姜黃素通過FoxO3a/Wnt信號途徑抑制去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松的作用研究

楊青坡 王法正 邱 紅 李 路 楊化群 穆合塔爾·麥麥提熱夏提

1.新疆維吾爾自治區(qū)喀什地區(qū)第一人民醫(yī)院運動醫(yī)學(xué)科，新疆喀什 844000；2.新疆維吾爾自治區(qū)喀什地區(qū)第一人民醫(yī)院護理部，新疆喀什 844000

骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病機制雖然復(fù)雜，但仍以氧化應(yīng)激為主[1-2]。近些年，關(guān)于叉頭框蛋白O（FoxO）通路和抑制分泌型糖蛋白（Wnt）通路在氧化應(yīng)激介導(dǎo)的骨質(zhì)疏松中的研究逐漸增多[3-5]。因此，基于調(diào)控FoxO/Wnt通路的抗氧化活性物質(zhì)成為抗骨質(zhì)疏松藥物研發(fā)的重中之重。姜黃素因抗氧化、抗炎、抗細菌、抗癌等特點而廣泛用于治療慢性炎癥性疾病，在骨質(zhì)疏松治療中具有良好的應(yīng)用前景[6-7]。本研究通過大鼠去卵巢骨質(zhì)疏松模型，探究姜黃素對該模型的抑制作用機制，旨在完善骨質(zhì)疏松病癥的治療方案，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

研究時間：2018年3月～2019年5月。

研究條件：（1）在取得南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院實驗動物倫理委員會批準（倫理審批號：NFYY-2019-46）情況下進行研究；（2）本次動物實驗的開展參照美國衛(wèi)生部頒布的《實驗動物使用和關(guān)愛指南》受到了人道待遇（NIH頒布86-23，1986年修訂）；（3）研究中所選擇的SD大鼠均購自南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，并且具備實驗動物生產(chǎn)許可證號[SCXK (粵)2006-0015]。

研究對象：SD大鼠，均為雌性，平均體重（240.0±9.8）g。

1.1.1 藥物及試劑 姜黃素（廣州寶策生物科技有限公司，純度98%，生產(chǎn)批號：C20164）；降鈣素（CT）；大鼠骨鈣素（BGP）；丙二醛（MDA）；過氧化氫酶（CAT）；核轉(zhuǎn)錄因子-B受體活化因子配體（RANKL）酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（廣州寶策生物科技有限公司，生產(chǎn)批號分別 為：20181525、20181481）；骨 保 護 素（OPG）；nti-β-catenin、anti-FoxO3a及anti-β-Actin抗體（美國Cell Signaling Technology公司，貨號分別為：12547L、12772S、12815P）；a二氯熒光素二乙酸鹽DCFH-DA（美國Sigma-Aldrich公司，貨號：13029S）。

1.1.2 儀器 858Mini Bionix型材料測試系統(tǒng)（美國MTS公司）；Infinite M200酶標儀（芬蘭Thermo公司）；Lunar Prodigy DEXA骨密度（美國GE公司）；半自動圖象分析儀（美國OsteoMesure公司）；Z-323型高速冷凍離心機（德國Hermle公司）；Mx3005P QPCR System（美國CStratagene公司）。

1.2 方法

1.2.1 模型建立及分組 選取32只雌性SD大鼠，參照文獻方法[8]，將其中24只大鼠的雙側(cè)卵巢摘除，且復(fù)制為絕經(jīng)后大鼠骨質(zhì)疏松動物模型（模型組），其余8只大鼠無需任何處理（對照組）。術(shù)后0.5年，按照電腦隨機分組法對模型組進行分組，即模型1組（8只）、白藜蘆醇組（8只）、姜黃素組（8只），其中白藜蘆醇組體重為5mg/（kg·d），姜黃素組體重為20mg/（kg·d），按給藥體積為10mL/kg，對白藜蘆醇組、姜黃素組分別給予相應(yīng)劑量姜黃素（廣州寶策生物科技有限公司，生產(chǎn)批號：C20164）及白藜蘆醇（陜西慈緣生物技術(shù)有限公司，純度98%）灌胃；對照組、模型1組給予同體積的0.5%羧甲基纖維素鈉鹽（CMC-Na），1次/d，連用8周。

