茶枝柑果肉發(fā)酵過(guò)程中感官特性及抗氧化活性的變化

周 林,胡金梅,洪峻峰,黃志楓

(1.廣東藥科大學(xué),廣東廣州 510006; 2.廣東環(huán)境保護(hù)工程職業(yè)學(xué)院,廣東佛山 528216)

茶枝柑(Citrusreticulata‘chachi’)別名大紅柑、新會(huì)柑,是廣東新會(huì)的傳統(tǒng)栽培柑橘品種,已有700多年的栽培歷史[1]。以新會(huì)茶枝柑加工的新會(huì)陳皮在2006年獲批中國(guó)地理標(biāo)志產(chǎn)品,2018年行業(yè)產(chǎn)值達(dá)到60億元。由于未成熟的茶枝柑果肉口感青澀,榨汁后會(huì)釋放檸檬苦素等物質(zhì),使果汁里帶有苦澀的口感而難以食用[2-3],因此制作陳皮后的果肉被大量廢棄,浪費(fèi)資源的同時(shí)還產(chǎn)生一定的環(huán)境問(wèn)題。而茶枝柑果肉富含糖類(lèi)、有機(jī)酸、維生素、膳食纖維、黃酮、多酚等生物活性物質(zhì)[4],應(yīng)該得到更好的利用。

表1 CFJ感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Sensory evaluation criteria of CFJ

研究人員已經(jīng)開(kāi)展了茶枝柑果酒[2]、果醋[3]的加工工藝研究。近年來(lái)以果汁、蔬菜汁為主要原料,經(jīng)乳酸菌或酵母菌單獨(dú)或混合發(fā)酵制成的發(fā)酵食品、發(fā)酵果蔬汁越來(lái)越受到消費(fèi)者的青睞[5],也為茶枝柑果肉的加工利用提供了新的契機(jī)。研究發(fā)現(xiàn),通過(guò)益生菌發(fā)酵可以保持或改善果蔬的營(yíng)養(yǎng)及感官特性[6-7];相比于蘋(píng)果汁、菠蘿汁、杏汁和葡萄汁,柑橘汁表現(xiàn)出更強(qiáng)的抗氧化活性[8]。而經(jīng)過(guò)酵母菌20 ℃ 15 d發(fā)酵的柑橘汁,類(lèi)胡蘿卜素和黃酮含量增加,抗氧化活性增強(qiáng)[9]。在確保果蔬營(yíng)養(yǎng)的同時(shí),改善口感欠佳的果蔬風(fēng)味,縮短發(fā)酵時(shí)間,成為開(kāi)發(fā)具有市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力的茶枝柑果肉發(fā)酵方法的關(guān)鍵。因而,高效的茶枝柑果肉發(fā)酵方法的建立,不僅有利于解決茶枝柑果肉廢棄產(chǎn)生的環(huán)境污染問(wèn)題,也為當(dāng)?shù)剞r(nóng)民增收開(kāi)辟一條新途徑,具有良好的社會(huì)意義和潛在的商業(yè)價(jià)值。

本實(shí)驗(yàn)以茶枝柑果肉為原料,經(jīng)酵母菌發(fā)酵后制備成一種新型的茶枝柑發(fā)酵果汁(fermenting juice of chachi,CFJ),研究其發(fā)酵過(guò)程中的感官特性、香氣成分、總酸、還原糖、總酚、總黃酮等營(yíng)養(yǎng)成分以及抗氧化活性,以期揭示CFJ發(fā)酵過(guò)程中風(fēng)味口感、營(yíng)養(yǎng)成分和抗氧化活性的變化,為新會(huì)茶枝柑果肉及相關(guān)產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

茶枝柑 8月份采摘的制作陳皮用青柑,廣東新會(huì)江門(mén)麗宮國(guó)際食品有限公司惠贈(zèng);酵母菌種 市售安琪高活性干酵母粉。葡萄糖 食品級(jí),廣州市琪福食品有限公司;3,5-二硝基水楊酸、福林酚 上海麥克林生化科技有限公司;亞硫酸鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁、酚酞、碳酸鈉、乙醇、甲醇、硫酸亞鐵 分析純,天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司;蒸餾水 廣州屈臣氏食品飲料有限公司;沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(純度均≥98%) 南京源植生物科技有限公司;鄰菲羅啉 分析純,廣州化學(xué)試劑廠;pH7.4 磷酸鹽緩沖液(PBS)(干粉) 北京酷來(lái)搏科技有限公司;過(guò)氧化氫 分析純,天津市百世化工有限公司;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基(DPPH) 福州飛凈生物科技有限公司;一次性無(wú)菌注射器 湖南平安醫(yī)械科技有限公司;0.45 μm微孔過(guò)濾膜 天津市科億隆實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

WJE-L榨汁機(jī) 浙江寧波沃瑪電器有限公司;PA-12C酸奶機(jī) 中山市領(lǐng)銳電器有限公司;JJ-2000B電子天平 美國(guó)雙杰兄弟(集團(tuán))有限公司;HHS-2S恒溫水浴鍋 上海宜昌儀器紗篩廠;SC-06離心機(jī) 安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司;UV-5500PC紫外分光光度計(jì) 廣州市深華生物技術(shù)有限公司;7890B GC-MS液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 Agilent公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 CFJ的制備 挑選完整無(wú)損傷的茶枝柑,蒸餾水清洗干凈后去皮,用榨汁機(jī)對(duì)果肉進(jìn)行榨汁,然后將果汁轉(zhuǎn)移到酸奶機(jī)中,加入40%葡萄糖以及0.5%的酵母菌種,40 ℃發(fā)酵96 h。根據(jù)產(chǎn)品說(shuō)明書(shū),該酵母可以耐受40～42 ℃高溫。每隔24 h對(duì)發(fā)酵果汁進(jìn)行攪拌,同時(shí)取樣置于離心管中,10000 r/min離心10 min,上清液過(guò)0.45 μm濾膜后-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 CFJ的感官評(píng)價(jià) 每隔24 h取出適量的茶枝柑發(fā)酵果汁,由6人組成的評(píng)價(jià)小組對(duì)色澤、組織狀態(tài)、酸味、甜味、苦澀、香氣進(jìn)行感官評(píng)價(jià)[10-11],其中4名男性,2名女性,同一批樣品取樣后隨機(jī)提供給感官評(píng)價(jià)人員。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表1。

