OSAHS患者外周血Th17細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)及臨床意義*

章哪哪， 李本農(nóng)， 許偉民， 李艷妮

武漢市第四醫(yī)院，華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬普愛(ài)醫(yī)院耳鼻咽喉科，武漢 430034

阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征(obstructive sleep apnea hypopnea syndrome，OSAHS)是一種常見(jiàn)的慢性睡眠呼吸性疾病，由睡眠時(shí)反復(fù)上氣道阻塞引起，可引發(fā)呼吸暫停和低通氣。OSAHS在全世界范圍內(nèi)是一種高發(fā)病率疾病，在男性中發(fā)病率為34%，女性約為17%[1]。OSAHS患者在睡眠時(shí)可伴發(fā)巨大鼾聲、慢性間歇性缺氧、反復(fù)出現(xiàn)微覺(jué)醒、睡眠結(jié)構(gòu)紊亂等[2]。越來(lái)越多研究表明OSAHS引起的慢性間歇性缺氧能造成體內(nèi)交感神經(jīng)系統(tǒng)激活，氧化活性產(chǎn)物大量生成及慢性炎癥因子產(chǎn)生[3]，這些細(xì)胞因子和炎癥細(xì)胞的刺激導(dǎo)致體內(nèi)一系列炎癥反應(yīng)，如嗜中性粒細(xì)胞募集、組織破壞、新生血管形成等，對(duì)人體各靶器官造成損害。已有研究顯示如腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細(xì)胞介素(IL)-10等細(xì)胞因子在OSAHS患者中存在高表達(dá)[4]，經(jīng)過(guò)治療后，細(xì)胞因子引起的炎癥反應(yīng)減輕[5-7]。Th17細(xì)胞作為一種新型的T淋巴細(xì)胞，在機(jī)體的炎癥反應(yīng)、免疫應(yīng)答、自身免疫性疾病和腫瘤等的發(fā)生發(fā)展中具有重要意義，尤其在免疫應(yīng)答及呼吸系統(tǒng)慢性炎癥性疾病中起著重要的作用[8]，其核轉(zhuǎn)錄因子為RORγt，主要分泌IL-17、IL-6、IL-23等細(xì)胞因子。作為一種促進(jìn)炎癥及免疫調(diào)節(jié)的重要細(xì)胞，關(guān)于Th17在OSAHS中病理生理作用的研究尚少。本研究通過(guò)對(duì)不同嚴(yán)重程度OSAHS患者外周血中的Th17細(xì)胞及相關(guān)細(xì)胞因子進(jìn)行系統(tǒng)研究，探討Th17細(xì)胞及相關(guān)因子IL-17、IL-23、IL-6與OSAHS病情程度的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2018年1月至2018年12月在我科行多導(dǎo)睡眠監(jiān)測(cè)(polysommogram，PSG)的患者，排除過(guò)敏性鼻炎、哮喘、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎及其他免疫性疾病，近4周內(nèi)未服用抗組胺藥、糖皮質(zhì)激素等藥物。研究資料包括患者的性別、年齡及體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、最低血氧飽和度、睡眠呼吸暫停低通氣指數(shù)(apnea-hypopnea index，AHI)。本研究獲得武漢市第四醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑和儀器

RORγt抗體(eBioscience，美國(guó))，BCA試劑盒(Thermo Forma，美國(guó))，IL-17、IL-23、IL-6 ELISA試劑盒(武漢博士德)，酶標(biāo)儀(Bio-Rad，美國(guó))，美國(guó)邦德安佰S7000多道睡眠監(jiān)測(cè)系統(tǒng)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 AHI的測(cè)定 采用標(biāo)準(zhǔn)的PSG進(jìn)行檢測(cè)，并用睡眠軟件進(jìn)行睡眠分析。由專業(yè)技術(shù)人員依據(jù)美國(guó)睡眠醫(yī)學(xué)會(huì)(AASM)發(fā)布的“睡眠及相關(guān)事件判讀手冊(cè)”[9]對(duì)睡眠軟件分析后的結(jié)果進(jìn)行判讀，并計(jì)算出AHI，依據(jù)AHI值將患者分為對(duì)照組15例(AHI≤5次/h)、輕度組20例(5

