正交試驗(yàn)優(yōu)化參白散結(jié)顆粒的水提工藝

吳靜鳴，黃曉青，曹陽，黃順旺

作者單位：1安徽天星醫(yī)藥集團(tuán)有限公司，安徽 合肥230601；2合肥創(chuàng)新醫(yī)藥技術(shù)有限公司，安徽 合肥230088

在婦科領(lǐng)域，中醫(yī)藥在長(zhǎng)期的臨床治療實(shí)踐中積累了豐富的經(jīng)驗(yàn)，有較為獨(dú)特的治療優(yōu)勢(shì)。子宮肌瘤是育齡婦女生殖系統(tǒng)中的最常見的良性腫瘤，發(fā)病率高達(dá)20%～30%，中醫(yī)藥通過辨證論治對(duì)機(jī)體內(nèi)環(huán)境進(jìn)行整體調(diào)節(jié)，有效抑制子宮肌瘤的形成和發(fā)展，可以更好地滿足臨床治療需求。參白散結(jié)顆粒來源于醫(yī)院臨床驗(yàn)方，臨床應(yīng)用多年，數(shù)萬病例，療效確切，安全可靠，處方由黨參、白芍、益母草、白術(shù)、茯苓、炙甘草等九味藥材組成，具有疏肝理氣，活血散結(jié)的功效，主治氣滯血瘀型子宮肌瘤、卵巢囊腫。

原方用以湯劑，使用不便，為此，我們將湯劑改為顆粒劑，為了保證與原湯劑物質(zhì)基準(zhǔn)的一致性，提取工藝仍采用水提，根據(jù)處方中黨參、炒白芍、益母草、白炒術(shù)、茯苓、炙甘草等九味藥材所含成分的理化性質(zhì)［1-6］，本研究自2018年1月至2019年6月采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)選參白散結(jié)顆粒中黨參、炒白芍等九味藥材的最佳水提工藝。以處方中臣藥炒白芍中主要有效成分芍藥苷為指標(biāo)［7］，結(jié)合提取得膏率優(yōu)選該顆粒劑的水提工藝，為該顆粒劑生產(chǎn)工藝提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 試藥與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)試藥 黨參（批號(hào)180412）、白芍（批號(hào)180603）、益母草（批號(hào)180505）等九味藥材均購(gòu)自安徽普仁中藥飲片有限公司，經(jīng)鑒定符合《中國(guó)藥典》2015年版一部相關(guān)項(xiàng)下規(guī)定。芍藥苷對(duì)照品（批號(hào)110736-201713，含量測(cè)定用）購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，乙腈、甲醇為色譜純，水為重蒸餾水，磷酸等試劑均為分析純。

1.2 儀器設(shè)備 微壓循環(huán)中藥煎藥機(jī)（北京東華原醫(yī)療設(shè)備有限公司）；HL-SHZ-95 循環(huán)水式真空泵（河南鞏義市英峪儀器廠）；RE-200E旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海東璽制冷儀器設(shè)備有限公司）；HH-2K4一列回孔智能水浴鍋（鞏義市予華儀器責(zé)任有限公司）；湘儀L-550 型離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司）；Waters高效液相色譜儀；Waters-2998紫外檢測(cè)器；Waters Empower 色譜工作站；6010 紫外-可見分光光度計(jì)（安捷倫科技上海有限公司）；AR1140 型電子天平（上海加惠儀器儀表有限公司）；CQF-I-6超聲波清洗機(jī)（天津奧特賽恩斯儀器公司）；真空干燥箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠）。

2 水提取工藝

2.1 藥材吸水率試驗(yàn) 為了提高正交試驗(yàn)加水量的準(zhǔn)確度，對(duì)藥材的吸水率進(jìn)行考察。按處方配比稱取黨參、白芍等九味藥材，加入10倍量水，密閉浸泡12 h，濾過，量取濾液，計(jì)算吸水率（%），實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。由表1可見，藥材的吸水率約為自身重量的1.9 倍，因此，在正交試驗(yàn)第一次提取時(shí)，需多加1.9倍量的水煎煮。

表1 吸水率測(cè)定表

2.2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)［8-15］以浸膏得率、芍藥苷含量為指標(biāo)，選擇加水量、煎煮時(shí)間、煎煮次數(shù)三個(gè)因素，每個(gè)因素選擇3 個(gè)水平，選用L9（34）正交設(shè)計(jì)，因素水平見表2。

表2 水提取因素水平表

2.3 藥材的提取及浸膏得率的測(cè)定［7］按表2設(shè)計(jì)9 組試驗(yàn)，按處方配比稱取黨參、白芍等九味藥材9份，每份382 g，根據(jù)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)的條件進(jìn)行提取，為提高煎煮效果，將藥材加水浸泡1 h使其浸透后，煎煮，合并提取液，濾過，濾液濃縮，置已恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，70 ℃減壓干燥至恒重后，稱重，計(jì)算浸膏得率。

2.4 浸膏中芍藥苷含量測(cè)定［8-13］

圖1 高效液相色譜圖：A為對(duì)照品，B為供試品，C為陰性對(duì)照

2.4.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 色譜條件：COSMOSIL 5C18-MS-Ⅱ色譜柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；柱溫為25 ℃；流動(dòng)相為乙腈：0.1%磷酸（14∶86）；檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm；流速為1.0 mL/min；進(jìn)樣量為10μL；理論板數(shù)按芍藥苷峰計(jì)算應(yīng)不低于2 000。

2.4.2 對(duì)照品溶液的制備 取芍藥苷對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含60μg，即得。

