SOCS3在脂多糖誘導體外氧糖剝奪大腦皮層細胞藥理性預適應(yīng)中的作用*

潘琳娜， 樊 萍， 劉海云， 李建斌， 宋志堅， 馬煒林， 潘 旭， 呂 青

1江西省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院(江西中醫(yī)藥大學附屬中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院)神經(jīng)內(nèi)科，南昌 330003 2江西中醫(yī)藥大學生理學系，南昌 33000 3華中科技大學同濟醫(yī)學院基礎(chǔ)醫(yī)學院藥理學系，武漢 430030

腦缺血預適應(yīng)(ischemia preconditioning，IPC)現(xiàn)象是指腦組織經(jīng)短暫非致死性缺血缺氧刺激后，獲得的對隨后長時程致死性缺血缺氧的耐受力和保護作用[1]，但是因為缺血預處理是一種傷害性應(yīng)激過程，其在臨床應(yīng)用上受到了極大的限制。藥理性預適應(yīng)是在缺血預適應(yīng)的理論基礎(chǔ)上，通過藥物模擬缺血預適應(yīng)樣作用，對腦缺血損傷產(chǎn)生保護作用，具有很好臨床應(yīng)用價值。Toll樣受體(Toll like receptors，TLRs)是腦缺血再灌注損傷中最主要的炎癥應(yīng)答觸發(fā)器[2-3]。在腦缺血再灌注過程中，損傷組織及壞死細胞產(chǎn)生內(nèi)源性配體與膠質(zhì)細胞表面的TLR2和TLR4等TLRs結(jié)合，誘導下游炎性因子如TNF-α、IL-1、IL-6和IL-12和粘附分子CD86等大量產(chǎn)生，促進腦缺血損傷進一步加重[4]。而另據(jù)報道，小劑量TLR4配體脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)及其下游的炎性因子TNF-α和IL-6均能誘導腦缺血耐受，減少腦梗死體積[5]。綜上提示：LPS藥理預適應(yīng)過程中，適度激活TLR4，進而誘導產(chǎn)生適度的細胞因子，可能通過某種機制抑制隨后缺血再灌注腦組織的炎癥信號通路，抑制腦組織過度炎癥反應(yīng)，從而發(fā)揮保護作用，但具體機制目前還未見研究報道。

細胞因子信號抑制分子(suppressors of cytokine signaling，SOCS)是JAK-STAT信號通路的重要靶基因[6]，SOCS反饋抑制多種細胞因子的信號通路并抑制NF-κB活化從而調(diào)節(jié)機體對細胞因子的過度刺激[7]。SOCS家族中的SOCS1和SOCS3在中樞神經(jīng)系統(tǒng)分布廣泛[8]，SOCS3為JAK2激活STAT3后的靶蛋白，近年來在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的研究發(fā)現(xiàn)SOCS3可能參與了腦缺血耐受形成[9-11]。那么SOCS3是否也參與LPS誘導的藥理性預適應(yīng)，此過程中SOCS3激活是否依賴JAK2-STAT3途徑，SOCS3激活后是否可通過抑制炎性通路起保護作用，目前未見研究報道。為驗證以上假設(shè)，我們建立了大腦皮層混合培養(yǎng)神經(jīng)細胞氧糖剝奪(oxygen-glucose deprivation，OGD)損傷模型，觀察LPS藥理性預適應(yīng)對氧糖剝奪損傷大腦皮層細胞的保護作用，及其是否與JAK2-STAT3-SOCS3信號通路和炎性通路兩通路之間的相互調(diào)控有關(guān)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及材料

新生SD大鼠，雌雄不計，由華中科技大學同濟醫(yī)學院實驗動物中心提供。

LPS(Sigma公司)，DMEM/F12培養(yǎng)液、胎牛血清、Neurobasal培養(yǎng)液(Gibco公司)，3-(4，5)-2-噻唑-(2，5)-二苯基溴化四氮唑藍(MTT)(AMERESCO公司)，乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒(Roche公司)，IL-6、IL-1β、TNF-ɑ ELISA檢測試劑盒(ABclonal公司)，SOCS3、p-JAK2一抗(Abcam公司)，JAK2、STAT3、GAPDH、β-tublin一抗(Proteintech公司)，p-STAT3一抗(Cell Signaling Technology公司)，二抗均購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司。二氧化碳培養(yǎng)箱(SHELL/JB，美國)，超凈工作臺(蘇州凈化設(shè)備有限公司)，XDS-1B倒置顯微鏡(重慶光電儀器有限公司)，DYY-8C型電泳儀、小型水平搖床(北京六一儀器廠)，轉(zhuǎn)膜槽(JY-ZY2，北京君意東方電泳設(shè)備有限公司)，pH計[DELTA320，梅特勒(上海)有限公司]，90-2定時恒溫磁力攪拌器(上海滬西分析儀器廠)，精密電子天平(Sartorius公司，德國)，電動勻漿機(R104，IKA公司，德國)，臺式高速低溫離心機(Biofuge-24 RHeraeus公司，德國)，-80℃超低溫冰箱(Thermo公司，美國)，Elx800酶標儀(Bio Tek儀器公司，美國)，凝膠成像分析系統(tǒng)(Alpha公司，美國)。

