結(jié)直腸癌中miR-330-3p-RUVBL1信號(hào)軸腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡的影響*

黃開禹， 穆 磊， 王向陽， 王 輝△

1華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬武漢市中心醫(yī)院胃腸外科，武漢 430014 2華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院胃腸外科，武漢 430030

結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)也稱為結(jié)腸癌或腸癌，是一種由直腸或結(jié)腸發(fā)展而來的惡性腫瘤，是最常見的消化道惡性腫瘤之一，是世界上第3高發(fā)惡性腫瘤[1]。據(jù)GLOBOCAN估計(jì)，2020年結(jié)直腸癌新發(fā)病例將超過180萬，死亡人數(shù)將超過1000萬[2]。近10年來，隨著科學(xué)技術(shù)和醫(yī)療水平的不斷進(jìn)步，全球范圍內(nèi)結(jié)直腸癌的發(fā)病率和死亡率基本穩(wěn)定，但是在全球惡性腫瘤發(fā)病及死亡人數(shù)中所占的比例卻有所增加。結(jié)直腸癌發(fā)病的地域分布差異較大，其中發(fā)達(dá)地區(qū)結(jié)直腸癌發(fā)病率與死亡率均較高，我國是結(jié)直腸癌的低發(fā)區(qū)，但其發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升的趨勢[3]，結(jié)直腸癌已然成為我國重要的公共衛(wèi)生問題之一。在過去的10年中，由于新的化療藥物和靶向治療的發(fā)展，轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者的臨床結(jié)果有所改善，患者的中位總生存期約為30個(gè)月[4]。但是化療依然存在較明顯的不良反應(yīng)，且仍有大量患者出現(xiàn)治療失敗、復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移等情況[5]，因此，有必要尋找更好的生物學(xué)標(biāo)志物以利于結(jié)直腸癌的早期診斷和預(yù)測患者的預(yù)后。RUVBL1蛋白是一種AAA+ATP酶，研究表明，該蛋白參與DNA修復(fù)、基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控等過程，與腫瘤的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[6-8]。但RUVBL1在結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展中起何種作用，尚未完全闡明。Oncomine數(shù)據(jù)庫是當(dāng)前世界上最大的腫瘤基因芯片數(shù)據(jù)庫和整合數(shù)據(jù)提取平臺(tái)，本研究利用Oncomine數(shù)據(jù)庫分析CRC中RUVBL1的表達(dá)情況，利用在線Starbase數(shù)據(jù)庫預(yù)測出miR-330-3p與下游RUVBL1 mRNA存在明顯偶聯(lián)結(jié)合，采用雙熒光素酶基因法驗(yàn)證RUVBL1與miR-330-3p的靶向關(guān)系，進(jìn)而研究miR-330-3p-RUVBL1信號(hào)軸對CRC細(xì)胞增殖、凋亡的影響，以期在CRC的綜合治療方面提供一些思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)試劑 人結(jié)直腸癌HT-29細(xì)胞購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫。胎牛血清購自北京百奧萊博科技有限公司；RPMI-1640培養(yǎng)液及青霉素-鏈霉素雙抗試劑購自杭州吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司；小鼠單克隆抗體Bcl-2、Bax、cleaved-Caspase-3、β-actin、GAPDH均購自美國Cell Signaling Technology公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自TransGen公司；RT-PCR試劑盒、Western blot試劑盒以及LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑均購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司；其他試劑均為化學(xué)分析純。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 細(xì)胞計(jì)數(shù)器(美國Nexcelom Bioscience LLC公司)；紫外分光光度計(jì)(美國NanoDrop公司)；倒置顯微鏡(日本OLYMPUS公司，型號(hào)IX81)；流式細(xì)胞儀(美國Beckman Coulter公司)；往復(fù)式水浴搖床(上海智誠分析儀器制造公司，型號(hào)ZHEY-110X30)；圖像分析儀(以色列Dinco公司)；化學(xué)發(fā)光儀(上海天能科技有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 Oncomine數(shù)據(jù)庫提取數(shù)據(jù) Oncomine是一個(gè)癌癥微陣列數(shù)據(jù)庫和基于網(wǎng)絡(luò)的數(shù)據(jù)挖掘平臺(tái)，旨在激發(fā)全基因組表達(dá)分析的新發(fā)現(xiàn)，并將大多數(shù)癌癥類型的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)與各自的正常組織進(jìn)行比較。Oncomine數(shù)據(jù)庫(http：//www.oncomine.org)包含35種癌癥類型的264個(gè)獨(dú)立數(shù)據(jù)集，并支持各種分析方法，包括分子概念分析、相互作用組分析和薈萃分析[6]。我們采用Oncomine數(shù)據(jù)庫分析RUVBL1 mRNA在CRC患者中的表達(dá)，設(shè)定的篩選條件為，Gene：RUVBL1；Analysis Type：Differential Analysis，Cancervs.Cancer Analysis，Cancervs.Normal Analysis；Cancer Type：Colorectal Adenocarcinoma；Sample Type：Clinical Specimen；Data Type：mRNA。在候選結(jié)果中根據(jù)需要選擇呈現(xiàn)形式，顯示RUVBL1 mRNA在CRC組織和正常組織之間表達(dá)的倍數(shù)關(guān)系、P值等。根據(jù)納入樣本RUVBL1的表達(dá)水平的(中位數(shù))進(jìn)行分組，高于該中位數(shù)的為高表達(dá)，低于該數(shù)值的為低表達(dá)。