2.4.3 供試品溶液的制備 取樣品研細(xì)，取約0.3 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加稀乙醇35 mL，密塞，精密稱定重量，超聲處理（功率250 W，頻率25 kHz）30 min，放冷，再稱定重量，用稀乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，用微孔濾膜（0.45 μm）濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4.4 陰性樣品溶液的制備 按處方組成，取除白芍外其余藥材，按制劑工藝制成陰性樣品，按“2.4.3”項(xiàng)下方法，制成陰性對(duì)照溶液。

2.4.5 干擾試驗(yàn) 按照“2.4.1”項(xiàng)色譜條件，將對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性樣品溶液各10μL 分別進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果：供試品中芍藥苷的色譜峰與相鄰色譜峰達(dá)到基線分離，陰性對(duì)照無干擾，見圖1。

2.4.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密稱取芍藥苷對(duì)照品7.5 mg，置25 mL 容量瓶中，加甲醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密吸取0.5、1、2、4、6、8 mL，分別置10 mL量瓶中，用甲醇釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜（0.45μm）濾過，取續(xù)濾液，分別進(jìn)樣量10 μL，按照“2.4.1”項(xiàng)色譜條件測(cè)定，量取峰面積，以對(duì)照品濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程Y＝13 128X-1 893.9，r＝1，結(jié)果表明：芍藥苷在15～240μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4.7 精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.4.2”項(xiàng)下的芍藥苷對(duì)照品溶液10μL，注入液相色譜儀，在“2.4.1”項(xiàng)色譜條件下重復(fù)進(jìn)樣6 次，測(cè)得峰面積，計(jì)算得其RSD為0.12%，表明本法測(cè)定精密度良好。

2.4.8 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批號(hào)樣品共6 份，按“2.4.3”項(xiàng)下方法分別制備6份供試品溶液，在“2.4.1”項(xiàng)色譜條件下測(cè)定，芍藥苷的平均含量為1.12 mg/g，RSD為0.16%，本法重復(fù)性良好。

2.4.9 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液分別于0、2、4、6、8、10 h進(jìn)樣10 μL，測(cè)定芍藥苷的峰面積，計(jì)算得其RSD為1.5%，表明本品在10 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.10 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量為1.12 mg/g的同一批號(hào)的樣品細(xì)粉適量，精密稱定，共6 份，分別加入定量芍藥苷對(duì)照品，按“2.4.3”項(xiàng)下方法制備，在“2.4.1”項(xiàng)色譜條件下測(cè)定，并按外標(biāo)法以芍藥苷峰面積計(jì)算，平均回收率為108.00%，RSD為0.98%。

2.4.11 測(cè)定方法 分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各10μL，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，代入線性方程，計(jì)算芍藥苷（C23H28O11）的含量。

2.5 正交試驗(yàn)方法與結(jié)果 由表3直觀分析可知，以浸膏得率為考察指標(biāo)時(shí)，A3＞A2＞A1，B2＞B3＞B1，C3＞C2＞C1，最佳工藝條件為A3B2C3。以芍藥苷含量為 考 察 指 標(biāo) 時(shí) ，A3＞A2＞A1，B2＞B3＞B1，C3＞C2＞C1，最佳工藝條件為A3B2C3。

表3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

由表4 方差分析可知，以浸膏得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)時(shí)，A因素、C因素均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，B因素差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且重要性依次為A＞C＞B；以芍藥苷含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)時(shí)，A 因素和B 因素差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，C 因素差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，重要性依次為C＞A＞B。

綜合考慮，水提最佳工藝為A3B2C3，即10 倍量（考慮藥材吸水率，第一次多加1.9 倍量）水，煎煮3次，每次2 h。合并煎液，濾過，濾液靜置，取上清液備用。

2.6 工藝驗(yàn)證 取3份藥材（每份382 g），將A3B2C3組合平行試驗(yàn)3 次，結(jié)果浸膏得率分別為37.59%，37.83%，38.35%，平均值為37.92%，RSD 為1.02%；芍藥苷的量分別為425.62 mg，430.37 mg，433.84 mg，平均值為429.94 mg，RSD為0.96%。

表4 方差分析

3 討論

3.1 多基原藥材的確定［7］本處方各味藥材中，黨參、炙甘草為多基原藥材，本試驗(yàn)采用黨參藥材為桔梗科植物黨參Codonopsis pilosula（Franch.）Nannf.，炙甘草藥材為豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch。

3.2 含量測(cè)定指標(biāo)的選擇及轉(zhuǎn)移率計(jì)算［1，3，7］本處方有由九味藥材組成，黨參為君藥，炒白芍、益母草為臣藥，炒白術(shù)、茯苓等為佐藥。其中黨參、白術(shù)、茯苓在中國(guó)藥典標(biāo)準(zhǔn)項(xiàng)下暫未收載含量測(cè)定指標(biāo)；在此處方中，在HPLC-ELSD 條件下益母草中的鹽酸水蘇堿、鹽酸益母草堿與其它峰未得到較好分離，暫不作為考核指標(biāo)；因此，我們選擇炒白芍中的芍藥苷作為含量測(cè)定指標(biāo)，所選方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、靈敏度高，可用于水提工藝的含量考察指標(biāo)。投料藥材炒白芍中芍藥苷含量為1.24%，同時(shí)根據(jù)處方中炒白芍所占比例，計(jì)算出水提工藝得到的干膏中芍藥苷的含量，其轉(zhuǎn)移率穩(wěn)定在75%左右，轉(zhuǎn)移率高。本研究?jī)?yōu)選出的水提工藝穩(wěn)定，干膏得率適中，主要有效成分轉(zhuǎn)移率高，為參白散結(jié)顆粒的中試、大生產(chǎn)提供試驗(yàn)依據(jù)。