肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體蛋白表達(dá)及基因突變與胃癌臨床病理特征的關(guān)系

宗桂娟，尹海兵，李春筍，陳旭東，陶玉，楊磊，趙斌，何松

作者單位：南通市腫瘤醫(yī)院，a病理科，b腫瘤內(nèi)科，江蘇 南通226361

胃癌是我國(guó)最常見的消化道惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和病死率逐年上升，嚴(yán)重危害人類健康［1］。目前，手術(shù)治療是早中期胃癌首選的治療方法，而晚期胃癌的治療則采用以化療聯(lián)合靶向治療為主的綜合治療。過去幾十年，隨著腫瘤生物學(xué)的快速發(fā)展以及腫瘤分子標(biāo)志物的不斷涌現(xiàn)，使眾多靶向藥物應(yīng)運(yùn)而生，如表皮生長(zhǎng)因子（EGFR）、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體（c-Met）以及胰島素樣生長(zhǎng)因子受體等［2］。c-Met蛋白是酪氨酸激酶受體超家族成員之一，由Met原癌基因編碼，是具有磷酸化活性的跨膜受體。它廣泛存在于各種細(xì)胞中，并對(duì)組織生長(zhǎng)發(fā)育有著重要的生理調(diào)節(jié)作用［3］。c-Met與胃腸腫瘤（包括胃癌、結(jié)直腸癌、肝外膽管癌等）密切相關(guān)，在胃癌中表現(xiàn)為過度表達(dá)，但胃癌組織中c-Met 蛋白表達(dá)及基因突變的臨床意義鮮有報(bào)道［4］。本實(shí)驗(yàn)選用c-Met單克隆抗體特異性地檢測(cè)胃癌組織中c-Met蛋白表達(dá)水平，將其與病人臨床病理參數(shù)進(jìn)行相關(guān)性分析，分析c-Met基因突變與蛋白表達(dá)水平是否存在相關(guān)性。旨在探討胃癌發(fā)展過程中c-Met的蛋白表達(dá)及基因突變的臨床意義，為臨床個(gè)性化的診治提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2016年1月至2017年12月南通市腫瘤醫(yī)院住院的胃癌病人246 例。其中男181例，女65例。中位年齡66歲，年齡范圍為40～88歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：無合并其他惡性腫瘤或者胃癌復(fù)發(fā)后再次手術(shù)者，臨床病理資料完整，術(shù)前未行放化療及其他抗腫瘤治療，手術(shù)病理診斷明確為胃癌。病人或近親屬對(duì)研究方案簽署知情同意書。本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。

1.2 主要試劑與儀器 免疫組化所用抗體即用型試劑盒和一抗均購(gòu)自Life technologies 公司；人組織基因組核酸提取試劑盒（貨號(hào)為DE02003）及核酸提取儀均來自上?？埔嗌锟萍加邢薰?；DAKO Omnis全自動(dòng)免疫組化染色儀；ABI9600PCR儀。

1.3 免疫組化 免疫組化染色采用EnVision（二步法）完成。c-Met 一抗工作濃度為1∶500，抗原修復(fù)方式為熱修復(fù)（Trish EDTA pH9.0）97 ℃，30 min。具體操作步驟嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.4 免疫組化結(jié)果判讀 組織樣本來自胃癌病人手術(shù)切除的標(biāo)本。c-Met的表達(dá)以細(xì)胞質(zhì)（部分為細(xì)胞膜）呈棕黃色或棕褐色為陽性染色。每份標(biāo)本置高倍鏡下選取5 個(gè)不同視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)200 個(gè)腫瘤細(xì)胞，由兩位病理醫(yī)師進(jìn)行盲法判讀，計(jì)算陽性腫瘤細(xì)胞所占的百分?jǐn)?shù)。結(jié)果分為4 級(jí)：未見明顯陽性細(xì)胞為“-”；陽性細(xì)胞數(shù)＜25%為“+”；25%～50%為“2+”；＞50%為“3+”；陽性標(biāo)準(zhǔn)定為2+或3+［5］。

1.5 熒光定量PCR 基因組DNA的提取按照試劑盒說明書進(jìn)行；本實(shí)驗(yàn)所用引物為，正向5′-CAG GAT TGA TTG CTG GTG T-3′和反向5′-AAC AAT GTC ACA ACC CAC TG-3′；20 μL PCR 反應(yīng)體系包括 10 μL 的 2×Expfu Mix、15 pmol 的上游引物、15 pmol的下游引物和3μL的樣品，加入PCR水體系補(bǔ)足至20μL；PCR程序如下：95 ℃預(yù)變性5 min，接著進(jìn)行 35 個(gè)擴(kuò)增循環(huán)：95 ℃ 10 s，58 ℃ 35 s，72 ℃ 15 s，隨后72 ℃ 5 min延伸。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 2.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料以例數(shù)或百分率表示，結(jié)果比較采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 c-Met 蛋白表達(dá)與胃癌臨床病理特征的關(guān)系根據(jù)病人的性別、年齡、腫瘤大小、分化程度、臨床分期、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、有無脈管侵犯等病理參數(shù)，將246例病人標(biāo)本進(jìn)行分組。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果顯示c-Met 蛋白表達(dá)陽性率為83.3%，且與病人性別、年齡、腫瘤大小、分化程度、臨床分期、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無明顯關(guān)系（P＞0.05）；與脈管侵犯密切相關(guān)（P＜0.05）。各組c-Met蛋白表達(dá)情況見表1。