1.2.2 檢測方法

1.2.2.1 骨代謝指標檢測 給藥后，準確測量大鼠體重，予以麻醉（10%水合氯醛腹腔注射），采集股動脈血，離心處理，留取血清，保存在-80℃冰箱。采用ELISA法測定血清CT、OPG、BGP、RANKL含量，操作按說明書進行[9]。

1.2.2.2 測定骨密度、骨生物力學(xué) 處死大鼠后，明確右股骨、脛骨、第4腰椎椎體的具體位置，然后將其分離，再選擇股骨全段/腰椎全段為測量點，使用骨密度儀測定骨密度（BMD）[10]。按照跨距15mm、加載速度0.01mm/s，采用三點彎曲法完成脛骨生物力學(xué)測定，注意準確記錄脛骨最大載荷、最大應(yīng)力[11]。

1.2.2.3 氧化應(yīng)激指標檢測 分離血清后按操作說明書行血清MDA、CAT、SOD水平的含量測定。大鼠脛骨骨髓組織采用熒光探針2'，7'-二氯熒光黃雙乙酸鹽（DCFH-DA）檢測活性氧（ROS）水平[12-13]。

1.2.2.4 Western blot檢測 分離左股骨組織，使用不連續(xù)丙烯酰胺凝膠電泳對目的蛋白進行分離，然后轉(zhuǎn)膜固定，5%脫脂牛奶的TBST緩沖液封閉1h，加入一抗（anti-β-catenin及anti-FoxO3a，1∶2000）后4℃孵育搖晃過夜，TBST沖洗孵育二抗（1∶3000）后，室溫孵育2h后電化學(xué)發(fā)光法（ECL）曝光顯色，β-Actin作為內(nèi)參。Alpha圖像分析軟件對目標帶光密度值行半定量分析。

1.2.2.5 QPCR檢測 采用Gadd45α和Axin2特異性引物進行聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

選擇SPSS17.0統(tǒng)計學(xué)軟件為處理工具，計量資料用均數(shù)±標準差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 姜黃素對骨質(zhì)疏松大鼠血清骨代謝指標的影響

模型1組 的CT、OPG水 平低于 對 照組，但BGP、RANKL水平高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；姜黃素組、白藜蘆醇組的CT與OPG水平高于模型1組，但BGP、RANKL水平低于模型1組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 姜黃素對骨質(zhì)疏松大鼠血清骨代謝指標的影響（±s，μg/L）

表1 姜黃素對骨質(zhì)疏松大鼠血清骨代謝指標的影響（±s，μg/L）

組別 n CT OPG BGP RANKL對照組 8 2.54±0.22 902.84±28.72 0.84±0.12 0.34±0.11模型1組 8 1.29±0.24 864.29±30.14 1.19±0.17 0.67±0.09白藜蘆醇組 8 2.31±0.13 996.34±29.76 0.93±0.13 0.45±0.15姜黃素組 8 2.29±0.36 951.42±27.17 0.89±0.09 0.51±0.07 F/P 6.562/0.001 10.731/0.001 20.528/0.001 17.794/0.001 q/P對照組與模型1組比較 11.482/0.001 3.725/0.020 5.822/0.001 4.710/0.001 q/P白藜蘆醇組與模型1組比較 11.029/0.001 19.392/0.001 4.621/0.004 6.183/0.003 q/P姜黃素組與模型1組比較 5.802/0.001 6.103/0.001 7.602/0.001 8.815/0.001

2.2 姜黃素對骨質(zhì)疏松大鼠骨密度和骨生物力學(xué)的影響

模型1組的腰椎及股骨的BMD、脛骨的最大載荷、最大應(yīng)力均低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；姜黃素組、白藜蘆醇組的腰椎及股骨的BMD、脛骨的最大載荷、最大應(yīng)力均高于模型1組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