1.2.2 Starbase數(shù)據(jù)庫提取數(shù)據(jù) 從Starbase數(shù)據(jù)庫(http：//starbase.sysu.edu.cn)中的Pan-Cancer模塊分析中選擇“Gene Differential Expression”，以“RUVBL1”為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，得到RUVBL1在結(jié)直腸癌中的表達(dá)數(shù)據(jù)。

1.2.3 臨床標(biāo)本收集 收集武漢市中心醫(yī)院從2018年1月至2019年1月的CRC患者資料，納入56名沒有其他影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果疾病的CRC患者。在手術(shù)過程中收集腫瘤標(biāo)本和鄰近正常組織。組織樣本由經(jīng)驗(yàn)豐富的病理醫(yī)生根據(jù)世界衛(wèi)生組織制定的分類指南進(jìn)行定義。所有參與者均簽署知情同意書，本研究得到武漢市中心醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。收集的臨床標(biāo)本一部分制備冰凍切片行免疫組化檢查；余下標(biāo)本液氮凍存后，留作熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)用。

1.2.4 HT-29細(xì)胞培養(yǎng) 采用RPMI-1640培養(yǎng)液(含10%滅活的新生牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素)在37℃、5% CO2、飽和濕度的條件下培養(yǎng)HT-29細(xì)胞，每隔2天換培養(yǎng)液，再用含EDTA的0.25%胰蛋白酶溶液進(jìn)行常規(guī)消化和傳代，選取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.5 miR-330-3p過表達(dá)或沉默 根據(jù)說明書構(gòu)建miR-330-3p過表達(dá)載體(miR-330-3p mimic)。選取對數(shù)生長期的人結(jié)直腸癌HT-29細(xì)胞，采用胰酶消化后，將2 mL細(xì)胞懸液接種到6孔板(細(xì)胞密度為1×105個(gè)/mL)，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，將細(xì)胞分為3組：Control組(轉(zhuǎn)染空載體)、miR-330-3p mimic組(轉(zhuǎn)染miR-330-3p過表達(dá)載體)、miR-330-3p inhibitor組(轉(zhuǎn)染miR-330-3p沉默載體)。相關(guān)序列，miR-330-3p inhibitor sence：5′-UCUCUGCAGGCCGUGUGCUUUGC-3′；miR-330-3p mimic sence：5′-GCAAAGCACACGGCCUGCA-GAGA-3′；control sence：5′-GAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3′。按照LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑說明書方法進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染48 h后置于熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效果。

1.2.6 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測驗(yàn)證RUVBL1與miR-330-3p間的關(guān)聯(lián) 以U6作為內(nèi)參，根據(jù)說明書構(gòu)建含有人野生型RUVBL1 mRNA 3′非編碼區(qū)(3′UTR)序列和突變型RUVBL1 mRNA 3′UTR序列的雙熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒：RUVBL1 mRNA 3′UTR wild和RUVBL1 mRNA 3′UTR mut。利用LipofectamineTM2000將miR-330-3p inhibitor及miR-330-3p mimic和2種質(zhì)粒分別共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后48 h采用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒檢測螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶活性。結(jié)果用螢火蟲熒光素酶活性/海腎熒光素酶活性比值表示，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.7 CCK-8試劑盒檢測細(xì)胞增殖 將各組HT-29細(xì)胞調(diào)整為1×106個(gè)/mL，于96孔板中每孔添加100 μL細(xì)胞懸液，同一標(biāo)本做3個(gè)重復(fù)，37℃培養(yǎng)箱中靜置4 h，每孔加入10 μL CCK8后混勻，培養(yǎng)4 h，用酶標(biāo)儀測定450 nm處吸光度值(A450 nm)，按照公式細(xì)胞活力(%)=(實(shí)驗(yàn)孔A450 nm-空白孔A450 nm)/(對照孔A450 nm-空白孔A450 nm)100%計(jì)算細(xì)胞活力。

