水稻粒型基因克隆研究進(jìn)展及育種應(yīng)用展望

康藝維 陳玉宇 張迎信

（中國(guó)水稻研究所 國(guó)家水稻改良中心/水稻生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州 311401；*通信聯(lián)系人，E-mail：zhangyingxin@caas.cn）

據(jù)國(guó)家統(tǒng)計(jì)局?jǐn)?shù)據(jù)，2019 年我國(guó)的稻谷播種總面積是 2969 萬(wàn) hm2，占總糧食作物播種面積的25.58%，表明水稻生產(chǎn)在我國(guó)糧食生產(chǎn)中具有重要地位（http://www.stats.gov.cn）。隨著我國(guó)人民生活水平的提高，稻米需求呈現(xiàn)多樣化趨勢(shì)，在產(chǎn)量仍作為重要指標(biāo)的同時(shí)，稻米品質(zhì)也受到越來(lái)越高的重視[1-3]。水稻產(chǎn)量的決定因素包括單株有效穗數(shù)、每穗實(shí)粒數(shù)和粒重，粒重主要取決于粒型和充實(shí)度。根據(jù)籽粒的三維結(jié)構(gòu)將粒型構(gòu)成劃分為粒長(zhǎng)、粒寬和粒厚[4]。細(xì)長(zhǎng)粒稻米通常表現(xiàn)較好的外觀(guān)品質(zhì)，因此粒型也是影響稻米品質(zhì)的重要因素。著名的 Basmati 系列香米[5]、我國(guó)廣東的絲苗品種（http://www.ricedata.cn/variety）都是長(zhǎng)粒優(yōu)質(zhì)稻的典型代表，且近年來(lái)大面積應(yīng)用的優(yōu)質(zhì)不育系如野香 A[6]和泰豐 A[7]等也具有典型的長(zhǎng)粒表型。近幾十年來(lái)，研究者們定位和克隆了許多水稻粒型相關(guān)基因，極大地促進(jìn)了粒型形成分子遺傳機(jī)制的研究，并且為利用分子育種技術(shù)準(zhǔn)確、快速、高效地對(duì)水稻粒型改良提供了可能。本文綜述了已克隆的水稻粒型基因/QTL 及籽粒分子調(diào)控機(jī)制，并重點(diǎn)對(duì)粒型 QTL 進(jìn)行了育種應(yīng)用現(xiàn)狀及潛力評(píng)價(jià)，以期為我國(guó)水稻育種家提供分子育種的參考信息。

1 水稻粒型QTL 研究進(jìn)展

水稻粒型是典型的數(shù)量性狀，研究者們普遍認(rèn)為粒長(zhǎng)、粒寬、長(zhǎng)寬比一般受多基因控制，也有少數(shù)受單基因、雙基因控制。還有研究表明控制粒型各性狀的基因還存在互補(bǔ)和累加效應(yīng)[8-10]。隨著水稻基因組測(cè)序的完成，研究人員利用不同的遺傳群體，如F2群體、回交群體（BC）、加倍單倍體群體（DH）、重組自交系（RIL）、染色體片段置換系（CSSL）、導(dǎo)入系（IL）和剩余雜合體（RH）等定位了大量與粒型相關(guān)的QTL。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，在水稻12 條染色體上已定位了500 多個(gè)粒型相關(guān)QTL（http://www.ricedata.cn/index.htm）。利用存在于栽培品種間的自然變異，研究人員通過(guò)正向遺傳學(xué)的方法已經(jīng)克隆了18 個(gè)與水稻粒型相關(guān)的主效QTL，分布在第 2、3、4、5、6、7、8 和 9 染色體上（圖1）[11-22]。