1.3.2 標(biāo)本的收集與處理 采集研究對(duì)象清晨靜脈血6 mL，分2份，1份離心，取血清，用于酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)測(cè)定細(xì)胞因子，1份肝素抗凝，1 h內(nèi)用淋巴細(xì)胞分離液以Ficoll密度梯度法分離出外周血淋巴細(xì)胞，經(jīng)含1%小牛血清的PBS洗滌后，制備淋巴細(xì)胞懸液，用于免疫印跡檢測(cè)。

1.3.3 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA) 取患者血清，按照IL-17、IL-23、IL-6的ELISA檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)IL-17、IL-23、IL-6，通過(guò)A值計(jì)算相應(yīng)濃度。

1.3.4 免疫印跡法(Western blot)檢測(cè)核轉(zhuǎn)錄因子RORγt 吸出淋巴細(xì)胞懸液置于離心管中，PBS洗滌后加200 μL含蛋白酶抑制劑的裂解液，冰上充分裂解40 min后，4℃、12000 r /min離心20 min；吸取上清，用BCA法測(cè)蛋白濃度，并調(diào)整濃度一致。100℃水浴5 min使蛋白變性后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，洗滌3次后加入兔抗RORγt多克隆抗體(1∶2000)4℃孵育過(guò)夜，次日洗膜；加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔二抗(1∶5000)室溫孵育1 h，洗膜，ECL化學(xué)發(fā)光法成像，掃描儀采集圖像后用Image J圖像分析軟件對(duì)各圖像灰度值進(jìn)行半定量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 一般資料

3組患者平均年齡、性別、BMI均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，AHI及最低血氧飽和度比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，具體見(jiàn)表1。

表1 研究對(duì)象一般情況比較Table 1 Comparison of clinical characteristics of participants

2.2 各組血清IL-17、IL-23、IL-6濃度

通過(guò)ELISA檢測(cè)比較各組血清IL-17濃度，中重度組高于輕度組及對(duì)照組，各組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)；血清IL-23濃度，中重度組高于輕度組及對(duì)照組，各組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)；血清IL-6濃度，中重度組高于輕度組及對(duì)照組，各組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)，見(jiàn)表2。

表2 各組血清中細(xì)胞因子水平比較Table 2 Comparison of cytokines in serum in each

2.3 RORγt蛋白表達(dá)情況

免疫印跡法檢測(cè)顯示，中重度組患者外周血淋巴細(xì)胞中Th17細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子RORγt蛋白表達(dá)較輕度組及對(duì)照組高，三組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=169.86，P<0.01)，各組間比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)。見(jiàn)圖1。

與對(duì)照組比較，**P<0.01；與輕度組比較，△△P<0.01圖1 免疫印跡法檢測(cè)各組RORγt蛋白表達(dá)情況Fig.1 Detection of expression of RORγt protein in each group by Western blotting

2.4 AHI與血清Th17相關(guān)細(xì)胞因子及外周血淋巴細(xì)胞RORγt水平的相關(guān)性

通過(guò)相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)IL-17血清含量和AHI呈正相關(guān)(r=0.95，P<0.01)，IL-23含量和AHI呈正相關(guān)(r=0.87，P<0.01)，IL-6含量和AHI呈正相關(guān)(r=0.92，P<0.01)，RORγt蛋白表達(dá)量和AHI呈正相關(guān)(r=0.91，P<0.01)，見(jiàn)圖2。

A：IL-17血清含量和AHI呈正相關(guān)；B：IL-23含量和AHI呈正相關(guān)；C：IL-6含量和AHI呈正相關(guān)；D：RORγt蛋白表達(dá)量和AHI呈正相關(guān)圖2 IL-17、IL-6、IL-23、RORγt蛋白表達(dá)量和AHI的關(guān)系Fig.2 The correlation of IL-17，IL-6，IL-23，RORγt protein expression and AHI