1.2.8 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 取對數(shù)期生長的HT-29細(xì)胞，用胰蛋白酶消化細(xì)胞，500×g離心5 min，棄去上清液，收集細(xì)胞沉淀。細(xì)胞沉淀用冰冷的PBS洗滌3次。離心棄去上清，細(xì)胞沉淀用75%乙醇4℃固定4 h，棄去固定液，用Annexin緩沖液重懸細(xì)胞。用400目的篩網(wǎng)過濾1次，500×g離心5 min，棄去上清，細(xì)胞沉淀加入5 μL稀釋的AnnexinⅤ-APC工作液在冰上孵育15～18 min，再加入5 μL稀釋的7AAD工作液對細(xì)胞進(jìn)行復(fù)染，上流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡。

1.2.9 免疫組化法檢測RUVBL1蛋白表達(dá) 將手術(shù)采集的CRC患者組織標(biāo)本以10%中性甲醛溶液固定，石蠟包埋，4 μm連續(xù)切片。將組織切片放置在顯微鏡載玻片上，在二甲苯中脫脂并在梯度乙醇和蒸餾水中再水合，用100 μg/mL蛋白酶K在0.6 mol/L Tris(pH 7.5)/0.1% CaCl2中處理切片15 min，用3%的過氧化氫酶在甲醇和PowerBlock溶液分別封閉內(nèi)源性過氧化物酶活性和非特異性抗原10 min。以兔抗人RUVBL1單克隆抗體為一抗，采用Envision法進(jìn)行免疫組化檢測，嚴(yán)格按照試劑盒步驟進(jìn)行檢測，經(jīng)高壓鍋高溫修復(fù)抗原，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，隨后進(jìn)行中性樹膠封片處理。

1.2.10 熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRT-PCR)檢測miR-330-3p 將對數(shù)生長期的HT-29細(xì)胞接種于孔板中，細(xì)胞密度為2.5×104/mL，500×g離心5 min收集細(xì)胞沉淀，用Trizol試劑盒提取細(xì)胞總RNA，采用紫外分光光度計(jì)在260 nm處檢測RNA的純度。按照逆轉(zhuǎn)錄以及PCR試劑盒的操作步驟進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄及實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5 min，40次擴(kuò)增(96℃變性30 s，60℃退火40 s，72℃延伸1 min)，72℃延伸10 min。以β-actin為內(nèi)部參照，用Opticon Monitor 3軟件對PCR結(jié)果進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次后計(jì)算平均值。

1.2.11 Western blot檢測 收集對數(shù)生長期的HT-29細(xì)胞于EP管中，500×g離心5 min收集細(xì)胞沉淀，然后用RIPA裂解緩沖液裂解，用BCA蛋白檢測試劑盒測定裂解物中的蛋白質(zhì)濃度，采用10% SDS-PAGE電泳分離100 μg總蛋白，并將其轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。在室溫下將膜在5%的牛奶中封閉1 h，加入下列抗體在4℃的TBST中孵育過夜：抗Bcl-2(1∶1000)，抗Bax(1∶1000)，抗cleaved-Caspase-3(1∶500)，抗β-actin(1∶500)和抗GAPDH(1∶500)。用PBST洗滌3次后，用熒光標(biāo)記的二級抗體(1∶200)孵育膜，化學(xué)發(fā)光法檢測，并用Quantity one軟件進(jìn)行圖像分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 Oncomine數(shù)據(jù)庫顯示RUVBL1在腫瘤中的表達(dá)情況

從Oncomine數(shù)據(jù)庫中共收集到397項(xiàng)關(guān)于RUVBL1在不同類型腫瘤中表達(dá)情況的研究結(jié)果(圖1)，其中結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的研究有32項(xiàng)，RUVBL1表達(dá)增高的研究有24項(xiàng)，表達(dá)降低的研究有8項(xiàng)。