GW2、qSW5/GW5/GSE5、GS5、GW8和TGW2主要控制粒寬。GW2克隆自大粒粳稻品種WY3，編碼一個(gè)環(huán)型E3 泛素連接酶，亞細(xì)胞定位于細(xì)胞質(zhì)中[23]。GW2提前終止型的功能缺失導(dǎo)致穎殼細(xì)胞分裂速度加快、穎殼變寬，有利于胚乳灌漿，增加粒重，最終產(chǎn)生寬大的籽粒?？寺∽詫捔＞酒贩N日本晴、Asominari 等的qSW5/GW5/GSE5編碼一種新型的油菜素內(nèi)酯（Brassinosteroid，BR）信號(hào)調(diào)控因子[24-26]。功能缺失或表達(dá)量下降型的基因負(fù)調(diào)控小穗穎殼細(xì)胞的增殖，導(dǎo)致寬粒和重粒。位于第5 染色體短臂控制粒寬的GS5，克隆自秈稻恢復(fù)系珍汕97，它編碼的蛋白含有PF00450 結(jié)構(gòu)域，屬于肽酶S10 家族的絲氨酸羧肽酶[27]。GS5表達(dá)量的增加可促進(jìn)內(nèi)外稃的細(xì)胞增殖和擴(kuò)張，正向調(diào)控籽粒大小。GW8/OsSPL16位于第8 染色體長(zhǎng)臂上，供體親本為Basmati 385，是調(diào)控水稻粒型和稻米品質(zhì)的QTL[28]。在Basmati 水稻品種中，OsSPL16啟動(dòng)子區(qū)10 bp 的缺失使OsSPL16表達(dá)下調(diào)，導(dǎo)致籽粒變長(zhǎng)且外觀(guān)品質(zhì)變好。GW8和GS5都是由于啟動(dòng)子區(qū)的核苷酸變異影響了粒寬和粒重。TGW2是最新克隆的控制粒寬和粒重的QTL，親本為93-11 和培矮64S，編碼細(xì)胞數(shù)目調(diào)控因子OsCNR1，負(fù)調(diào)控粒寬和粒重。TGW2基因啟動(dòng)子上游1818 bp 處的堿基替換（G→A）可增強(qiáng)TGW2的表達(dá)[22]。

主要控制水稻粒長(zhǎng)的9 個(gè)QTL 包括GS3、qGL3/GL3.1/qGL3-1、TGW6、OsLG3、GLW7、GL4、qLGY3/OsLG3b/GW3p6、TGW3/qTGW3/GL3.3和GL6。GS3是水稻中首個(gè)被克隆的粒長(zhǎng)和粒重QTL[29-30]。GS3功能缺失等位基因單堿基替換（C→A）導(dǎo)致翻譯提前終止，產(chǎn)生一部分氨基端具有類(lèi)γ 結(jié)構(gòu)域的蛋白，使籽粒變長(zhǎng)。qGL3/GL3.1/qGL3-1克隆自粳稻大粒品種N411、Waiyin-3（WY3）、CW23 等，編碼含有兩個(gè)Kelch 功能域的蛋白磷酸酶，負(fù)調(diào)控水稻粒長(zhǎng)[12,31,32]。TGW6的定位群體是用Kasalath 作供體親本，日本晴作受體親本構(gòu)建的回交自交系[33]。功能缺失的TGW6通過(guò)影響胚乳細(xì)胞發(fā)育進(jìn)程限制了籽粒長(zhǎng)度進(jìn)而負(fù)調(diào)控籽粒大小。Yu 等[13]用Ho-LAMap 方法從品種SLG-1 中克隆到OsLG3。OsLG3編碼APETALA2/乙烯反應(yīng)元件結(jié)合蛋白，通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞數(shù)目的增長(zhǎng)正向調(diào)控粒長(zhǎng)，且在不影響稻米品質(zhì)的同時(shí)提高水稻產(chǎn)量。實(shí)驗(yàn)所用長(zhǎng)粒品種 IRAT109、SLG-1、Haobuka 都有相同的啟動(dòng)子序列且不同于短粒品種，說(shuō)明OsLG3啟動(dòng)子區(qū)的自然變異是導(dǎo)致粒長(zhǎng)和粒重變化的原因。GLW7是第一個(gè)通過(guò)GWAS 技術(shù)在水稻中克隆到的QTL，編碼OsSPL13，通過(guò)促進(jìn)穎殼細(xì)胞擴(kuò)大正向調(diào)控籽粒大小[34]。GL4是克隆自非洲野生稻W(wǎng)1411 的一個(gè)調(diào)控粒長(zhǎng)和粒重的QTL，通過(guò)調(diào)控內(nèi)外穎縱向細(xì)胞的伸長(zhǎng)，控制非洲栽培稻的粒長(zhǎng)，同時(shí)也能調(diào)控種子落粒性[35]。

圖1 已克隆水稻粒型相關(guān)基因在12 條染色體上的分布Fig.1.Distribution of cloned genes for grain size on rice chromosomes.

