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    聯(lián)合檢測尿液微小核糖核酸375 和微小核糖核酸145-5p 水平在膀胱癌診斷和預(yù)后的臨床價值

    2020-11-22 10:03:50張菊根吳振啟
    安徽醫(yī)藥 2020年11期
    關(guān)鍵詞:膀胱癌尿液靈敏度

    張菊根,吳振啟

    作者單位:復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院青浦分院泌尿科,上海201799

    膀胱癌是泌尿科的常見惡性腫瘤,多數(shù)為上皮細(xì)胞癌,由于起病較為隱匿,早期診斷仍較為困難。微小核糖核酸(miRNAs)是一類具有重要生物學(xué)功能的內(nèi)源性非編碼單鏈RNA,具有癌基因和抑癌基因的類似作用,參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程,在腫瘤的診斷,預(yù)后判斷和靶向治療具有重要意義[1-2]。目前miRNAs在膀胱癌的研究主要集中在組織標(biāo)本或者血液標(biāo)本,而對尿液的研究較少。有研究表明尿液中的miR-375 可作為膀胱癌的診斷和監(jiān)測復(fù)發(fā)[3],而尿液miR-145 表達(dá)也可以作為膀胱癌的診斷和預(yù)后判斷的指標(biāo)[4],但尿液聯(lián)合檢測miR-375和miR-145-5p 是否能夠提高膀胱癌診斷和預(yù)后的效能,未見報道。本組研究通過采集膀胱癌病人的尿液檢測miRNA-375和miR-145-5p水平,觀察其在膀胱癌發(fā)生發(fā)展,診斷和預(yù)后中的臨床價值,現(xiàn)報告如下。

    1 資料與方法

    1.1 一般資料 選擇2012年1月至2016年1月在復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院青浦分院就診確診為膀胱癌的病人112 例,為膀胱癌組。其中男64 例,女48例,年齡(63.24±10.61)歲,年齡范圍為37~79 歲,腫瘤部位:膀胱底51 例,膀胱體37 例和三角區(qū)24 例;腫瘤分期:Ta-T139 例,T2-T473 例。選擇同期在我院行健康體檢者45 例,為健康對照組,男24 例,女21例,年齡(62.92±9.16)歲,年齡范圍為38~79 歲。納入標(biāo)準(zhǔn):所有病人均經(jīng)病理學(xué)確診為膀胱癌;所有病人或其近親屬均簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn):嚴(yán)重的心肝腎等重要臟器功能障礙;其他惡性腫瘤,免疫性疾病和血液性疾病;精神性和智力性疾病影響隨訪;術(shù)前右化療,放療和靶向治療;有泌尿系統(tǒng)其它疾病如結(jié)石,感染等;病人資料不完整。兩組在年齡和性別等一般資料無明顯差別,具有可比性。本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。

    1.2 方法

    1.2.1 尿液標(biāo)本的保存 病人入院時,禁飲食12 h后收集中后段尿液100 mL,放置在低溫冰箱中保存,并在2 h內(nèi)予以離心,離心速度3 000 r/min,時間30 min,并分裝在RNA 酶處理過的Eppendorf 管中,保存在-80 ℃的冰箱中。

    1.2.2 實時定量PCR 根據(jù)Trizol 說明書,取尿液上清液用紫外光光度計分別檢測在230 nm,260 nm和280 nm 處的吸收值。實驗采用Primer Premier 5.0 軟件涉及引物。miRNA-375 引物序列,正向5′-TTTGTTCGTTCGGCTCGC-3′,反向 5′-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3′;miR-145-5p 的引物序列,正向 5′-GTCCAGTTTTCCCAGGAATC-3′,反向 5′-AGAACAGTATTTCCAGGAAT-3′;U6 引物序列,正向 5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′,反向 5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。使用 20 μL 的 cDNA的合成反應(yīng)體系,使用PCR 擴(kuò)增儀,分別在26 ℃,42 ℃和85 ℃的溫度下,分別反應(yīng)30 min,30 min 和10 min。最后將引物,定量PCR Master Mix,Taq DNA 聚合酶和 cDNA 模板加入 ddH2O 中形成 20μL的反應(yīng)體系。反應(yīng)過程:分別在95 ℃,95 ℃和60 ℃,分別反應(yīng)時間3 min,12 s和40 s,總共40個循環(huán)。以 U6 為內(nèi)參,測定 CT 值。采用 2-△△CT表示miRNA-375和miR-145-5p相對表達(dá)量,其中△△CT=膀胱癌組(CT目的基因-CTU6)-健康對照組(CT目的基因-CTU6)。每個樣本重復(fù)3次。