3 討論

慢性間斷性缺氧是OSAHS的主要病理生理特點(diǎn)[10]，和缺血再灌注損傷有一定相似性[11]，由于長(zhǎng)期的間歇性缺氧，OSAHS患者的高碳酸血癥使中性粒細(xì)胞等炎性細(xì)胞應(yīng)激性增多，相關(guān)炎癥細(xì)胞因子濃度隨之增加[10]。RORγt是Th17細(xì)胞分化和分泌IL-17A的關(guān)鍵核轉(zhuǎn)錄因子，可誘導(dǎo)Th0細(xì)胞分化成熟為Th17細(xì)胞，而IL-17、IL-6、IL-23是Th17細(xì)胞分化的主要細(xì)胞因子。本研究發(fā)現(xiàn)中重度OSAHS患者外周血淋巴細(xì)胞RORγt蛋白表達(dá)較輕度組及對(duì)照組高，中重度組血清IL-17、IL-6、IL-23等細(xì)胞因子較輕度組及對(duì)照組高，提示OSAHS程度越重，即慢性間歇性缺氧程度越重，Th17細(xì)胞分化增加，其分泌的相關(guān)細(xì)胞因子增加。這可能和OSAHS患者夜間缺氧達(dá)到一定程度時(shí)，造成缺氧誘導(dǎo)因子1(HIF-1)表達(dá)增加有關(guān)。有研究顯示HIF-1能促使Th17分化增加[12]，也有研究認(rèn)為間歇性低氧能誘導(dǎo)NF-κB活化[13]，產(chǎn)生更多的促炎因子如IL-6等，并抑制CD4+淋巴細(xì)胞向Treg細(xì)胞分化，聯(lián)合TGF-β，通過(guò)Jak/STAT3信號(hào)誘導(dǎo)CD4+淋巴細(xì)胞細(xì)胞向Th17分化[14-15]。本研究顯示細(xì)胞因子IL-6在中重度組較輕度組及對(duì)照組高，這和相關(guān)研究一致[16]，有研究認(rèn)為缺氧引起的低氧血癥和高碳酸血癥能使交感神經(jīng)興奮，導(dǎo)致血中兒茶酚胺類物質(zhì)的濃度升高，又進(jìn)一步促進(jìn)IL-6分泌，導(dǎo)致OSAHS患者血清IL-6水平的上升，IL-6既能在OSAHS的炎癥中起著重要作用，也能促進(jìn)Th17細(xì)胞分化[17]。Th17細(xì)胞分泌的IL-23是促進(jìn)原始T細(xì)胞向Th17細(xì)胞分化的關(guān)鍵細(xì)胞因子[18]，已有報(bào)道IL-23在OSAHS中表達(dá)增加，但具體機(jī)制尚不清楚，可能和Th17細(xì)胞分化增加有關(guān)。

OSAHS診斷的金標(biāo)準(zhǔn)是PSG，AHI是評(píng)價(jià)其嚴(yán)重程度的指標(biāo)[19]，本研究顯示OSAHS患者外周血淋巴細(xì)胞RORγt蛋白含量、血清IL-17、IL-6、IL-23水平均和AHI呈正相關(guān)。國(guó)外也有研究顯示某些血清學(xué)指標(biāo)如CRP、IL-6和OSAHS嚴(yán)重程度呈相關(guān)性[20]，因此試圖將其作為評(píng)價(jià)OSAHS嚴(yán)重程度的一種補(bǔ)充檢測(cè)。有研究認(rèn)為在越嚴(yán)重的間歇性低氧環(huán)境中，研究對(duì)象的炎癥反應(yīng)更嚴(yán)重[14]，而Th17細(xì)胞作為重要的促炎細(xì)胞，其細(xì)胞數(shù)量及分泌的細(xì)胞因子因此增加，這些炎性因子水平顯著升高可能是誘發(fā)和加重OSAHS的重要調(diào)控機(jī)制之一。但由于本研究樣本量的限制，Th17細(xì)胞及其細(xì)胞因子水平能否作為評(píng)價(jià)OSAHS嚴(yán)重程度的指標(biāo)，還有待進(jìn)一步研究。同時(shí)尚需密切隨訪經(jīng)長(zhǎng)期持續(xù)正壓通氣治療后的OSAHS患者，以其體內(nèi)Th17細(xì)胞及相關(guān)炎癥因子的變化情況作橫斷面研究。

綜上所述，OSAHS是一種慢性炎癥性疾病，Th17細(xì)胞及其細(xì)胞因子介導(dǎo)的炎性反應(yīng)可能在OSAHS的病理生理過(guò)程中起著重要的作用，且與OSAHS的嚴(yán)重程度有關(guān)。阻斷這些細(xì)胞因子，可望成為減少OSAHS病理?yè)p傷的新途徑。