qLGY3/OsLG3b/GW3p6的供體親本為 SLG-1、L-204、廣占63-4S 等長(zhǎng)粒品種[14-16]。該基因編碼的轉(zhuǎn)錄因子OsMADS1 是G 蛋白下游調(diào)控因子。單倍型和基因滲入分析表明該基因經(jīng)過(guò)馴化，OsMADS1lgy3在熱帶粳稻中的存在能使粒長(zhǎng)明顯增加。TGW3/qTGW3/GL3.3克隆自大粒品種 JZ1506、CW23 和南洋占等，編碼類(lèi) SHAGGY41 激酶OsSK41/OsGSK，OsSK41 通過(guò)磷酸化 OsARF4 來(lái)負(fù)調(diào)控穎殼的細(xì)胞擴(kuò)張進(jìn)而調(diào)控粒長(zhǎng)[17-19]。GL6供體親本為W1943，受體親本是廣陸矮4 號(hào)[20]。GL6編碼植物特異的 PLATZ 轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控水稻粒長(zhǎng)和小穗數(shù)，通過(guò)促進(jìn)幼穗細(xì)胞的增殖正調(diào)控粒長(zhǎng)。GL6編碼的蛋白通過(guò)與RPC53 和TFC1 互作，參與介導(dǎo) RNA 聚合酶Ⅲ促進(jìn)核糖體合成，這豐富了調(diào)控水稻籽粒大小的分子機(jī)制。

同時(shí)控制粒長(zhǎng)和粒寬的 QTL 為GL2/GS2、GL7/GW7、GW6a和GS9。GL2/GS2克隆自大粒品種RW11 和“寶大粒”（BDL）等，是一個(gè)半顯性主效QTL，編碼的轉(zhuǎn)錄因子OsGRF4 屬于GRF 家族蛋白成員，主要通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞擴(kuò)張和少量細(xì)胞增殖負(fù)調(diào)控籽粒大小[23,36-37]。OsGRF4 的氨基酸突變改變了OsmiR396 的靶向位點(diǎn)，進(jìn)而破壞OsmiR396對(duì)OsGRF4 的抑制作用，使OsGRF4超量表達(dá)，導(dǎo)致籽粒變大，產(chǎn)量提高。GL7/GW7的供體親本為P13、天豐 A。GL7的串聯(lián)重復(fù)片段可以上調(diào)基因的表達(dá)水平，調(diào)控細(xì)胞的縱向伸長(zhǎng)，使水稻籽粒變得更細(xì)長(zhǎng)，也提高了稻米的外觀(guān)品質(zhì)[38]。GW7編碼一個(gè)TONNEAU1 募集基序蛋白，其表達(dá)量上調(diào)，能促進(jìn)籽粒的縱向細(xì)胞分裂，并減少橫向細(xì)胞分裂，導(dǎo)致籽粒變得細(xì)長(zhǎng)[39]。GL7/GW7控制細(xì)胞分化的方式還需要進(jìn)一步的研究。GW6a編碼的OsglHAT1蛋白具有內(nèi)源組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶活性，能通過(guò)增加細(xì)胞數(shù)目和加速灌漿速率來(lái)增大穎殼，從而增加粒重和產(chǎn)量[40]。盡管GW6a在粒重、產(chǎn)量和植株生物量方面具有有利于農(nóng)藝性狀的效應(yīng)，但能使GW6a表達(dá)量提高的等位基因還未得到利用。Zhao 等[21]用Qingluzan 11 和日本晴構(gòu)建的染色體片段置換系CSSL N138 與日本晴雜交構(gòu)建定位群體并克隆得到GS9。發(fā)現(xiàn)GS9通過(guò)調(diào)控穎殼細(xì)胞的分化負(fù)調(diào)控籽粒大小，將gs9等位基因?qū)胛溥\(yùn)粳27 中，籽粒變細(xì)長(zhǎng)，稻米的外觀(guān)品質(zhì)顯著提高。

2 水稻粒型調(diào)控的分子機(jī)制

稻米生長(zhǎng)在穎殼內(nèi)，穎殼提供給稻米生長(zhǎng)發(fā)育的環(huán)境但也限制稻米的生長(zhǎng)。穎殼受母體組織控制，分子機(jī)制涉及一些信號(hào)通路，如泛素蛋白酶體途徑、G-蛋白信號(hào)通路、MAPK 信號(hào)通路、植物激素信號(hào)和轉(zhuǎn)錄因子等[11,41-42]?？茖W(xué)家們從化學(xué)誘變和T-DNA 插入等突變體庫(kù)中鑒定了一些突變體，研究這些突變體有助于完善粒型形成分子機(jī)制及調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的研究。