圖1 RUVBL1在所有腫瘤中的表達(dá)Fig.1 Expression of RUVBL1 in all tumors

2.2 RUVBL1在結(jié)直腸癌中高表達(dá)

在Oncomine數(shù)據(jù)庫中，自2004年起共有16項(xiàng)含458例結(jié)直腸腺癌(colorectal adenocarcinoma，COAD)患者的研究涉及RUVBL1在結(jié)直腸癌組織和正常組織中的表達(dá)，其中有mRNA測量數(shù)據(jù)的450例為癌組織，8例為正常結(jié)腸組織。薈萃16項(xiàng)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常組織相比，RUVBL1在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)明顯升高(圖2)。

對收集的人CRC臨床標(biāo)本進(jìn)行Western blot檢測，結(jié)果顯示，相對正常結(jié)直腸組織，RUVBL1在CRC中呈明顯的高表達(dá)(P<0.01，圖3A，3B)。免疫組化染色發(fā)現(xiàn)，CRC組織呈明顯RUVBL1強(qiáng)陽性染色，而且在結(jié)腸低級別上皮內(nèi)瘤變、高級別上皮內(nèi)瘤變組織中也呈RUVBL1陽性染色，表達(dá)強(qiáng)度低于CRC組，說明RUVBL1在結(jié)直腸癌前病變中即出現(xiàn)表達(dá)升高的趨勢，與腫瘤的進(jìn)展存在明顯的相關(guān)性(P<0.05，圖3C、3D)。

圖2 Oncomine數(shù)據(jù)庫中RUVBL1在結(jié)直腸腺癌中的表達(dá)Fig.2 Expression of RUVBL1 in colorectal adenocarcinoma in Oncomine database

A、B：Western blot分析RUVBL1在CRC患者癌組織和正常組織中的表達(dá)，N：正常組織，T：CRC患者癌組織，1～4為患者編號(hào)；C：免疫組化分析RUVBL1在結(jié)腸癌前病變、癌組織中的差異表達(dá)(×400)，LGIN：低級別上皮內(nèi)瘤變(low grade intraepithelial neoplasia)，HGIN：高級別上皮內(nèi)瘤變(high grade intraepithelial neoplasia)；D：免疫組化結(jié)果統(tǒng)計(jì)，*P<0.05 **P<0.01圖3 RUVBL1在結(jié)腸癌中表達(dá)分析Fig.3 Expression analysis of RUVBL1 in colorectal cancer

2.3 RUVBL1基因的表達(dá)水平與結(jié)直腸癌患者生存預(yù)后的關(guān)系

通過Oncomine數(shù)據(jù)庫挖掘的信息，我們發(fā)現(xiàn)RUVBL1在CRC中表達(dá)升高，為了進(jìn)一步明確RUVBL1表達(dá)與結(jié)直腸癌預(yù)后之間的關(guān)系，在458例COAD患者臨床資料中，剔除手術(shù)后生存時(shí)間未知的6例、術(shù)后0生存時(shí)間的2例以及只有mRNA測序而臨床資料不全的3例，最終納入447例COAD患者，利用Kaplan-Meier分析進(jìn)行生存分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)RUVBL1基因的表達(dá)水平與結(jié)直腸癌患者生存預(yù)后之間存在相關(guān)性，低表達(dá)RUVBL1的患者預(yù)后較好(P=0.0077，圖4)。

2.4 RUVBL1與miR-330-3p的靶向關(guān)系

通過在線Starbase數(shù)據(jù)庫分析TCGA來源的結(jié)直腸癌中miR-330-3p的表達(dá)，預(yù)測出miR-330-3p與下游RUVBL1 mRNA存在明顯偶聯(lián)結(jié)合位點(diǎn)。我們通過Oncomine數(shù)據(jù)庫挖掘的CRC患者數(shù)據(jù)，對其癌組織和正常組織進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-330-3p在CRC組織中的表達(dá)水平明顯低于正常結(jié)直腸組織(圖5A)。在我們收集的臨床標(biāo)本中，miR-330-3p在癌組織中也呈現(xiàn)低表達(dá)(P<0.01，圖5B)。利用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)了miR-330-3p與RUVBL1的靶向調(diào)控關(guān)系(圖5C、5D)。在結(jié)直腸癌細(xì)胞HT-29中轉(zhuǎn)染miR-330-3p mimics能夠明顯抑制細(xì)胞RUVBL1蛋白的表達(dá)，而miR-330-3p inhibitor能夠促進(jìn)RUVBL1表達(dá)(圖5E)。