表2 姜黃素對骨質(zhì)疏松大鼠骨密度和骨生物力學(xué)的影響（±s）

表2 姜黃素對骨質(zhì)疏松大鼠骨密度和骨生物力學(xué)的影響（±s）

組別 n 腰椎BMD（mg/cm2） 股骨BMD（mg/cm2） 脛骨的最大載荷（N） 最大應(yīng)力（MPa）對照組 8 200.54±19.34 193.86±24.61 159.32±10.68 224.52±19.35模型1組 8 108.33±20.25 96.78±17.62 99.25±17.36 128.33±15.48白藜蘆醇組 8 167.17±14.08 157.11±19.52 146.85±19.51 179.81±17.39姜黃素組 8 159.62±17.53 136.78±20.08 134.76±15.47 160.42±23.57 F/P 21.386/0.001 15.269/0.001 20.591/0.001 12.577/0.001 q/P對照組與模型1組比較 4.893/0.001 7.026/0.001 9.491/0.001 11.358/0.001 q/P白藜蘆醇組與模型1組比較 7.562/0.001 8.901/0.001 11.531/0.001 3.702/0.001 q/P姜黃素組與模型1組比較 6.782/0.001 9.384/0.001 4.781/0.001 7.207/0.006

2.3 姜黃素對骨質(zhì)疏松大鼠氧化應(yīng)激指標的影響

模型1組的MDA、ROS水平高于對照組，但SOD、CAT水平低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；姜黃素組、白藜蘆醇組的MDA及ROS水平低于模型1組，但SOD和CAT水平高于模型1組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表3。

表3 姜黃素對骨質(zhì)疏松大鼠氧化應(yīng)激指標的影響（±s）

表3 姜黃素對骨質(zhì)疏松大鼠氧化應(yīng)激指標的影響（±s）

組別 n MDA（μmol/L） SOD（U/mL） CAT（U/mL） ROS（AFU，×1000）對照組 8 3.35±1.03 128.46±40.73 35.92±6.48 562.77±163.53模型1組 8 7.94±1.14 70.56±24.51 21.03±4.05 2784.81±301.05白藜蘆醇組 8 5.37±0.98 105.08±17.31 32.96±3.82 1342.98±186.54姜黃素組 8 5.81±1.17 100.47±15.79 30.69±4.11 1499.37±175.41 F/P 35.901/0.001 6.835/0.003 17.902/0.001 56.978/0.001 q/P對照組與模型1組比較 7.904/0.001 4.826/0.004 7.018/0.001 17.582/0.001 q/P白藜蘆醇組與模型1組比較 9.458/0.001 3.948/0.006 19.492/0.001 23.639/0.001 q/P姜黃素組與模型1組比較 4.026/0.002 4.847/0.012 18.773/0.001 16.594/0.001

2.4 姜黃素對FoxO3a/Wnt通路的影響

模型1組大鼠骨組織中FoxO3a蛋白及Gadd45α基因的表達高于對照組，但β-catenin蛋白和Axin2基因的表達低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；姜黃素組及白藜蘆醇組FoxO3a蛋白、Gadd45α基因的表達低于模型1組，但β-catenin蛋白、Axin2基因的表達高于模型1組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表4。

表4 姜黃素對骨質(zhì)疏松大鼠FoxO3a/Wnt通路的影響（±s）

表4 姜黃素對骨質(zhì)疏松大鼠FoxO3a/Wnt通路的影響（±s）

組別 n FoxO3a/β-Actin Gadd45α β-catenin/β-Actin Axin2對照組 8 0.16±0.03 1.01±0.12 0.71±0.02 1.03±0.21模型1組 8 0.29±0.08 7.83±1.76 0.45±0.09 0.29±0.14白藜蘆醇組 8 0.18±0.03 2.53±0.97 0.67±0.07 0.77±0.16姜黃素組 8 0.17±0.06 2.31±0.82 0.58±0.02 0.93±0.24 F/P 29.658/0.001 32.014/0.001 27.926/0.001 47.173/0.001 q/P對照組與模型1組比較 5.821/0.001 9.692/0.001 6.362/0.001 7.337/0.001 q/P白藜蘆醇組與模型1組比較 7.236/0.003 10.552/0.001 9.632/0.001 7.559/0.001 q/P姜黃素組與模型1組比較 3.936/0.004 32.015/0.001 6.269/0.001 6.558/0.001

3 討論

作為常見的一種全身性骨病，骨質(zhì)疏松癥具有較高患病率，統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)我國超過60歲老年人中骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生率為36%[14-15]。該病的發(fā)生與多種原因有關(guān)，但介于伴有骨代謝病理變化，所以普遍認為與氧化應(yīng)激介導(dǎo)有關(guān)[16]。然而，目前尚未尋到通過抗氧化應(yīng)激機制可以起到抗骨質(zhì)疏松作用的藥物。因此，衰老與氧化應(yīng)激轉(zhuǎn)成為抗骨質(zhì)疏松的焦點。