參與泛素蛋白酶體途徑的基因：WTG1編碼與人類(lèi)OTUB1 同源的蛋白，具有泛素化活性，抑制OsSPL14 的K63 位多聚泛素化。wtg1-1突變體通過(guò)減少穎殼細(xì)胞的擴(kuò)張產(chǎn)生寬、厚、短的籽粒[43]，并且莖稈變粗、穗變大，被認(rèn)為是新株型主效 QTLNPT[44]。OsUBP15表達(dá)下調(diào)或功能缺失都能產(chǎn)生更窄小的籽粒[45]。此外，還有已克隆的編碼環(huán)型 E3泛素連接酶的 QTLGW2，通過(guò)將底物錨定到蛋白酶體將其降解，負(fù)調(diào)控細(xì)胞分裂。

參與G 蛋白信號(hào)通路的基因：D1編碼GTP 結(jié)合蛋白（G 蛋白）的α 亞基，功能缺失型突變體的G 蛋白失活，籽粒短而圓[46]。G 蛋白β 亞基RGB1的敲除轉(zhuǎn)基因植株籽均變小且不育種子增多[47]。DEP1/qPE9編碼的蛋白包含一個(gè)完整的氨基酸類(lèi)γ結(jié)構(gòu)域但缺乏羧基端富半胱氨酸區(qū)域，導(dǎo)致圓錐花序直立，籽粒大小和粒重略微降低，被認(rèn)為是一種功能獲得型等位基因[48]。最近的研究表明，過(guò)表達(dá)DEP1會(huì)導(dǎo)致籽粒變大，而下調(diào)或者敲除DEP1會(huì)導(dǎo)致籽粒變小和直立的圓錐花序[49]。RGG2編碼G蛋白γ 亞基，可參與赤霉素合成途徑，負(fù)調(diào)控水稻籽粒大小和產(chǎn)量[50]。在已克隆 QTL 中，GS3是通過(guò)此途徑調(diào)控籽粒大小的。

參與 MAPK 信號(hào)通路的基因：OsMKK10，OsMKK4和OsMAPK6是一個(gè)控制水稻籽粒大小的級(jí)聯(lián)反應(yīng)。功能缺失突變體smg2-1/OsMKK10，smg1-1/OsMKK4和dsg1/OsMAPK6由于減少了穎殼細(xì)胞的增殖而使籽粒變小[51]。GSN1編碼絲裂原活化蛋白激酶磷酸酶 OsMKP1 ， 負(fù)調(diào)控OsMKKK10-OsMKK4-OsMPK6 級(jí)聯(lián)途徑[52]。OsRac1通過(guò)影響細(xì)胞分裂來(lái)調(diào)控水稻籽粒大小和產(chǎn)量，與OsMAPK6互作，OsMAPK6可以調(diào)節(jié)水稻的細(xì)胞分裂和籽粒大小[53]。

參與植物激素信號(hào)途徑的基因[11,54]：位于第1染色體的D61/OsBRI1[55]和D2[56]；第 2 染色體的PGL2/OsBUI1[57]；第 3 染色體的BG1[58]和PGL1[59]；第 4 染色體的XIAO[60]和D11[61]；第 5 染色體的GSK2[62]、APG[59]和SMOS1[63]；第 6 染色體的DLT[64]和BU1[65]；第7 染色體的OsBZR1[66]；第8 染色體的OsBAK1/08SG2[66,67]和SLG[68]；第 9 染色體的SG1[69]。其中，與 BR 信號(hào)相關(guān)的基因最多，有D61/OsBRI1、OsBAK1/08SG2、OsBZR1、GSK2、XIAO等。在已克隆QTL 中，GS5 蛋白數(shù)量增加會(huì)抑制OsBAK1-7 與OsMSBP1 互作而產(chǎn)生的胞吞作用，促使BR 信號(hào)增強(qiáng)，進(jìn)而導(dǎo)致籽粒變大。

轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子OsGIF1編碼GRF 互作蛋白[70]，調(diào)控胚乳中淀粉的形成。gif1突變體的粒重變輕。AH2編碼SHAQKYF 類(lèi)MYB 轉(zhuǎn)錄因子，是調(diào)控水稻穎殼外層細(xì)胞發(fā)育的基因，并對(duì)籽粒產(chǎn)量和品質(zhì)均有影響[71]。在已克隆的粒型相關(guān) QTL 中，多數(shù)為轉(zhuǎn)錄因子（表1）。

miRNA 是植物生長(zhǎng)和發(fā)育的重要調(diào)節(jié)因子，近來(lái)發(fā)現(xiàn)在籽粒調(diào)控中也起到重要作用。miR1432 負(fù)調(diào)控水稻籽粒大小[72]。突變體fuwa與野生型植株相比株高略矮，莖稈變粗壯，分蘗數(shù)減少，穗變短但直立、緊密，籽粒變寬、變厚、變短，胚乳質(zhì)量增加、灌漿速率加快[73]。HGW調(diào)節(jié)水稻抽穗期和粒重[74]，在雜合基因型的突變體中，由于穎殼細(xì)胞數(shù)目減少使籽粒寬度減少，千粒重下降。

