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    β2-糖蛋白Ⅰ對VEGF誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞遷移的影響

    2020-11-19 07:09:20宋振強王靖宇周賽君于珮
    國際內(nèi)分泌代謝雜志 2020年5期
    關(guān)鍵詞:細(xì)胞培養(yǎng)趨化因子培養(yǎng)液

    宋振強 王靖宇 周賽君 于珮

    天津醫(yī)科大學(xué)朱憲彝紀(jì)念醫(yī)院,國家衛(wèi)生健康委員會激素與發(fā)育重點實驗室,天津市代謝性疾病重點實驗室 300070

    2型糖尿病已成為全球流行性疾病。據(jù)2013年我國慢性病及其危險因素監(jiān)測顯示,18歲及以上人群糖尿病患病率已高達10.4%[1]。而隨著糖尿病患病率的急劇增加,糖尿病腎臟病(DKD)已成為慢性腎臟病(CKD)和終末期腎病(ESRD)的主要原因[2-3]。其發(fā)病機制與遺傳因素、糖代謝紊亂、血流動力學(xué)改變、持續(xù)低水平炎性反應(yīng)及氧化應(yīng)激等相關(guān)。近年來,巨噬細(xì)胞在DKD發(fā)病中的作用及機制逐漸引起人們的注意。在糖尿病發(fā)展過程中,代謝、內(nèi)分泌和血流動力學(xué)紊亂可以促進慢性炎性反應(yīng)狀態(tài)的發(fā)生、發(fā)展,在腎組織中則表現(xiàn)為大量巨噬細(xì)胞聚集,且與腎臟損傷和腎功能減退的進展相關(guān),但具體機制尚不明確。血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)是主要的巨噬細(xì)胞趨化因子之一,它主要在腎小球足細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞產(chǎn)生,是血管生成的主要調(diào)節(jié)因子;也可以誘導(dǎo)單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)的表達,促進單核細(xì)胞趨化和黏附分子的表達增加。β2糖蛋白Ⅰ(β2-GP)也稱載脂蛋白H(ApoH),是一種相對分子質(zhì)量為50 000的單鏈血漿糖蛋白,在很多自身免疫性疾病患者的血清中都有發(fā)現(xiàn),肝膽管和近端腎小管上皮細(xì)胞是合成β2-GP的主要場所。在腎小管功能損害早期,尿中β2-GP排泄增加。研究發(fā)現(xiàn),用免疫組化的方法可以檢測到β2-GP與凋亡的巨噬細(xì)胞共定位于人冠狀動脈。VEGF通過激活單核細(xì)胞表達血管內(nèi)皮生長因子受體1(VEGFR1),進而促進其下游p38絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)的磷酸化而誘導(dǎo)單核細(xì)胞遷移,β2-GP可以抑制上述過程。

    因此,本研究欲通過體外實驗觀察VEGF對巨噬細(xì)胞的趨化作用,以及β2-GP對VEGF誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞遷移的影響,并初步探討其影響是否與p38信號通路有關(guān)。

    1 材料與方法

    1.1 實驗材料 小鼠單核/巨噬細(xì)胞系RAW 264.7(天津醫(yī)科大學(xué)免疫教研室饋贈),10%胎牛血清(北京索萊寶科技有限公司),β2-GP(實驗室制備),重組小鼠VEGF(Peprotech 公司),SB203580(碧云天生物技術(shù)研究所),MCP-1、IL-8及巨噬細(xì)胞炎性蛋白-1β(MIP-1β) ELISA試劑盒(美國R&B公司),小鼠β-actin單克隆抗體、兔抗小鼠p38MAPK多克隆抗體及兔抗小鼠磷酸化p38MAPK多克隆抗體(Cell Signaling Technology),兔抗小鼠VEGFR1多克隆抗體(Thermo Scientific公司),辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG及辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG(北京康為世紀(jì)生物有限公司)。

    1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 以小鼠單核/巨噬細(xì)胞系RAW 264.7為研究對象,細(xì)胞置于37℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng),用含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng),每日更換新鮮培養(yǎng)液,待細(xì)胞生長至約90%融合時即傳代,選擇處于對數(shù)生長期、細(xì)胞形態(tài)飽滿、狀態(tài)良好的細(xì)胞進行實驗,按表1進行分組。