圖4 不同RUVBL1表達(dá)水平COAD患者的生存分析Fig.4 Survival analysis of COAD patients with different RUVBL1 expression levels

A：Starbase數(shù)據(jù)庫在線分析COAD與正常結(jié)直腸組織中miR-33-3p表達(dá)差異(n=458)；B：qRT-PCR分析臨床CRC與正常結(jié)直腸組織標(biāo)本中miR-330-3p的表達(dá)差異(n=56)；C：Starbase在線預(yù)測miR-330-3p與RUVBL1偶聯(lián)位點(diǎn)；D：熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果；E：HT-29細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-330-3p mimics、miR-330-3p inhibitor，Western blot分析RUVBL1蛋白表達(dá)；**P<0.01圖5 RUVBL1與miR-330-3p的靶向關(guān)系Fig.5 Targeting relationship between RUVBL1 and miR-330-3p

2.5 miR-330-3p促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞HT-29的凋亡，增加其對順鉑的化療敏感性

我們進(jìn)一步觀察miR-330-3p是否能夠影響HT-29細(xì)胞對順鉑的化療敏感性。在HT-29細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-330-3p mimics，對照組為對照載體轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染24 h后給予細(xì)胞不同濃度的順鉑處理，繼續(xù)培養(yǎng)72 h后通過CCK-8測定細(xì)胞活力。我們發(fā)現(xiàn)miR-330-3p mimics轉(zhuǎn)染能夠顯著上調(diào)HT-29細(xì)胞對順鉑的化療敏感性(P<0.01，圖6A)。

進(jìn)一步觀察miR-330-3p是否參與結(jié)腸癌細(xì)胞的凋亡調(diào)控，圖6B流式凋亡分析證實(shí)miR-330-3p mimics轉(zhuǎn)染能夠促進(jìn)HT-29細(xì)胞凋亡，在轉(zhuǎn)染24 h后即出現(xiàn)明顯的細(xì)胞凋亡。而Western blot分析凋亡相關(guān)蛋白發(fā)現(xiàn)，miR-330-3p mimics轉(zhuǎn)染后HT-29細(xì)胞內(nèi)Bax、cleaved-Caspase-3的蛋白表達(dá)水平均上調(diào)，而Bcl-2表達(dá)水平下降(圖6C)。

A：CCK-8測定HT-29細(xì)胞活力；B：流式細(xì)胞術(shù)測定HT-29細(xì)胞凋亡結(jié)果統(tǒng)計(jì)；C.Western blot分析細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)；*P<0.05，**P<0.01圖6 miR-330-3p促進(jìn)HT-29細(xì)胞的凋亡及對順鉑的敏感性Fig.6 miR-330-3p promotes apoptosis of colorectal HT-29 cells and sensitivity to cisplatinum

3 討論

RUVBL1是一種高度保守的AAA+ATPase，主要負(fù)責(zé)ATP結(jié)合和水解[9]，在細(xì)胞的代謝、組蛋白乙酰化以及DNA損傷修復(fù)等方面起重要作用。研究顯示，RUVBL1是Tcf/Lef的協(xié)同激活因子，多數(shù)與RUVBL2組成復(fù)合物拮抗β-catenin的信號(hào)傳導(dǎo)。此外，RUVBL1還是多種基因轉(zhuǎn)錄的協(xié)同激活因子，包括抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的腫瘤抑制基因KAI1[10]。它在促進(jìn)腫瘤抑制基因轉(zhuǎn)錄的同時(shí)，促進(jìn)β-catenin介導(dǎo)的腫瘤轉(zhuǎn)化，從而促進(jìn)ITF2基因啟動(dòng)子區(qū)域的組蛋白H4乙酰化，并增強(qiáng)TCF4的轉(zhuǎn)錄活性[11]。Haurie等[12]研究發(fā)現(xiàn)ShRUVBL1可減弱骨肉瘤細(xì)胞系中MYO10誘導(dǎo)的表型，而RUVBL1作為廣泛報(bào)道的癌基因，被發(fā)現(xiàn)能在骨肉瘤細(xì)胞系SAOS-2中促進(jìn)突變型p53的功能獲得。綜上表明RUVBL1在腫瘤的進(jìn)展中起著重要作用，與癌癥患者的預(yù)后密切相關(guān)[12-13]。盡管RUVBL1在CRC中的研究較少，但根據(jù)其在骨肉瘤細(xì)胞系SAOS-2中能促進(jìn)突變型p53功能的作用，推測其在CRC發(fā)生中也可能起到類似作用[14]，RUVBL1能否成為結(jié)直腸癌的診斷標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)值得進(jìn)一步研究。