水稻籽粒大小由一個(gè)復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)來(lái)控制，這個(gè)網(wǎng)絡(luò)融合了多種發(fā)育和環(huán)境信號(hào)。盡管最近的研究已經(jīng)明確了一些籽粒大小關(guān)鍵調(diào)控因子和分子調(diào)控途徑，但對(duì)整個(gè)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的認(rèn)知仍然有限和零散。因此，有必要探索已知籽粒大小調(diào)控因子的上下游成分，以及已確定的調(diào)控通路之間可能的聯(lián)系。

3 主要粒型基因的功能標(biāo)記

分子育種為精確定向改良某一性狀提供了有力的工具，并正在成為水稻育種的新興方向之一。分子標(biāo)記輔助選擇（marker-assisted selection, MAS）是利用與目標(biāo)基因共分離或連鎖的分子標(biāo)記進(jìn)行輔助選擇育種的方法，目前已在作物育種中得到了廣泛應(yīng)用，在回交育種中具有定點(diǎn)且高效的優(yōu)點(diǎn)，且不受基因類(lèi)型的限制。例如，聚合OsLG3SLG和gw8Basmati的品種云廣8 號(hào)，不僅產(chǎn)量提高，還實(shí)現(xiàn)了米質(zhì)的優(yōu)化[13]。聚合OsMADS1lgy3和dep1-1、gs3基因是同時(shí)提高水稻產(chǎn)量和米質(zhì)的有效策略[14]。功能標(biāo)記是基于基因內(nèi)部序列變異而開(kāi)發(fā)的一種共分離分子標(biāo)記，能準(zhǔn)確檢測(cè)出水稻材料中的目標(biāo)基因且能高效地篩選出有利基因和基因型。

研究者根據(jù)已克隆的基因設(shè)計(jì)了功能標(biāo)記，如GS3第 2 外顯子的 CAPS 功能標(biāo)記 SF28[75]、GS5的 CAPS 標(biāo)記 GS5-1 和 dCAPS 標(biāo)記 GS5-2[76]、GW8啟動(dòng)子的 InDel 標(biāo)記 GW8-1[77]、GS9的 InDel 標(biāo)記NIL-F、NIL-R 和 5′-R[21]、qGL3第 10 外顯子的ARMS-PCR 標(biāo)記 qGL3-SNPF1/qGL3-SNPR1[78]。Zhang 等[79]利用 TD70 和 Kasalath 在GW2、GS3、qGL3、GS5、GW8和TGW6中的差異，開(kāi)發(fā)了 dCAPS標(biāo)記 GW2-F/GW2-R，CAPS 標(biāo)記 GS3-F/GS3-R，dCAPS 標(biāo) 記 qGL3-F/qGL3-R ， SSR 標(biāo) 記GS5-F/GS5-R，dCAPS 標(biāo)記 GW8-F2/GW8-R2 和CAPS 標(biāo)記TGW6-F/TGW6-R。其次，除了可根據(jù)基因旁側(cè)序列設(shè)計(jì)易于操作的SSR 或InDel 連鎖標(biāo)記，根據(jù)已發(fā)表的序列變異可以有目的性、準(zhǔn)確地設(shè)計(jì)基因功能標(biāo)記。qSW5/GW5/GSE5基因可根據(jù)粳稻1 212 bp 或秈稻950 bp 缺失設(shè)計(jì)InDel 功能標(biāo)記，GW6a基因ORF 在日本晴與Kasalath 之間存在9 個(gè)SNP 的差異，可用于設(shè)計(jì)CAPS 或dCAPS 標(biāo)記，GL7基因可根據(jù)拷貝數(shù)變異設(shè)計(jì)顯性標(biāo)記，OsLG3基因可根據(jù)啟動(dòng)子5 bp 缺失設(shè)計(jì)InDel 標(biāo)記，GL4則可根據(jù)大?；蛐偷? 外顯子6 bp 插入設(shè)計(jì)InDel 標(biāo)記，TGW3/qTGW3/GL3.3可根據(jù)大粒基因型中第3 和第4 外顯子的大片段缺失設(shè)計(jì)InDel 標(biāo)記，GS2可根據(jù) SNP(TC487-488AA)設(shè)計(jì) CAPS 或dCAPS 標(biāo)記，qLGY3/OsLG3b/GW3p6基因可利用緊密連鎖標(biāo)記XP22、XP23 或第7 內(nèi)含子的堿基缺失設(shè)計(jì)InDel功能標(biāo)記，GLW7可根據(jù)基因ORF區(qū)SNP設(shè)計(jì) CAPS 或 dCAPS 功能標(biāo)記。GL6可根據(jù)第 1內(nèi)含子 15 bp 的缺失設(shè)計(jì) InDel 功能標(biāo)記。TGW2基因可根據(jù)啟動(dòng)子上游1818 bp 的單堿基突變（G-A）設(shè)計(jì)CAPS 或dCAPS 標(biāo)記。