    1.2.3 觀察指標(biāo) 觀察膀胱癌組和健康對照組尿液miRNA-375和miR-145-5p水平的差異,膀胱癌病人尿液miRNA-375 和miR-145-5p 表達(dá)水平術(shù)前術(shù)后變化,與臨床指標(biāo)和預(yù)后的關(guān)系,及其在診斷膀胱癌和判斷其預(yù)后的靈敏度和特異度。

    1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 使用SPSS 21.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計量資料采用表示,多組比較采用方差分析,兩兩比較采用SNK-q比較,兩組比較采用t檢驗。計數(shù)資料采用率表示,率的比較采用χ2檢驗。采用logistic二元回歸分析得出尿液miRNA-375和miR-145-5p水平聯(lián)合變量檢測膀胱癌和預(yù)后發(fā)生情況。用MedCalc 軟件包繪制出受試者曲線(ROC)評價診斷和預(yù)后的靈敏度和特異度。P<0.05 視為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 兩組尿液miRNA-375和miR-145-5p表達(dá)的比較 從表1 和圖1 可知,膀胱癌組尿液miRNA-375表達(dá)明顯高于健康對照組(P<0.01),術(shù)后較術(shù)前明顯降低(P<0.01),而miR-145-5p的表達(dá)明顯低于健康對照組(P<0.01),術(shù)后較術(shù)前明顯升高(P<0.01)。

    表1 膀胱癌112例與健康體檢者45例尿液miRNA-375和miR-145-5p表達(dá)的比較/

    表1 膀胱癌112例與健康體檢者45例尿液miRNA-375和miR-145-5p表達(dá)的比較/

    組別健康對照組膀胱癌組術(shù)前術(shù)后例數(shù)45 miRNA-375/(2-ΔΔCT)2.30±0.54 miR-145-5p/(2-ΔΔCT)2.68±0.61 112 112 3.95±1.26 2.43±1.08 1.48±0.75 2.56±0.67

    圖1 各組尿液miRNA-375和miR-145-5p表達(dá)的比較

    2.2 尿液miRNA-375和miR-145-5p表達(dá)在診斷膀胱癌的效能 從表2 和圖2 可知,尿液miRNA-375和miR-145-5p 表達(dá)在診斷膀胱癌具有較高的靈敏度和特異度,將尿液miRNA-375和miR-145-5p表達(dá)水平進(jìn)行回歸的方程2.678XmiRNA-375-2.617XmiR-145-5p-0.996,聯(lián)合檢測的靈敏度87.5%,特異度93.3%,其曲線下面積明顯高于 miRNA-375(z=2.316,P=0.021)和 miR-145-5p(z=2.727,P=0.006)單獨檢測,而miRNA-375 和miR-145-5p 之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(z=0.921,P>0.05)。

    2.3 尿液miRNA-375和miR-145-5p表達(dá)水平與臨床指標(biāo)的關(guān)系 從表3可知尿液miRNA-375和miR-145-5p 表達(dá)水平與性別、年齡、腫瘤部位和腫瘤分級無明顯相關(guān)性(P>0.05),而與腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤數(shù)目具有明顯相關(guān)性(P<0.01)。

    表2 尿液miRNA-375和miR-145-5p表達(dá)在診斷膀胱癌的效能

    圖2 聯(lián)合檢測曲線下面積在診斷膀胱癌的效能

    2.4 尿液miRNA-375和miR-145-5p表達(dá)水平與膀胱癌預(yù)后的關(guān)系 膀胱癌病人隨訪3年,出現(xiàn)23例死亡,89 例存活,死亡組的miRNA-375 表達(dá)水平明顯高于存活組(P<0.01),而miR-145-5p表達(dá)水平明顯低于存活組(P<0.01)。見表4。

    表4 尿液miRNA-375和miR-145-5p表達(dá)水平與膀胱癌預(yù)后的關(guān)系/

    表4 尿液miRNA-375和miR-145-5p表達(dá)水平與膀胱癌預(yù)后的關(guān)系/

    miR-145-5p 0.78±0.36 1.66±0.72 5.668 0.000例數(shù)23 89組別死亡組存活組t 值P 值miRNA-375 5.49±1.42 3.55±0.84 8.431 0.000

    2.5 尿液miRNA-375和miR-145-5p表達(dá)水平在預(yù)測3年內(nèi)出現(xiàn)死亡的效能 從表5和圖3可知,尿液miRNA-375表達(dá)水平在預(yù)測膀胱癌3年內(nèi)出現(xiàn)死亡的靈敏度為78.3%,特異度95.5%,其曲線下面積為0.891;而尿液miR-145-5p 表達(dá)水平在預(yù)測膀胱癌3年內(nèi)出現(xiàn)死亡的靈敏度為95.7%,特異度為70.8%,曲線下面積為0.856。兩者聯(lián)合檢測并不能提高預(yù)測3年內(nèi)出現(xiàn)死亡的診斷效能。