microRNAs(miRNAs)是一類內(nèi)源性的、短鏈(19～22個(gè)核苷酸)、非編碼的單鏈RNA，是基因表達(dá)的負(fù)性調(diào)節(jié)因子，已有的研究顯示，其調(diào)控關(guān)鍵的生物過程，如細(xì)胞增殖、凋亡、分化以及血管生成，還通過作為癌基因或腫瘤抑制基因而參與各種癌癥的發(fā)病過程[15]。越來越多的研究表明miRNAs與各種形式的腫瘤發(fā)生有關(guān)[16]。miR-330-3p是miR-330的主要亞型之一，有研究表明miR-330-3p在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，如Arora等[17]發(fā)現(xiàn)在非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)患者中miR-330-3p的表達(dá)在腦轉(zhuǎn)移患者明顯高于無腦轉(zhuǎn)移的患者；Liu等[18]證實(shí)miR-330-3p在NSCLC組織和腦轉(zhuǎn)移組織中表達(dá)上調(diào)，miR-330-3p過表達(dá)可通過靶向EGR2促進(jìn)NSCLC細(xì)胞周期分布和增殖；Meng等[19]發(fā)現(xiàn)miR-330-3p在食管鱗狀細(xì)胞癌(ESCC)腫瘤組織和ESCC細(xì)胞系中高表達(dá)，過度表達(dá)miR-330-3p在體外可顯著增強(qiáng)ESCC細(xì)胞的增殖、存活、遷移和侵襲。然而，miR-330-3p在CRC中的作用仍然未知。

本研究中，我們利用Oncomine在線數(shù)據(jù)庫的mRNA表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行在線分析，以P<0.0001，表達(dá)異常的倍數(shù)大2倍的限定條件，選擇正常組織與結(jié)直腸癌組織的對比數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)與正常組織相比，RUVBL1在CRC呈現(xiàn)高表達(dá)，臨床CRC標(biāo)本免疫組化結(jié)果亦證實(shí)該結(jié)論，而高表達(dá)RUVBL1的患者術(shù)后總體生存率低于低表達(dá)RUVBL1的患者，這些均提示RUVBL1在CRC的發(fā)展中起重要作用?？紤]到miR-330-3p在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，那么RUVBL1與miR-330-3p之間有無上下游靶向關(guān)系？隨后我們利用Starbase數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)RUVBL1是miR-330-3p的潛在靶點(diǎn)，雙熒光素酶報(bào)告基因檢測驗(yàn)證了RUVBL1與miR-330-3p的靶向關(guān)系。隨后利用miR-330-3p mimic和inhibitor轉(zhuǎn)染HT-29細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，當(dāng)過表達(dá)miR-330-3p時(shí)，RUVBL1蛋白表達(dá)水平降低；沉默miR-330-3p時(shí)，RUVBL1和蛋白表達(dá)水平明顯升高，這些結(jié)果提示，RUVBL1是miR-330-3p的直接靶標(biāo)。而且，與正常結(jié)直腸組織比較，miR-330-3p在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)明顯下調(diào)，與上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。在后續(xù)的凋亡增殖實(shí)驗(yàn)中，我們又發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)miR-330-3p HT-29細(xì)胞增殖受抑制，細(xì)胞凋亡增加，細(xì)胞內(nèi)促凋亡蛋白Bax、cleaved-Caspase-3的蛋白表達(dá)水平均上調(diào)，而Bcl-2表達(dá)水平下調(diào)，提示miR-330-3p可通過增加CRC細(xì)胞的凋亡、抑制增殖來影響腫瘤的生長。但miR-330-3p-RUVBL1信號(hào)軸是通過哪條信號(hào)通路影響腫瘤發(fā)生發(fā)展的，尚需要進(jìn)一步研究。