1.2 實驗方法

1.2.1 大腦皮層細胞培養(yǎng) 取新生(1 d以內(nèi))的SD大鼠乳鼠，用75%乙醇消毒3次。在超凈臺中裝有冰冷D-Hank’s混合液的培養(yǎng)皿內(nèi)，將乳鼠斷頭后分離顱骨取出大腦，充分剝離腦膜。將皮質(zhì)組織轉(zhuǎn)移至盛有DMEM/F12的青霉素小瓶中，剪碎成1 mm3大小的組織碎塊，加入等體積的0.25%胰蛋白酶，吹打混勻，37℃消化5 min，加入含20%胎牛血清的完全培養(yǎng)液終止消化。用200目濾網(wǎng)過濾至離心管中，1000 r/min離心5 min，棄上清。在細胞沉淀中加入適量的Neurobasal培養(yǎng)液(含10%B27、100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素)重懸細胞，使用細胞計數(shù)板計數(shù)，調(diào)整細胞密度至1×106/mL，接種于預先用0.1%多聚賴氨酸包被過夜的培養(yǎng)皿或者培養(yǎng)板中。24 h后完全培養(yǎng)液全量換液，以后根據(jù)需要每2～3天換液1次，實驗于體外培養(yǎng)第8天進行[12]。

1.2.2 實驗分組和模型的建立 實驗分為空白對照組(Control組)，溶劑對照組(Sham組)、單純低劑量(0.02 μg/mL)LPS作用組(LLPS+Sham組)、單純高劑量(0.05 μg/mL)LPS作用組(HLPS+Sham組)、氧糖剝奪(OGD)損傷組(OGD組)、低劑量LPS預處理后進行OGD損傷組(LLPS+OGD組)、高劑量LPS預處理后進行OGD損傷組(HLPS+OGD組)。腦皮層細胞培養(yǎng)方式及氧糖剝奪模型建立方法：各LPS作用組預先48 h給予相應(yīng)劑量LPS，需進行OGD的組別取原代培養(yǎng)10 d的大腦皮層細胞，采用物理氧糖剝奪方法[13]進行OGD損傷造模，OGD損傷2 h后將培養(yǎng)液更換為正常培養(yǎng)液，放入正常CO2培養(yǎng)箱中，模擬再灌注過程，24 h后進行相應(yīng)實驗。

1.2.3 細胞活性及損傷的檢測 MTT法檢測細胞活性：大腦皮層細胞OGD 2 h再灌注24 h后用D-Hank’s液洗3遍，每孔給予0.5 g/L MTT 200 μL，培養(yǎng)箱(37℃，95% O2，5%CO2)內(nèi)孵育4 h，結(jié)束后吸棄上清液，每孔加入150 μL DMSO，在恒溫振蕩器振蕩10 min，充分溶解甲臜，在全自動酶標儀上562 nm處測定其吸光度(A562 nm)值。LDH釋放實驗檢測細胞損傷：OGD 2 h再灌注24 h后，收集細胞培養(yǎng)上清液，另設(shè)一陽性對照，該組細胞經(jīng)過2% Triton-100充分破膜，作為細胞LDH最大釋放量。收集細胞上清液，按照LDH檢測試劑盒說明書檢測492 nm處吸光度值(A492nm)。細胞損傷程度以LDH百分釋放量表示，LDH百分釋放量=(測定組A492nm值-空白對照A492nm值)/(陽性對照A492nm值-空白對照A492nm值)×100%。

1.2.4 ELISA法測定細胞培養(yǎng)上清IL-6、IL-1β、TNF-ɑ含量 細胞OGD 2 h再灌注24 h后，收集培養(yǎng)上清，參照試劑盒說明及參考文獻[14]進行ELISA檢測。

1.2.5 Western blot檢測大腦皮層細胞JAK2-STAT3-SOCS3信號通路相關(guān)蛋白表達 在培養(yǎng)有細胞的35 mm培養(yǎng)皿中加入80 μL含蛋白酶抑制劑及磷酸化蛋白酶抑制劑的冰冷蛋白裂解液提取蛋白，參照文獻[14]方法進行Western blot。各一抗稀釋比例分別為：抗SOCS3(1∶1000)，抗p-JAK2(1∶1000)，抗JAK2(1∶1000)，抗p-STAT3(1∶1000)，抗STAT3(1∶1000)，抗β-tublin(1∶5000)，抗β-actin(1∶3000)，抗GAPDH(1∶3000)。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 LPS預適應(yīng)對OGD大腦皮層細胞活性及損傷的影響