    1.3 Transwell細(xì)胞遷移實驗 將Transwell培養(yǎng)板下室加入600 μl培養(yǎng)液,上室加入100 μl培養(yǎng)液后

    表1 細(xì)胞分組情況

    放于37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)預(yù)孵育2 h。接種細(xì)胞,棄去上室培養(yǎng)液,加入100 μl細(xì)胞密度為105/ml的細(xì)胞懸液,下室換新鮮的細(xì)胞培養(yǎng)液。放于37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育。2 h后細(xì)胞貼壁,根據(jù)表2加入干預(yù)因素(上室體系100 μl,下室體系600 μl),同一組別設(shè)置3個復(fù)孔,37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育6 h。取出Transwell培養(yǎng)板,棄去上下室培養(yǎng)液,下室加入600 μl 10%中性福爾馬林溶液,上室加入100 μl 10%中性福爾馬林溶液,固定10~15 min。棄去上下室固定液,下室加入600 μl臺盼藍染液,上室加入100 μl臺盼藍染液,染色5~10 min。染色后用PBS緩沖液稍洗,用棉簽輕輕擦去上室上表面細(xì)胞,倒置顯微鏡下觀察,每孔計數(shù)6個高倍視野細(xì)胞數(shù),計算平均值(即遷移至小室下表面的細(xì)胞數(shù))。

    表2 Transwell細(xì)胞遷移實驗

    1.4 MCP-1、白細(xì)胞介素-8(IL)-8及MIP-1β的表達 將密度為1×105/ml的細(xì)胞懸液接種于六孔細(xì)胞培養(yǎng)板中(2 ml/孔),置于37℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。經(jīng)無血清饑餓培養(yǎng)過夜后,按表1加入干預(yù)因素。細(xì)胞置于37℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)6 h后從培養(yǎng)箱內(nèi)取出,小心吸取上清于無菌管中,離心20 min(2 000~3 000 r/min),仔細(xì)收集上清,ELISA法檢測上清液中MCP-1、IL-8及MIP-1β的濃度,嚴(yán)格按試劑盒說明書操作。

    1.5 VEGF信號通路變化 將密度為1×105/ml的細(xì)胞懸液接種于六孔細(xì)胞培養(yǎng)板中(2 ml/孔),置于37℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。經(jīng)無血清饑餓培養(yǎng)過夜后,按表1加入干預(yù)因素。培養(yǎng)6 h之后,棄去培養(yǎng)液,收集細(xì)胞并提取細(xì)胞總蛋白。Western印跡檢測VEGFR1、p38MAPK及磷酸化p38 MAPK表達。BCA法測定蛋白濃度,十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE),轉(zhuǎn)膜,封閉,一抗、二抗孵育,曝光顯影,凝膠成像儀記錄目的蛋白灰度值,計算目的蛋白表達水平并進行統(tǒng)計分析。

    2 結(jié)果

    2.1 Transwell細(xì)胞遷移實驗(圖1,封3)

    2.1.1 VEGF對巨噬細(xì)胞具有趨化作用 與A組相比,B組巨噬細(xì)胞遷移的數(shù)量增加(t=22.089,P<0.05)。

    2.1.2 p38抑制劑可抑制VEGF對巨噬細(xì)胞的趨化作用 與B組相比,D組巨噬細(xì)胞遷移明顯降低(t=63.625,P<0.05)。

    2.1.3 β2-GP可以抑制VEGF誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞遷移作用 與B組相比,C組巨噬細(xì)胞的遷移明顯減弱(t=22.687,P<0.05)。A組和E組巨噬細(xì)胞遷移的數(shù)目有差異(t=4.602,P<0.05)。

    2.2 VEGF誘導(dǎo)MCP-1、IL-8及MIP-1β的分泌 與A組相比,B組巨噬細(xì)胞趨化因子MCP-1、IL-8及MIP-1β的分泌增加(t=3.339、11.140、 2.254,P均<0.05),與B組相比,C組和D組抑制VEGF誘導(dǎo)的3種趨化因子的分泌減少(t=3.148、2.402、2.798、6.754、4.459、5.528,P均<0.05),見圖2。

    2.3 β2-GP對VEGFR1表達及p38MAPK信號通路的影響

    2.3.1 β2-GP可抑制VEGF誘導(dǎo)的VEGFR1表達 Western印跡結(jié)果顯示,與A組相比,B組巨噬細(xì)胞VEGFR1的表達增加(t=5.161,P<0.05),與B組相比,C組巨噬細(xì)胞VEGFR1表達降低(t=4.965,P<0.05,圖3)。