近些年，姜黃素的抗氧化作用機制得到了廣泛證實[17-18]。而白藜蘆醇對衰老進程具有明顯的延緩作用，再加上維持BMD特點[19]。所以，建議對其抗骨質(zhì)疏松方面研究展開深入探索，但關(guān)于白藜蘆醇的非靶標作用較少，導(dǎo)致其藥學(xué)應(yīng)用受限?；诖?，本研究選擇白藜蘆醇為對照組，比較探究姜黃素的應(yīng)用效果，重點分析其在抗氧化應(yīng)激調(diào)控下對骨質(zhì)疏松的作用機制。

BMD、骨生物力學(xué)指標常用于預(yù)測骨折危險性、評定骨脆性，當(dāng)前者水平低、后者改變，即可體現(xiàn)出藥物對骨質(zhì)疏松癥的治療效果。CT、BGP是用于評價骨代謝的常用指標之一，兩者水平變化呈正相關(guān)。OPG、RANKL參與骨重建過程，并且是連接骨形成、骨吸收的關(guān)鍵分子，而OPG是RANKL的誘餌受體，二者結(jié)合可抑制破骨細胞形成[20-21]。本研究結(jié)果顯示，模型1組血清CT、OPG水平較對照組低，但BGP、RANKL水平明顯增高，且呈下降趨勢發(fā)展，表明姜黃素、白藜蘆醇能夠抑制卵巢誘導(dǎo)大鼠上述指標的改變?？梢?，姜黃素、白藜蘆醇具有不同程度的抗骨質(zhì)疏松作用。

MDA是評估脂質(zhì)過氧化作用的敏感性標志物。CAT、SOD則是體內(nèi)抗氧化體系的主要分子。活性氧自由基（ROS）是機體內(nèi)正常新陳代謝所產(chǎn)生的一類氧化劑。如果ROS積累過多/抗ROS缺陷，便會造成機體氧化還原系統(tǒng)失衡[22]。本研究結(jié)果得出，模型1組MDA、ROS水平升高，但SOD、CAT水平降低，表明骨質(zhì)疏松易增加骨組織中氧化應(yīng)激水平，本研究結(jié)果與文獻報道基本一致[23]，提示使用姜黃素、白藜蘆醇有助于對抗骨質(zhì)疏松引起的氧化應(yīng)激損傷。

本研究結(jié)果還顯示，骨質(zhì)疏松大鼠骨組織中Gadd45α及FoxO3a水平明顯升高，提示上調(diào)的FoxO3a通路可促進氧化應(yīng)激加重，增加骨質(zhì)疏松風(fēng)險。通過使用姜黃素，可有效降低二者的表達水平，獲取良好的抗骨質(zhì)疏松效果，考慮與通過抑制FoxO3a通路、緩解氧化應(yīng)激有關(guān)。Wnt/β-catenin通路屬于骨內(nèi)穩(wěn)態(tài)通路，其通過關(guān)鍵信號分子β-catenin調(diào)控骨形成的過程，通過激活Wnt/β-catenin通路，抑制氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松。

作為Wnt通路的靶基因，Axin2表達水平能夠直接反映Wnt信號通路的整體活性。本研究結(jié)果提示，骨質(zhì)疏松能夠抑制Wnt/β-catenin通路，而姜黃素可以顯著升高Axin2、β-catenin表達水平，進一步說明激活的FoxO3a通路可能間接抑制Wnt/β-catenin通路，誘發(fā)骨質(zhì)疏松，而姜黃素發(fā)揮抗骨質(zhì)疏松作用的部分干預(yù)機制與降低Fox03a轉(zhuǎn)錄活性、抑制解除Wnt通路有關(guān)。

總之，姜黃素的應(yīng)用價值較高，能夠通過抑制緩解氧化應(yīng)激反應(yīng)達到調(diào)節(jié)FoxO3a/Wnt通路的目的，進而延緩卵巢大鼠骨質(zhì)疏松進展，改善預(yù)后。