HPLC法測(cè)定小花清風(fēng)藤莖葉中兩種三萜類(lèi)化合物的含量

李曼姝 柯銀鉛 郭志勇 劉呈雄 鄒 坤

(三峽大學(xué) 生物與制藥學(xué)院 天然產(chǎn)物研究與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 湖北 宜昌 443002)

小花清風(fēng)藤SabiaparvifloraWall. ex Roxb.為清風(fēng)藤科清風(fēng)藤屬藤本植物，主要分布于云南、廣西、貴州等地[1]．小花清風(fēng)藤有抗病毒性肝炎的作用[2]，因其有著止痛、清熱、消炎、祛風(fēng)除濕的作用，在民間有“小黃藥”、“黃眼藥”、“黃腫藥”的俗稱(chēng)[3]．據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[4-11]，小花清風(fēng)藤的主要化學(xué)成分為生物堿類(lèi)、五環(huán)三萜類(lèi)、黃酮類(lèi)和苯丙素類(lèi)等化合物．化合物1和化合物2為五環(huán)三萜類(lèi)化合物，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)告，三萜類(lèi)成分為小花清風(fēng)藤的主要活性成分，有保肝作用[12]．為了給小花清風(fēng)藤的資源開(kāi)發(fā)及質(zhì)量控制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，本實(shí)驗(yàn)建立了高效液相色譜法測(cè)定小花清風(fēng)藤莖葉中化合物1和化合物2質(zhì)量分?jǐn)?shù)的方法．

1 儀器與材料

1.1 儀器

Dionex Ultimate 3 000型高效液相色譜儀，美國(guó)戴安公司；Venusil XBP C18色譜柱(5 μm，250×4.6 mm分析型)；ME215S型十萬(wàn)分之一電子天平(德國(guó)Sartorius公司)；乙腈為色譜純，水為三蒸水，其它試劑均為分析純．

1.2 材料

小花清風(fēng)藤莖和葉采自貴州省黔西南布依族苗族自治州興義市冊(cè)亨縣，其原植物標(biāo)本于2017年2月采自同一地區(qū)，經(jīng)三峽大學(xué)天然產(chǎn)物研究與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室王玉兵博士鑒定為清風(fēng)藤科(Sabiaceae)清風(fēng)藤屬(Sabia)小花清風(fēng)藤(SabiaparvifloraWall. ex Roxb.)，植物標(biāo)本現(xiàn)保存于本實(shí)驗(yàn)室(標(biāo)本編號(hào)：201700227)．對(duì)照品：化合物1為自制，純度≥95%；化合物2為自制，純度≥95%．

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱Venusil XBP C18(5 μm，250×4.6 mm)；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：20 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：203 nm；柱溫：30℃；其中測(cè)定化合物1的流動(dòng)相為乙腈-水(90∶10)，測(cè)定化合物2的流動(dòng)相為甲醇-水(83∶17)．

2.2 對(duì)照品溶液的配制

分別精密稱(chēng)取5.15 mg化合物1和4.00 mg化合物2，化合物1加入吡啶1 mL溶解，化合物2加入甲醇1 mL溶解，搖勻超聲，均加甲醇定容至5 mL容量瓶中，分別制成質(zhì)量濃度為1.030 0 mg/mL的化合物1儲(chǔ)備液和0.800 0 mg/mL的化合物2儲(chǔ)備液，所得對(duì)照品圖譜見(jiàn)圖1、2．

2.3 供試品溶液的配制

2.3.1 化合物1的供試品溶液的配制

取小花清風(fēng)藤藥材粉末(60目篩，50℃烘干)14.8 g，精密稱(chēng)定，加入75%甲醇200 mL，于60℃水浴，超聲提取60 min，濃縮提取液，加甲醇定容至5 mL容量瓶中．取適量溶液離心(轉(zhuǎn)速12 000 r/min)，沉淀15 min，上清液以0.45 μm的微孔濾膜濾過(guò)，取濾液即得．所得供試品圖譜如圖1所示．

圖1 化合物1對(duì)照品、供試品色譜圖

2.3.2 化合物2的供試品溶液的配制

取小花清風(fēng)藤藥材粉末(60目篩，50℃烘干)17.5 g，精密稱(chēng)定，加入75%甲醇200 mL，于60℃水浴，超聲提取60 min，濃縮提取液，加甲醇定容至5 mL容量瓶中．取適量溶液離心(轉(zhuǎn)速12 000 r/min)，沉淀15 min，上清液以0.45 μm的微孔濾膜濾過(guò)，取濾液即得．所得供試品圖譜如圖2所示．