2.1.1 MTT檢測細胞活力 以Control組大腦皮層細胞活力為100%，與Control組比較，Sham組、LLPS+Sham組、HLPS+Sham組細胞活力無明顯差異；OGD組與Sham組比較，差異有統(tǒng)計學意義；LLPS+OGD組、HLPS+OGD組細胞活力與OGD組比較有明顯提高，差異有統(tǒng)計學意義。結(jié)果見圖1。

1：Control；2：Sham；3：LLPS+Sham；4：HLPS+Sham；5：OGD；6：LLPS+OGD；7：HLPS+OGD；與Sham組比較，##P<0.01；與OGD組比較，**P<0.01；n=6圖1 MTT檢測LPS藥理性預適應(yīng)對OGD 2 h復氧24 h后大腦皮層細胞活力的影響Fig.1 Effect of LPS preconditioning by prior sublethal OGD on cell viability after lethal OGD detected by MTT assay

2.1.2 LDH釋放量的檢測 Control組細胞LDH釋放量為(18.77±2.93)%；與Control組比較，Sham組、LLPS+Sham組、HLPS+Sham組細胞損傷程度的差異無統(tǒng)計學意義；OGD組與Sham組比較，差異有統(tǒng)計學意義。LLPS+OGD組、HLPS+OGD組與OGD組比較，LDH釋放量明顯減少，差異統(tǒng)計學有意義。結(jié)果見圖2。

2.2 LPS預適應(yīng)對大腦皮層細胞OGD損傷后炎性因子表達的影響

如圖3所示，與Control組比較，Sham組培養(yǎng)上清中炎性因子IL-6、IL-1β和TNF-α的表達無明顯差異。與Sham組比較，LLPS+Sham和HLPS+Sham組炎性因子IL-6、IL-1β和TNF-α的表達有升高趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義，而OGD組IL-6、IL-1β和TNF-α的表達明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義；與OGD組比較，LLPS+OGD組和HLPS+OGD組炎性因子IL-6、IL-1β、TNF-α的表達明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義。

2.3 Western blot檢測JAK2-STAT3-SOCS3信號通路相關(guān)蛋白表達

如圖4所示，與Sham組比較，LLPS+Sham、HLPS+Sham組p-JAK2/JAK2比值、p-STAT3/STAT3比值、SOCS3表達有升高趨勢，OGD組p-JAK2/JAK2比值、p-STAT3/STAT3比值、SOCS3表達明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義；與OGD組比較，LLPS+OGD、HLPS+OGD組SOCS3表達明顯升高，p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3明顯下降。

1：Control；2：Sham；3：LLPS+Sham；4：HLPS+Sham；5：OGD；6：LLPS+OGD；7：HLPS+OGD；與Sham組比較，##P<0.01；與OGD組比較，**P<0.01；n=6圖2 LPS藥理性預適應(yīng)對OGD 2 h復氧24 h后大腦皮層細胞損傷的影響Fig.2 Effects of LPS preconditioning by prior sublethal OGD on the leakage of LDH

1：Control；2：Sham；3：LLPS+Sham；4：HLPS+Sham；5：OGD；6：LLPS+OGD；7：HLPS+OGD；A：ELISA檢測大腦皮層細胞培養(yǎng)上清IL-6水平；B：ELISA檢測大腦皮層細胞培養(yǎng)上清IL-1β水平；C：ELISA檢測大腦皮層細胞培養(yǎng)上清TNF-ɑ水平；與Sham組比較，##P<0.01；與OGD組比較，*P<0.05 **P<0.01；n=6圖3 ELISA檢測LPS藥理性預適應(yīng)對大腦皮層細胞OGD損傷后炎性因子分泌量的影響Fig.3 Effect of LPS preconditioning by prior sublethal OGD on the release of cytokines from cells subjected to OGD detected by ELISA

1：Sham；2：LLPS+Sham；3：HLPS+Sham；4：OGD；5：LLPS+OGD；6：HLPS+OGD；A：大腦皮層細胞SOCS3總蛋白表達的變化；B：大腦皮層細胞p-JAK2/JAK2蛋白比值的表達變化；C：大腦皮層細胞p-STAT3/STAT3蛋白比值的變化；與Sham組比較，##P<0.01；與OGD組比較，*P<0.05 **P<0.01；n=3圖4 LPS藥理性預適應(yīng)對OGD損傷后大腦皮層細胞SOCS3-JAK2-STAT3信號通路各節(jié)點蛋白表達的影響Fig.4 Effect of LPS preconditioning by prior sublethal OGD on the expression of SOCS3-JAK2-STAT3 signaling pathway proteins from cells after OGD in vitro detected by Western blotting