4 已克隆粒型基因的育種應(yīng)用

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評(píng)估18 個(gè)已克隆的水稻粒型QTL，并開(kāi)發(fā)相關(guān)基因的功能標(biāo)記，可以幫助育種家們合理選擇并聚合有利等位基因，加快育種進(jìn)程。在已有的報(bào)道中，對(duì)于粒寬和粒重基因GW2，與輪回親本FAZ1，NIL（WY3）粒寬增加0.6 mm，粒厚增加0.3 mm，千粒重增加9 g，單株產(chǎn)量增加5 g[23]。籽粒大小調(diào)控基因GS5：與NIL（H94）相比，珍汕97 粒寬在增加0.3 mm, 粒重增加1.6 g，單產(chǎn)增加1.4 g[80]。粒重基因GW8：輪回親本 HJX749 粒寬和粒重較GW8表達(dá)量低的 NIL（Basmati 385）分別增加了0.3 mm 和 3 g，單產(chǎn)增加 5 g[28]。粒寬粒重基因TGW2：93-11 的tgw2等位基因?qū)肱喟?64S，單產(chǎn)提高13.6 %[22]。如表 1 所示，在這些 QTL 中，GS3、TGW6、GL6、OsLG3和GS5增產(chǎn)等位基因目前已廣泛應(yīng)用于秈稻品種中，qSW5/GW5/GSE5增產(chǎn)等位基因已在粳稻品種中得到廣泛應(yīng)用；GLW7增產(chǎn)等位基因多存在于秈稻品種、熱帶粳稻和少量溫帶粳稻品種中；GW8、GL7/GW7和qLGY3/OsLG3b的優(yōu)質(zhì)或增產(chǎn)等位基因可能在我國(guó)部分水稻品種中存在；GL2/GS2增產(chǎn)突變和GS9優(yōu)質(zhì)突變基因型為稀有突變，TGW3/qTGW3/GL3.3和TGW2增產(chǎn)突變型主要存在于野生稻及Aus 稻中；GW2、GW6a、GL4和qGL3/GL3.1/qGL3-1增產(chǎn)或優(yōu)質(zhì)基因型在生產(chǎn)中情況未知，需要更多的相關(guān)研究結(jié)果才能進(jìn)行評(píng)估。綜合上述信息，qLGY3/OsLG3b/GW3p6、GL2/GS2、TGW3/qTGW3/GL3.3和TGW2的增產(chǎn)等位基因在增加粒重的育種目標(biāo)中具有較大的應(yīng)用潛力，qLGY3/OsLG3b/GW3p、GW8、GL7/GW7和GS9的優(yōu)質(zhì)等位基因在優(yōu)質(zhì)稻育種方向中具有很好的應(yīng)用前景，GW6a、GL4和qGL3/GL3.1/qGL3-1增產(chǎn)或優(yōu)質(zhì)等位基因可能具有較大的應(yīng)用潛力。另一方面，在秈稻中廣泛應(yīng)用的高產(chǎn)或優(yōu)質(zhì)等位基因可能在粳稻品種改良中具有較大的潛力，如GLW7、GS3、TGW6、GL6、OsLG3和GS5；GW2和qSW5/GW5/GSE5在秈稻中多表現(xiàn)細(xì)長(zhǎng)粒和較低的千粒重，鑒于目前秈稻長(zhǎng)粒優(yōu)質(zhì)稻的育種趨勢(shì)，育種家在秈稻改良中是否利用GW2及qSW5/GW5/GSE5增產(chǎn)等位基因時(shí)可能存在一定的分歧，是追求更高的千粒重還是追求長(zhǎng)粒型的外觀(guān)品質(zhì)取決于育種目標(biāo)。