    3 討論

    MicroRNAs 是20 個核苷酸左右的非編碼單鏈RNA,至今至少發(fā)現(xiàn)超過1 000 種以上的miRNA 參與了30%以上的基因調(diào)控,并在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平進(jìn)行調(diào)控?,F(xiàn)有的研究證實miRNA 具有很強的組織和細(xì)胞特異度,一旦出現(xiàn)異常,對疾病的診斷和預(yù)后的判斷具有重要價值[5]。檢測miRNA 的標(biāo)本可以是組織,血液和尿液,而尿路上皮癌選擇尿液具有明顯的優(yōu)勢[6],由于尿液與腫瘤組織直接接觸,腫瘤細(xì)胞和及其釋放細(xì)胞因子在尿液中有著不同程度表達(dá),并且標(biāo)本易得,miRNA 在尿液中的穩(wěn)定性高于血液和組織標(biāo)本;尿液的pH 值對miRNA 影響很小,其室溫下放置72 h甚至反復(fù)凍融7次,尿液的miRNA變化依然不大[7],故運用于臨床miRNA的檢測具有較高的臨床檢測價值。

    表3 尿液miRNA-375和miR-145-5p表達(dá)水平與臨床指標(biāo)的關(guān)系/

    表3 尿液miRNA-375和miR-145-5p表達(dá)水平與臨床指標(biāo)的關(guān)系/

    例數(shù)miRNA-375/(2-ΔΔCT)miR-145-5p/(2-ΔΔCT)臨床指標(biāo)性別t(F)值0.083男女年齡64 48 3.96±1.30 3.94±1.21 P值0.934 t(F)值1.476 P值0.143 1.39±0.71 1.60±0.79 1.503<65 歲≥65 歲腫瘤部位膀胱底膀胱體三角區(qū)腫瘤分級高級別低級別腫瘤分期Ta~T1 T2~T4淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移47 65 4.16±1.21 3.80±1.28 0.1360.7660.445 1.42±0.69 1.53±0.79(1.734)51 37 24 4.06±1.22 3.64±1.11 4.19±1.50 0.170(0.287)0.752 1.45±0.70 1.46±0.76 1.58±0.85 0.418 55 57 4.00±1.21 3.90±1.32 0.6770.9840.327 1.41±0.70 1.55±0.80 9.777 39 73 2.78±0.57 4.58±1.07 0.00014.6170.000 2.31±0.37 1.04±0.47 11.975是 否51 61 4.98±1.03 3.09±0.62腫瘤數(shù)目單發(fā)多發(fā)0.00016.2030.000 0.80±0.34 2.06±0.46 12.071 62 50 3.10±0.62 5.00±1.03 0.00016.4070.000 2.05±0.46 0.78±0.33

    表5 尿液miRNA-375和miR-145-5p表達(dá)水平在預(yù)測3年內(nèi)出現(xiàn)死亡的效能

    圖3 預(yù)測膀胱癌3年內(nèi)出現(xiàn)死亡的ROC曲線下面積的比較

    miRNA-375 最早發(fā)現(xiàn)在哺乳動物β 細(xì)胞中發(fā)現(xiàn),作用于胰腺小島,通過血糖激素水平的變化來調(diào)整胰島素的分泌[8]。隨后發(fā)現(xiàn)miRNA-375在各種器官和組織均有表達(dá),是一種多功能的miRNA,與胰島細(xì)胞,肺表面活性物質(zhì)分泌,黏膜免疫和腫瘤的發(fā)生發(fā)展均具有重要意義。miRNA-375 在不同的腫瘤表達(dá)不同,在胃癌的研究中發(fā)現(xiàn),胃癌組織miRNA-375 表達(dá)明顯低于胃正常組織,并對胃癌細(xì)胞的增殖和遷移具有明顯的抑制作用[9]。同樣在結(jié)腸癌的miRNA-375表達(dá)明顯低于結(jié)腸正常組織,并且發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染miRNA-375 基因到結(jié)腸癌細(xì)胞后能夠明顯抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖和遷移,具有明顯抑制癌作用[10];在前列腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)miRNA-375存高表達(dá),明顯高于健康對照組,并且與前列腺癌臨床病理特征具有明顯的相關(guān)性,具有明顯促癌作用[11]。本組研究表明膀胱癌病人尿液中miRNA-375 表達(dá)明顯高于對照組,手術(shù)后病人尿液中的miRNA-375 水平出現(xiàn)明顯降低,并且發(fā)現(xiàn)與腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤數(shù)目具有明顯相關(guān)性,說明miRNA-375 參與了膀胱癌的發(fā)生發(fā)展過程,并且發(fā)現(xiàn)miRNA-375 與膀胱癌的腫瘤分期具有明顯相關(guān)性。本組研究還發(fā)現(xiàn)在診斷膀胱癌方面具有較高的診斷效能,具有較高的靈敏度和特異度。并且隨訪3年發(fā)現(xiàn)存活組病人尿液miRNA-375表達(dá)水平明顯低于死亡組,并發(fā)現(xiàn)尿液miRNA-375表達(dá)在預(yù)測3年內(nèi)出現(xiàn)死亡具有較高的特異度和靈敏度,故當(dāng)尿液中miRNA-375表達(dá)>4.829,其出現(xiàn)3年內(nèi)死亡的可能性明顯增加,故這部分病人是否采取進(jìn)一步的干預(yù)措施,以降低膀胱癌病人的3年內(nèi)死亡率。