    2.3.2 β2-GP降低VEGF誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞p38MAPK通路的激活程度 與A組相比,B組巨噬細(xì)胞p38MAPK通路的磷酸化程度增加(t=12.384,P<0.05),與B組相比,C組磷酸化程度降低(t=6.581,P<0.05),但高于A組(t=6.323,P<0.05)。

    3 討論

    近年來,隨著人們生活方式與飲食結(jié)構(gòu)的變化,糖尿病的患病率不斷上升,而由糖尿病所致的腎病也十分普遍,現(xiàn)已成為CKD和ESRD的重要誘發(fā)原因。然而,即使嚴(yán)格的控制糖脂代謝紊亂仍無法控制DKD的發(fā)生、發(fā)展,因此,研究DKD的發(fā)病機制以及尋找有效的預(yù)防和治療策略已迫在眉睫。

    既往研究結(jié)果提示,DKD相關(guān)因素包括遺傳因素、高血糖、血液動力學(xué)改變、血脂紊亂、氧化應(yīng)激等[4]。而近年來,持續(xù)低水平炎性反應(yīng)逐漸被人們認(rèn)識,尤其是巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的炎性反應(yīng)可能是DKD發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵因素之一。巨噬細(xì)胞是腎小球高濾過所致腎損傷中的一個關(guān)鍵因子[5]。巨噬細(xì)胞浸潤程度與白蛋白尿水平、血肌酐水平、腎小球硬化程度和腎間質(zhì)纖維化程度相關(guān)[6]。用來氟米特等免疫抑制治療可明顯減輕DKD巨噬細(xì)胞的浸潤程度,從而延緩了DKD的進展[7]。巨噬細(xì)胞在受到炎性因子等刺激時會誘導(dǎo)合成誘導(dǎo)型一氧化氮合酶,催化合成大量的一氧化氮,導(dǎo)致腎小球毛細(xì)血管高灌注、高濾過的狀態(tài),參與腎臟損傷。糖尿病狀態(tài)下,巨噬細(xì)胞可以通過產(chǎn)生IL-1和血小板源性生長因(PDGF),促進成纖維細(xì)胞的增殖,進而促進腎臟纖維化的發(fā)生[8]。

    VEGF又稱為血管通透因子,是重要的促血管生成活性的生長因子,對內(nèi)皮細(xì)胞具有促有絲分裂和抗凋亡作用,增加了血管的通透性,在調(diào)節(jié)正常和病理性血管生成過程中發(fā)揮了重要作用[9]。此外,VEGF也是主要的巨噬細(xì)胞趨化因子之一,它主要在腎小球足細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞產(chǎn)生,是血管生成的主要調(diào)節(jié)因子;也可以誘導(dǎo)MCP-1的表達,促進單核細(xì)胞趨化和黏附分子的表達。Zorena等[10]研究表明,血清VEGF水平升高是1型糖尿病微血管并發(fā)癥的獨立影響因素,并且VEGF水平與糖化血紅蛋白呈正相關(guān)。Pascal等[11]通過建立DKD的動物模型,發(fā)現(xiàn)腎小球VEGF-A水平升高,并且多項研究表明,在糖尿病動物模型中抑制VEGF-A可以預(yù)防白蛋白尿和腎小球肥大。VEGF以自分泌作用于腎小球足細(xì)胞,通過VEGF/VEGFR1途徑介導(dǎo)足突的消失和腎小球基底膜增厚;以旁分泌作用于內(nèi)皮細(xì)胞,通過VEGF/VEGFR2途徑促進血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移,進而誘導(dǎo)新生血管的形成,亦可增加內(nèi)皮通透性;同時作為趨化因子招募巨噬細(xì)胞,通過VEGF/VEGFR1途徑促進巨噬細(xì)胞腎小球及腎間質(zhì)的浸潤[12]。

    VEGFR1是在單核細(xì)胞上表達的唯一的VEGFR,VEGF誘導(dǎo)的單核細(xì)胞遷移是由VEGFR1(Flt-1)介導(dǎo)的。使用VEGF-A抑制劑sFlt-1轉(zhuǎn)染先前存在腎臟損害的1型糖尿病小鼠模型,發(fā)現(xiàn)sFlt-1可減少內(nèi)皮細(xì)胞激活,降低腎小球巨噬細(xì)胞浸潤[11]。單核-巨噬細(xì)胞遷移活性是由p38MAPK途徑介導(dǎo)的,VEGF可以激活單核細(xì)胞表達VEGFR1,進而促進其下游p38MAPK的磷酸化,該過程在VEGFR1介導(dǎo)的單核細(xì)胞趨化反應(yīng)中起關(guān)鍵作用[13]。

