4CL是膜莢黃芪的4CL基因序列。
疏水性分析顯示(圖4),Am4CL的總平均親水指數(shù)為0.009,是疏水性蛋白質(zhì)。其中,疏水性最強位點在106位置,達到3.167,親水性最強位點在192位置,為-2.556。二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果(圖5),Am4CL蛋白的二級結(jié)構(gòu)α-螺旋占34.07%,β-折疊占18.50%,無規(guī)則卷曲占47.44%。16個α-螺旋,19個β-折疊。
圖4 Am4CL蛋白序列的疏水曲線
圖5 Am4CL編碼蛋白的二級結(jié)構(gòu)
用Lasergene軟件包中Protean預(yù)測Am4CL蛋白相對分子質(zhì)量為59 470,等電點為8.34,酸性氨基酸48個,堿性氨基酸51個。TMHMM-2.0預(yù)測結(jié)果顯示,Am4CL為膜蛋白,產(chǎn)生了2個跨膜螺旋,其跨膜區(qū)預(yù)測位置分別位于98~120位氨基酸之間和243~265位氨基酸之間(圖6)。
圖6 Am4CL蛋白跨膜結(jié)構(gòu)分析Fig.6 Transmembrane structure analysis of protein of Am4CL
為了進一步深入研究Am4CL與其他植物4CL之間的進化關(guān)系,以其推測的氨基酸序列作為分析對象,利用DNAstar軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹(圖7)可以看出14個物種的4CL氨基酸序列被劃分為2個主支,分別為TypeⅠ、TypeⅡ。將綠豆變種(XP_014504631.1)、小豆(XP_017430152.1)、菜豆(XP_007160602.1)、大豆(XP_00354004.1)、刺毛黛豆(RDY12997.1)、紅豆(XP_027330824.1)、花生(XP_025636299.1)、膜莢黃芪(ATY39971.1)歸為Ⅰ類;將紫花苜蓿(AET02374.1、XP_024627525.1、XP_013466211.1)、鷹嘴豆(XP_004499325.1)、地下三葉草(GAU12224.1)、紅車軸草(PNY04116.1)歸為Ⅱ類。
圖7 植物4CL的系統(tǒng)發(fā)育進化樹
運用實時熒光定量PCR技術(shù),分析了膜莢黃芪植株根、莖、葉3個不同組織中Am4CL的表達特性(圖8)結(jié)果表明,Am4CL在根、莖、葉中均表達,但表達量明顯存在差異,其中,根中表達量最高,是莖中表達量的2.20倍,是葉中表達量的2.01倍。另測定毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量在膜莢黃芪的根、莖、葉中的表達量也存在顯著差異,其中,根中含量達到了0.29 mg/g,是莖中含量(0.20 mg/g)的1.45倍,而葉中僅含有0.11 mg/g。
圖8 不同組織中4CL基因相對表達量及毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量
苯丙烷類代謝途徑是植物體次生代謝中的一個通用途徑,在植物生長發(fā)育中具有重要的作用[15]。4CL是植物苯丙烷類代謝途徑的一種關(guān)鍵酶,主要參與木質(zhì)素和類黃酮合成。Kutsuki等[16]于1981年首次證明,4CL是木質(zhì)素生物合成途徑中的一種酶。馮春燕[17]對幾種植物的4CL蛋白比對分析發(fā)現(xiàn),4CL蛋白家族主要與木質(zhì)素和類黃酮類物質(zhì)的合成相關(guān),發(fā)現(xiàn)大豆的4CL蛋白主要參與了黃酮類物質(zhì)的合成。羅睿雄等[18]在芒果果實的研究表明,4CL基因可能參與了黃酮類物質(zhì)的合成,其基因表達與芒果果實著色也具有密切的相關(guān)性。Chowdhury等將紅麻進行重力脅迫處理,發(fā)現(xiàn)與木質(zhì)素形成的Hc4CL基因有顯著上調(diào)[19]。本研究借鑒前人的方法和經(jīng)驗,首次從膜莢黃芪中克隆了4CL基因全長序列,用生物信息學(xué)軟件進行序列比對分析,發(fā)現(xiàn)與其他植物中4CL基因有極高的同源性。
運用實時熒光定量 PCR技術(shù)對膜莢黃芪中的4CL基因做進一步的研究,在試驗過程中發(fā)現(xiàn)Am4CL基因在膜莢黃芪的根、莖、葉中均有穩(wěn)定表達,且根中相對表達量均高于莖和葉,這說明其在根中表達活躍,與白及[20]、丹參[21]等藥用植物的研究結(jié)果一致,這對以根為藥用部位的膜莢黃芪來說具有重要的指示意義。此外還發(fā)現(xiàn),4CL基因在膜莢黃芪的根、莖、葉中的表達趨勢與根、莖、葉中的毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量趨于一致(圖8),證明Am4CL參與毛蕊異黃酮葡萄糖苷的合成。雖然系統(tǒng)進化樹(圖7)基本按照不同物種分類,但不同物種氨基酸序列的相似性均在77%以上,已有研究表明,豆科植物的4CL蛋白參與了黃酮類物質(zhì)的合成,推測克隆的Am4CL參與了毛蕊異黃酮葡萄糖苷的生物合成。