    miR-145-5p 在多種腫瘤細(xì)胞中出現(xiàn)表達(dá)失調(diào),并作為腫瘤的抑制基因調(diào)節(jié)腫瘤的增殖轉(zhuǎn)移和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[12]。在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)明顯低于正常肺組織,并且發(fā)現(xiàn)其具有抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的作用[13];在另一項研究中發(fā)現(xiàn)miR-145-5p具有明顯抑制食管癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移,并發(fā)現(xiàn)與核因子和特異度蛋白1具有明顯關(guān)系[14]。在肝癌的研究中發(fā)現(xiàn)miR-145-5p對肝癌細(xì)胞的增殖,遷移和凋亡具有明顯抑制作用[15],說明miR-145-5p具有明顯抑制癌細(xì)胞的作用。本組研究顯示膀胱癌病人尿液中miR-145-5p表達(dá)明顯低于健康對照組,手術(shù)后較術(shù)前比較出現(xiàn)明顯升高,并且與腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤數(shù)目具有明顯相關(guān)性,說明miR-145-5p參與了膀胱癌的發(fā)生發(fā)展,具有明顯抑癌作用?,F(xiàn)有的研究表明miR-145-5p 能夠明顯促進(jìn)膀胱癌的增殖,遷移和轉(zhuǎn)移作用[16]。本組研究發(fā)現(xiàn)尿液中miR-145-5p表達(dá)在診斷膀胱癌具有較高的診斷效能,當(dāng)尿液中miR-145-5p≤1.225,其診斷膀胱癌具有較高的靈敏度和特異度。膀胱癌死亡組尿液miR-145-5p 表達(dá)明顯低于存活組,并且在診斷3年內(nèi)出現(xiàn)死亡具有較高特異度和靈敏度,但尿液中miR-145-5p表達(dá)≤1.225 具有3年內(nèi)具有較高出現(xiàn)死亡的風(fēng)險。本組研究發(fā)現(xiàn)miRNA-375 和miR-145-5p 分別類似促癌基因和抑癌基因的功能,兩者在膀胱癌中的表達(dá)存在某種平衡,并且發(fā)現(xiàn)兩者聯(lián)合檢測在診斷膀胱癌具有較單一指標(biāo)檢測更高的靈敏度和特異度,其靈敏度87.5%,特異度93.3%,曲線下面積0.959,說明聯(lián)合miRNA-375 和miR-145-5p 指標(biāo)在診斷miR-145-5p膀胱癌明顯提高診斷效能。在預(yù)測3年內(nèi)出現(xiàn)死亡方面,尿液中miRNA-375和miR-145-5p表達(dá)具有較高的效能,聯(lián)合兩個指標(biāo)并不能提高預(yù)測效能。本組通過尿液聯(lián)合檢測miRNA-375和miR-145-5p對膀胱癌診斷和預(yù)后具有一定的優(yōu)勢:尿液標(biāo)本容易獲得,并且能夠反復(fù)獲得,可用作對膀胱癌術(shù)后的動態(tài)監(jiān)測;取標(biāo)本為無創(chuàng),病人依從性強;本組聯(lián)合檢測,較單個指標(biāo)檢測比較明顯提高診斷效能。本研究采用qRT-PCR檢測,需要一定的實驗儀器,對基層醫(yī)院的推廣有一定的難度。

    總之,miRNA-375和miR-145-5p參與了膀胱癌的發(fā)生發(fā)展,尿液中的miRNA-375和miR-145-5p檢測對于膀胱癌的診斷和預(yù)后判斷具有重要臨床價值。

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