3 討論

在腦缺血及復灌過程中，損傷組織及壞死細胞釋放出內(nèi)源性配體與膠質(zhì)細胞表面的TLRs結(jié)合，其中TLR4分布最為廣泛，通過激活下游MyD88炎性信號通路，最終導致轉(zhuǎn)錄因子NF-κB和AP-1活化，誘導IL-1β、IL-6、TNF-ɑ、IL-8和IL-12等炎性因子產(chǎn)生，加重腦缺血損傷[7]。在本研究中，大腦皮層細胞OGD 2 h復氧糖后細胞IL-6、IL-1β、TNF-α表達升高，與之相符合。如前所述，由TLR4介導的MyD88信號通路觸發(fā)免疫炎癥反應(yīng)是促進腦缺血及再灌注后損傷加重的關(guān)鍵因素。

LPS又稱內(nèi)毒素、脂多糖，為革蘭陰性菌細胞壁的主要成分，能刺激機體產(chǎn)生炎癥反應(yīng)。研究表明，LPS可與腦內(nèi)膠質(zhì)細胞膜上的CD14結(jié)合，激活Toll樣受體，以及髓樣分化因子88(MyD88)依賴性信號通路，最終激活核因子pNF-κB通路和絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)，介導促炎性細胞因子如TNF-α、IL-1和IL-6等的釋放和免疫系統(tǒng)的活化，導致神經(jīng)元損傷[15-16]。

LPS為TLR4的特異性配體，有研究證明小劑量LPS能減少腦梗死體積[5]。在敲除TLR4基因的小鼠，腦缺血預適應(yīng)保護作用消失[11]。依上述結(jié)果推測，在小劑量LPS預處理過程中TLR4被激活，誘發(fā)輕微炎癥反應(yīng)，釋放炎癥因子作為內(nèi)源性配體，并通過內(nèi)在信號通路抑制缺血后炎癥反應(yīng)，發(fā)揮神經(jīng)細胞保護作用。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)，小劑量的LPS可引起大腦皮層細胞TLR4-MyD88-炎性因子信號通路蛋白輕微上調(diào)，而預先給予小劑量LPS對缺血再灌注損傷的乳鼠大腦皮層細胞有保護作用。

SOCS家族是一組蛋白質(zhì)家族，目前已發(fā)現(xiàn)SOCS家族有8個成員，結(jié)構(gòu)相似，均包括了N區(qū)、中央?yún)^(qū)的SH2結(jié)構(gòu)域和C端保守序列SOCS盒[17]。其中，SOCS3可被JAK2/STAT3激活，同時SOCS3可通過負性調(diào)節(jié)JAK2/STAT3細胞因子信號轉(zhuǎn)導途徑發(fā)揮一定作用[18-19]。有研究報道，外周細胞因子TNF-α、IL-6和IL-1與其受體結(jié)合后，能激活JAK-STAT途徑，STATs在細胞凋亡過程中也起著重要作用[20]，外周組織IL-6、IL-1、TNF-α等細胞因子與SOCS家族受體結(jié)合后，激活JAK-STAT途徑，導致STAT磷酸化，然后二聚體化，轉(zhuǎn)入細胞核內(nèi)與DNA上的特定調(diào)節(jié)序列結(jié)合誘導各種細胞因子調(diào)節(jié)基因(包括SOCS)的表達。同時，SOCS在細胞因子信號通路中起負反饋調(diào)節(jié)作用，廣泛參與了細胞因子信號的調(diào)節(jié)。

本實驗中，我們發(fā)現(xiàn)在腦缺血再灌注的小鼠缺血腦組織中，SOCS3、p-JAK2、p-STAT3表達升高，小劑量的LPS預處理可以促進SOCS3產(chǎn)生，與之前的研究結(jié)果相符，同時TLR4下游信號通路蛋白被抑制。因此我們認為，在LPS誘導的藥理性預適應(yīng)過程中，適度激活TLR4信號通路，以及適度激活MyD88、NF-κB和MAPK，誘導細胞因子如TNF-α、IL-1β和IL-6等生成增多，這些細胞因子作用于相應(yīng)受體后激活JAK2-STAT3信號通路誘導生成SOCS3；當機體再次遭遇致死性腦缺血時，已經(jīng)提前激活的SOCS3可能通過快速抑制缺血期TLR4-MyD88致炎信號通路激活而抑制炎癥反應(yīng)進而發(fā)揮腦缺血保護作用。