在分子標(biāo)記輔助育種中應(yīng)注意以下問(wèn)題：1）目標(biāo)基因及供體親本的選擇。研究者首先應(yīng)通過(guò)測(cè)序鑒定或功能標(biāo)記分析確定待改良親本主要粒型基因的基因型，然后根據(jù)育種目標(biāo)選擇合適的目標(biāo)基因及供體親本用于分子設(shè)計(jì)改良。2）基因效應(yīng)的可變性。一方面不同的遺傳背景可能導(dǎo)致基因效應(yīng)的改變，例如同一基因在秈稻與粳稻品種背景中的表型可能存在較大差異；另一方面，不同粒型基因之間的互作可能導(dǎo)致基因效應(yīng)的變化，如qSW5對(duì)粒長(zhǎng)的效應(yīng)受到GS3的影響，GS3對(duì)粒寬的作用受到qSW5的影響[81]。因此，在進(jìn)行分子標(biāo)記輔助選擇進(jìn)行基因聚合的過(guò)程中，基因效應(yīng)的評(píng)估是一項(xiàng)不可或缺的工作。3）連鎖累贅的打破。由于連鎖累贅現(xiàn)象的存在，在回交導(dǎo)入有利基因的同時(shí)往往伴隨其連鎖不利育種性狀基因的導(dǎo)入。如第7 染色體上兩個(gè)粒型基因GL7/GW7和GLW7遺傳上連鎖，另外它們還與水稻直立型密穗基因DEP2[82]、種子休眠和馴化調(diào)節(jié)子基因Sdr-4[83]連鎖，分子標(biāo)記輔助選擇應(yīng)用時(shí)應(yīng)根據(jù)育種目標(biāo)和親本基因型進(jìn)行育種設(shè)計(jì)，在回交選擇過(guò)程中利用大樣本量的分離群體打破不利連鎖，選擇保留有利等位基因。4）導(dǎo)入粒型基因可能改變株葉形態(tài)或其他性狀。水稻粒型的改變是由于穎殼細(xì)胞大小或細(xì)胞數(shù)目的改變引起[84,85]，往往伴隨水稻株高、穗長(zhǎng)、葉長(zhǎng)或葉寬等性狀的改變，進(jìn)而導(dǎo)致株葉形態(tài)、光合效率或抗倒伏等其他性狀發(fā)生變異，如GS3除了可以調(diào)控粒型，對(duì)株高和穗長(zhǎng)均有影響[30]，而GL4除了可以控制粒長(zhǎng)，還能影響水稻的落粒性[35]。因此，綜合農(nóng)藝性狀的考查是評(píng)估目標(biāo)基因分子育種應(yīng)用中必不可少的環(huán)節(jié)。

5 展望

5.1 加速水稻粒型相關(guān)基因的克隆

水稻籽粒大小的調(diào)控機(jī)理還有許多未解之謎，而基因克隆是研究水稻籽粒大小調(diào)控機(jī)理的基礎(chǔ)，因此有必要克隆更多的粒型調(diào)控基因。相比傳統(tǒng)的圖位克隆方法，近年多個(gè)新興的基因定位方法為粒型基因的挖掘提供了更加簡(jiǎn)便快捷的途徑?；诙鷾y(cè)序的集群分離分析法（Bulk Segregant Analysis,BSA）是近年來(lái)興起的一種快速簡(jiǎn)單的性狀定位的方法，通過(guò)在群體中挑選極端或能代表目標(biāo)性狀的個(gè)體構(gòu)建 DNA 混池進(jìn)行全基因組重測(cè)序及差異分析，從而快速實(shí)現(xiàn)對(duì)單一性狀的初定位[86,87]。MutMap[88]將BSA 與全基因組重測(cè)序結(jié)合尋找候選基因，適合對(duì)化學(xué)誘變產(chǎn)生的隱性基因進(jìn)行分析，例如可利用BC1F2分離的野生型表型群體和突變體表型群體構(gòu)建兩個(gè) DNA 混池，將兩個(gè)混池分別進(jìn)行DNA 測(cè)序，計(jì)算SNP 在突變體混池和野生型混池出現(xiàn)的頻率，可得到和突變表型連鎖的染色體區(qū)段和可能的突變位點(diǎn)。應(yīng)對(duì)不同的分離群體衍生出MutMap+[89]、MutMap-Gap[90]和 QTL-seq[91]等，它們不需要復(fù)雜的定位群體，可大大縮短基因定位周期。全基因組關(guān)聯(lián)分析(Genome-Wide Association Study, GWAS)是利用自然群體或者人工群體在全基因組范圍內(nèi)找出存在的SNP、InDel、CNV 等變異類(lèi)型，從中篩選出與目標(biāo)性狀相關(guān)的變異位點(diǎn)的方法[34,92-94]。如韓斌團(tuán)隊(duì)[34]通過(guò)對(duì)381 份粳稻品種籽粒大小性狀的GWAS，快速將目標(biāo)區(qū)間定位到第7 染色體上，SNP 峰值注釋到11 個(gè)基因，結(jié)合表達(dá)量分析快速得到候選基因OsSPL13并通過(guò)了功能驗(yàn)證。雖然上述方法在基因挖掘方面存在快速高效的優(yōu)點(diǎn)，但在涉及 QTL 的克隆時(shí)往往仍需結(jié)合傳統(tǒng)圖位克隆方法才能最終確定候選基因。