表1 C-met蛋白表達(dá)與胃癌臨床特征的相關(guān)性/例

2.2 不同年齡、性別、組織學(xué)分級(jí)胃癌c-Met 基因突變情況 基因檢測(cè)突變率為28%，通過分析發(fā)現(xiàn)c-Met 基因突變頻率在不同性別（P＝0.473）、年齡（P＝0.251）及組織學(xué)分級(jí)（P＝0.709）胃癌病人中無明顯差異。各組c-Met基因突變頻率見表2。

2.3 c-Met基因檢測(cè)與蛋白表達(dá)的相關(guān)性 基因檢測(cè)c-Met突變69例，其中35例免疫組化檢測(cè)結(jié)果為2+，3例免疫組化檢測(cè)結(jié)果為3+，即免疫組化結(jié)果與基因檢測(cè)結(jié)果相同者38例。根據(jù)χ2檢驗(yàn)結(jié)果，c-Met基因檢測(cè)與蛋白表達(dá)的檢出率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝5.369，P＝0.021），兩者關(guān)聯(lián)性低，見表3。

3 討論

近年來分子靶向治療是胃癌治療研究的熱點(diǎn)，HGF/c-Met信號(hào)通路抑制劑作為治療胃癌潛在突破口，主要包括以下三種類型（1）抗HGF單克隆抗體，如 rilotumumab、ficlatuzumab 和 TAK-701［6］；（2）抗 c-Met 單克隆抗體，如 Onartuzumab/MetMAb［7］；（3）小分子酪氨酸酶抑制劑，主要阻止c-Met激酶的激活，如 PHA-6657520［8］。因此檢測(cè)胃癌組織中 c-Met 蛋白表達(dá)水平及基因突變情況，篩選潛在的受益病人，選擇合適的靶向治療方案，對(duì)指導(dǎo)臨床個(gè)體化治療尤為重要。c-Met作為原癌基因編碼的蛋白質(zhì)，被稱為肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（hepatocyte growth factor，HGF）特異性的細(xì)胞膜受體，兩種蛋白結(jié)合組成信號(hào)通路可以參與調(diào)控多種細(xì)胞的增殖、分化及運(yùn)動(dòng)改變［9］。在持續(xù)異常刺激后，使得HGF/c-Met 過度激活引發(fā)下游Ras/MAPK、PI3K/Akt 等信號(hào)通路激活，促進(jìn)細(xì)胞分裂、誘導(dǎo)上皮細(xì)胞遷移和侵襲、促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)降解等最終誘導(dǎo)細(xì)胞癌變［10］。因此研究c-Met 在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用及對(duì)胃癌靶向治療具有重要的臨床意義。

表2 胃癌病人中不同年齡、性別、組織學(xué)分級(jí)群體中c-Met基因的突變頻率/例（%）

表3 c-Met基因突變及c-Met蛋白表達(dá)分布/例（%）

研究表明在結(jié)腸癌、乳腺癌等惡性腫瘤組織中c-Met 過表達(dá)與病人不良預(yù)后呈正相關(guān)［11-12］。2016年谷光福等采用免疫組化分析129例胃癌病人臨床資料發(fā)現(xiàn)c-Met 陽性表達(dá)率為82.9%，且c-Met 蛋白過表達(dá)與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、OS、DFS顯著相關(guān)［13］。本研究結(jié)果顯示246 例胃癌組織中c-Met陽性表達(dá)率為83.3%，c-Met蛋白表達(dá)與病人性別、年齡、腫瘤大小、分化程度、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無明顯關(guān)系（P＞0.05）；但c-Met 蛋白過表達(dá)與脈管侵犯密切相關(guān)（P＜0.05），表明c-Met 過表達(dá)可以促進(jìn)胃癌的侵襲。c-Met 基因突變率為28%，而c-Met 基因突變與性別、年齡及組織學(xué)分化均無明顯關(guān)系。

本實(shí)驗(yàn)采用免疫組化法檢測(cè)c-Met 蛋白的陽性率為83.3%，且c-Met蛋白過表達(dá)僅與脈管侵犯密切相關(guān)，其中陽性率與國(guó)外相關(guān)研究的結(jié)果存在不一致［2，14-15］，主要原因除免疫組化檢測(cè)所用的抗體及方法有關(guān)外，還可能與免疫組化陽性判讀標(biāo)準(zhǔn)不一有關(guān)。此外，本研究結(jié)果顯示胃癌組織中c-Met 基因突變率較低，而c-Met 蛋白陽性率遠(yuǎn)高于基因突變率，主要是由于基因表達(dá)是從DNA轉(zhuǎn)錄翻譯至蛋白質(zhì)過程，其中蛋白質(zhì)的形成過程既可以受轉(zhuǎn)錄調(diào)控也可以受外界調(diào)控因素的影響。因此c-Met的免疫組化結(jié)果不能替代基因檢測(cè)結(jié)果，對(duì)于考慮選用抗c-Met 單克隆抗體治療的病人，可以檢測(cè)c-Met 基因狀態(tài)。本組69 例c-Met 基因突變的胃癌組織中，38例c-Met蛋白過表達(dá)，提示免疫組化法檢測(cè)c-Met對(duì)篩查c-Met基因突變的胃癌病人并沒有甄別作用。

總之，c-Met 基因突變與c-Met 蛋白過表達(dá)具有不一致性。由于c-Met可能參與了胃癌的侵襲，因此檢測(cè)c-Met蛋白表達(dá)情況可以有助判斷病人的發(fā)展及預(yù)后情況。而檢測(cè)c-Met基因狀態(tài)對(duì)臨床指導(dǎo)選用抗c-Met單克隆抗體治療的胃癌病人尤為重要。