圖2 化合物2對(duì)照品、供試品色譜圖

2.4 線(xiàn)性關(guān)系的考察

取化合物1和化合物2對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，用甲醇稀釋?zhuān)謩e配制成質(zhì)量濃度為0.257 5、0.515 0、0.669 5、0.772 5、1.030 0 mg/mL的化合物1系列標(biāo)準(zhǔn)溶液和質(zhì)量濃度為0.400 0、0.480 0、0.600 0、0.680 0、0.800 0 mg/mL的化合物2系列標(biāo)準(zhǔn)溶液．按“2.1”項(xiàng)進(jìn)行色譜分析．以峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣質(zhì)量濃度(X, mg/mL)為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線(xiàn)性回歸，得回歸方程．化合物1為Y=119.53X-13.759，r=0.999 7(n=5)．結(jié)果表明化合物1進(jìn)樣量在0.257 5～1.030 0 mg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線(xiàn)性關(guān)系．化合物2為Y=18.672X+0.879 3，r=0.999 6(n=5)．結(jié)果表明化合物2進(jìn)樣量在0.400 0～0.800 0 mg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線(xiàn)性關(guān)系．具體見(jiàn)圖3、4和表1、2．

圖3 化合物1對(duì)照品線(xiàn)性標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)圖

圖4 化合物2對(duì)照品線(xiàn)性標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)圖

表1 化合物1對(duì)照品線(xiàn)性關(guān)系考察

表2 化合物2對(duì)照品線(xiàn)性關(guān)系考察

2.5 精密度實(shí)驗(yàn)

分別準(zhǔn)確吸取同一化合物1和化合物2對(duì)照品溶液20 μL，進(jìn)樣5次，峰面積平均值分別為109.766 0、15.647 0，峰面積積分值RSD(n=5)分別為1.09%和1.46%．

2.6 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取小花清風(fēng)藤粉末5份，按“2.3.1”項(xiàng)操作，制備5份化合物1的供試品溶液，按“2.3.2”項(xiàng)操作，制備5份化合物2的供試品溶液．再分別按“2.1項(xiàng)”色譜條件測(cè)定，測(cè)得化合物1的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.092 13 mg/g，RSD為1.83%．化合物2的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.347 1 mg/g，RSD為1.48%．

2.7 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

分別取化合物1、化合物2供試品溶液進(jìn)樣，在2、4、8、12、24 h后分別進(jìn)樣20 μL，結(jié)果化合物1峰面積RSD為1.72%(n=5)，化合物2峰面積RSD為1.94%(n=5)，表明供試品溶液室溫下放置24 h基本穩(wěn)定．

2.8 加樣回收實(shí)驗(yàn)

精密稱(chēng)定已知化合物1對(duì)照品質(zhì)量分?jǐn)?shù)的供試品5份，分別加入與樣品質(zhì)量分?jǐn)?shù)相當(dāng)?shù)幕衔?對(duì)照品，按“2.3.1”項(xiàng)方法進(jìn)行樣品處理．再精密稱(chēng)定已知化合物2對(duì)照品質(zhì)量分?jǐn)?shù)的供試品5份，分別加入與樣品質(zhì)量分?jǐn)?shù)相當(dāng)?shù)幕衔?對(duì)照品，按“2.3.2”項(xiàng)方法進(jìn)行樣品處理．再按照“2.1”項(xiàng)色譜條件測(cè)定，記錄峰面積，分別測(cè)定化合物1和化合物2質(zhì)量分?jǐn)?shù)，計(jì)算加樣回收率．結(jié)果見(jiàn)表3、4．

表3 化合物1加樣回收率測(cè)定結(jié)果

表4 化合物2加樣回收率測(cè)定結(jié)果

2.9 樣品含量測(cè)定

取3份小花清風(fēng)藤粉末，每份約14.8 g，精密稱(chēng)定，按“2.3.1”項(xiàng)方法制備化合物1的供試品溶液，注入液相色譜儀，按照“2.1”項(xiàng)色譜條件測(cè)定峰面積．再取3份小花清風(fēng)藤粉末，每份約17.5 g，精密稱(chēng)定，按“2.3.2”項(xiàng)方法制備化合物2的供試品溶液，注入液相色譜儀，按照“2.1”項(xiàng)色譜條件測(cè)定峰面積．計(jì)算樣品中化合物1和化合物2的含量．結(jié)果見(jiàn)表5、6．

表5 化合物1樣品測(cè)定結(jié)果

表6 化合物2樣品測(cè)定結(jié)果

3 分析與討論

1)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，小花清風(fēng)藤中化合物1的質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到0.092 13 mg/g．采用色譜條件：乙睛-水(90∶10)；流速為：1.0 mL/min；柱溫30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為203 nm，化合物1與其他組分分離度好．小花清風(fēng)藤中化合物2的質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到0.347 1 mg/g．采用色譜條件：甲醇-水(83∶17)；流速為：1.0 mL/min；柱溫30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為203 nm，化合物2與其他組分分離度好．

2)該研究表明，HPLC測(cè)定小花清風(fēng)藤中化合物1和化合物2的含量可行、穩(wěn)定、簡(jiǎn)便、靈敏、準(zhǔn)確，為清風(fēng)藤科清風(fēng)藤屬小花清風(fēng)藤藥材的開(kāi)發(fā)利用及質(zhì)量控制提供一定的參考．