5.2 提高粒型分子設(shè)計(jì)育種的效率

隨著多個(gè)水稻基因組測(cè)序的完成，如今數(shù)以百萬(wàn)計(jì)的遺傳標(biāo)記可以輕易獲得，大量功能基因正被逐漸揭示和利用，精準(zhǔn)基因組設(shè)計(jì)育種時(shí)代已逐漸來(lái)臨。目前，大量基于芯片或測(cè)序技術(shù)的水稻分子育種產(chǎn)品被研發(fā)并進(jìn)入應(yīng)用階段，主效基因相關(guān)標(biāo)記的應(yīng)用已逐漸形成規(guī)模[95]。若針對(duì)粒型性狀，可特異性地設(shè)計(jì)包含多個(gè)粒型基因基于多重 PCR 或液相探針的基因型分型體系，可快速有效地分析目標(biāo)基因的基因型，用于分子育種[96,97]。但目前無(wú)論是基于芯片還是二代測(cè)序技術(shù)，其分子育種應(yīng)用最大的限制因素在于高昂的價(jià)格。另外，不同基因間的上位性效應(yīng)評(píng)估不完善也限制了其分子設(shè)計(jì)特別是聚合育種的應(yīng)用。隨著技術(shù)的進(jìn)步及水稻分子育種產(chǎn)業(yè)化的進(jìn)程，我們可以樂(lè)觀(guān)地期盼基于芯片或重測(cè)序的基因分型產(chǎn)品價(jià)格的大幅降低，直至可以大規(guī)模應(yīng)用于水稻育種。

5.3 應(yīng)用新興技術(shù)改良粒型

此外，基因編輯（gene editing）是近年來(lái)興起的一種精確打靶技術(shù)，在水稻中能快速有效地創(chuàng)制功能缺失型突變體[98]。CRISPR-Cas9 多基因編輯的功能具有快速高效地特點(diǎn)，如王春等利用該系統(tǒng)同時(shí)編輯REC8[99]、PAIR1[100]、OSD1[101]和MTL[101]四個(gè)基因，獲得了可以通過(guò)種子進(jìn)行無(wú)性繁殖的植株從而可以使優(yōu)良F1雜交作物實(shí)現(xiàn)雜種優(yōu)勢(shì)固定，這一研究成果為基因編輯在水稻分子育種中的應(yīng)用描繪了光明前景[102]。水稻粒型基因中的負(fù)調(diào)控因子適用于進(jìn)行基因編輯以創(chuàng)制增產(chǎn)或優(yōu)質(zhì)的基因敲除后代，例如敲除GS3、GS2、TGW6、qTGW3、GSE5，籽粒千粒重增加，而敲除GW8可獲得細(xì)長(zhǎng)籽粒（表 1）。最近科學(xué)家開(kāi)發(fā)的全新精準(zhǔn)基因編輯工具PE（Primer Editors），無(wú)需額外的DNA 模板，從只能實(shí)現(xiàn)C-T/G-A 轉(zhuǎn)換[103]到可實(shí)現(xiàn)12 種單堿基的轉(zhuǎn)換和多堿基的精準(zhǔn)插入與刪除[104]，這為基因編輯領(lǐng)域帶來(lái)了重大變革，也為基因編輯在水稻分子育種的應(yīng)用展示了光明的前景。值得注意的是，由于基因編輯經(jīng)歷轉(zhuǎn)基因過(guò)程，應(yīng)用時(shí)需首先去除轉(zhuǎn)基因成分，需謹(jǐn)慎選用此方法；其次基因編輯存在基因組突變和脫靶現(xiàn)象，一般需將獲得的陽(yáng)性植株與背景親本進(jìn)行回交純化后才能進(jìn)行應(yīng)用。