    在本實驗中,通過Transwell遷移實驗可以看到VEGF可以誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞遷移(P<0.05),發(fā)揮趨化因子的作用,并且VEGF可以誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分泌其他趨化因子,本實驗中MCP-1、IL-8以及MIP-1β的分泌均增加(P均<0.05)。而用p38MAPK抑制劑SB203580可以明顯抑制巨噬細(xì)胞的遷移(P<0.05)以及3種趨化因子的分泌(P均<0.05)。Western印跡檢測顯示,VEGF可以明顯促進巨噬細(xì)胞表達VEGFR1,以及p38MAPK通路的磷酸化(P均<0.05),說明VEGF通過作用于巨噬細(xì)胞表面VEGFR1,進而激活其下游p38MAPK通路的磷酸化而介導(dǎo)巨噬細(xì)胞的遷移,與Tchaikovski等[13]的結(jié)果一致。

    β2-GP也稱ApoH。肝膽管和近端腎小管上皮細(xì)胞是合成β2-GP的主要場所,在腸道、胎盤等部位也發(fā)現(xiàn)了β2-GP mRNA的表達。已證明β2GP對糖尿病動脈粥樣硬化和視網(wǎng)膜新生血管形成具有積極作用[14]。此外,Chiu等[15]通過體內(nèi)和體外研究發(fā)現(xiàn),β2-GP在人主動脈內(nèi)皮細(xì)胞(HAECs)中了抑制VEGF誘導(dǎo)的血管生成。這些結(jié)果表明β2-GP在新生血管和預(yù)防血管生成相關(guān)疾病中具有重要作用。Wang等[16]研究發(fā)現(xiàn),在2型糖尿病患者體內(nèi),β2-GP表達水平顯著高于正常人,有并發(fā)癥的2型糖尿病患者β2-GP表達水平高于無并發(fā)癥患者。而降低β2-GP可改善DKD的結(jié)構(gòu)損害和腎功能,并對DKD起到腎臟保護和抗纖維化作用,這與抑制轉(zhuǎn)化生長因子-β1-p38MAPK途徑的激活密切相關(guān)[14]。

    在Transwell細(xì)胞遷移實驗和ELISA實驗中觀察到,β2-GP對巨噬細(xì)胞遷移活性以及分泌功能無顯著影響,與A組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。用Western印跡檢測p38MAPK的磷酸化程度,發(fā)現(xiàn)β2-GP 對p38MAPK通路有輕度的激活作用(P<0.05)。在本實驗中,Transwell細(xì)胞遷移實驗顯示,β2-GP可以抑制VEGF誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞遷移(P<0.05)。ELISA發(fā)現(xiàn)VEGF可以誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分泌趨化因子MCP-1、IL-8以及MIP-1β,而β2-GP可以抑制該作用(P均<0.05)。Western印跡檢測p38MAPK通路的激活以及VEGFR的變化,發(fā)現(xiàn)VEGF可以明顯增加巨噬細(xì)胞VEGFR1的表達以及p38通路的磷酸化,并且加入p38通路抑制劑后,并不影響巨噬細(xì)胞VEGFR1的表達(P均>0.05),但Transwell實驗在加入p38通路抑制劑之后細(xì)胞遷移明顯降低(P<0.05),VEGF誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞遷移是通過VEGF激活巨噬細(xì)胞表面的VEGFR1,進而磷酸化其下游通路p38MAPK來實現(xiàn)的。加入β2-GP后發(fā)現(xiàn),VEGFR1的表達量明顯降低,且p38通路磷酸化水平亦降低,但強于對照組,推測β2-GP抑制VEGF誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞遷移的作用是通過抑制VEGFR1的表達,繼而部分抑制p38MAPK通路的激活來實現(xiàn)的。

    VEGF可激活巨噬細(xì)胞表面的VEGFR1,促進其下游通路p38MAPK磷酸化,從而促進巨噬細(xì)胞趨化因子MCP-1、IL-8以及MIP-1β的分泌、誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞遷移;β2-GP通過抑制VEGFR1表達,并部分抑制上述過程。本研究正在進行進一步探討,該方向有望為DKD新的治療靶點提供參考。

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