1.2.3 CFJ主要活性成分的測(cè)定

1.2.3.1 還原糖含量的測(cè)定 通過(guò)DNS法測(cè)定茶枝柑發(fā)酵果汁中還原糖含量[12]。標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)為y=1.3166x-0.0340,R2=0.993,x為葡萄糖濃度(mg/mL)。

1.2.3.2 總酸含量的測(cè)定 參考國(guó)標(biāo)GB/T 12456-2008的酸堿滴定法[13]。

1.2.3.3 總酚含量的測(cè)定 參考Surveswaran等[14]的方法以沒(méi)食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品,通過(guò)加入福林酚和碳酸鈉溶液顯色后進(jìn)行OD760分光光度法測(cè)定和計(jì)算。標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)為y=1.1010x+0.0420,R2=0.995,x為沒(méi)食子酸濃度(mg/mL)。

表2 CFJ感官評(píng)價(jià)結(jié)果Table 2 Sensory evaluation of CFJ

1.2.3.4 總黃酮含量的測(cè)定 參考Kim等[15]的方法,以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品和30%的乙醇配制成濃度為0.2 mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。測(cè)定體系為:0.3 mL 5%亞硝酸鈉溶液,加入0.3 mL 10%硝酸鋁溶液,混勻靜置6 min;加入2 mL 1 mol/L氫氧化鈉溶液,混勻;最后加入2.4 mL 30%乙醇,混勻后暗處?kù)o置10 min,于510 nm處采用分光光度法測(cè)定和計(jì)算。標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)為y=11.2570x-0.0081,R2=0.999,x為蘆丁濃度(mg/mL)。

1.2.3.5 GC-MS測(cè)定香氣成分的含量 取出凍存的果汁樣品,在30 ℃的水浴中迅速解凍,精確量取果汁5 mL放入5 mL的飽和NaCl水溶液中,置于20 mL螺口頂空瓶中,用聚四氟乙烯隔墊密封瓶蓋旋緊后混勻,上機(jī)檢測(cè)。萃取針頭:DVB/CAR/PDMS(50/30 μm),40 ℃平衡5 min,頂空吸附40 min,解析3 min。色譜條件:使用Rxi-lms毛細(xì)管氣相色譜柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm)。升溫程序?yàn)?初始溫度34 ℃,以5 ℃/min的速度升至100 ℃,再以3 ℃/min的速度升至110 ℃,最后以10 ℃/min的速度升至230 ℃,保持2 min。載氣He(純度大于99.999%),不分流,流速1.38 mL/min。進(jìn)樣口溫度250 ℃,傳輸線(xiàn)溫度為250 ℃。

質(zhì)譜條件:離子源溫度設(shè)為200 ℃,電離方式為EI,電子能量設(shè)為70 eV,掃描范圍為35～500 m/z。

定性采用各組分在圖譜庫(kù)NIST(依據(jù)檢測(cè)處的圖譜庫(kù))進(jìn)行匹配,采用匹配程度大于80%的鑒定結(jié)果,并與文獻(xiàn)資料[16-17]分析結(jié)果進(jìn)行比對(duì)分析,峰面積歸一法計(jì)算揮發(fā)性物質(zhì)的相對(duì)百分含量。

1.2.4 CFJ抗氧化活性的測(cè)定

1.2.4.1 ·OH清除率測(cè)定 參考文獻(xiàn)分光光度法測(cè)定[18]:測(cè)定體系為0.5 mL鄰菲羅啉溶液和1.0 mL 濃度為0.75 mol/L,pH7.4的PBS緩沖液;加入0.5 mL待測(cè)樣品和0.5 mL 0.01% H2O2,振蕩搖勻,37 ℃水浴60 min,在536 nm處測(cè)定吸光值A(chǔ)2。以等體積水代替H2O2溶液,測(cè)定吸光值A(chǔ)1,以扣除樣品本身顏色干擾;以等體積水代替樣品,為空白樣,測(cè)定吸光值A(chǔ)0,每份樣品平行測(cè)定3次,取平均值。按式(1)計(jì)算樣品·OH的清除率:

式(1)

1.2.4.2 DPPH·清除率測(cè)定 參考文獻(xiàn)[19]分光光度法測(cè)定:測(cè)定體系為2 mL 0.180 mmol/L DPPH溶液和0.065 mL樣品,振蕩搖勻,室溫放置30 min,測(cè)定514 nm處的吸光度值A(chǔ)2,用等體積的無(wú)水甲醇代替DPPH溶液,測(cè)定吸光值A(chǔ)1,以扣除樣品本身顏色干擾;以等體積無(wú)水甲醇代替樣品,為空白樣,測(cè)定吸光值A(chǔ)0,每份樣品平行測(cè)定3次,取平均值。按式(2)計(jì)算樣品DPPH·的清除率:

式(2)

1.3 數(shù)據(jù)處理

除GC-MS數(shù)據(jù)外,每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示,應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 21.0對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 CFJ感官評(píng)價(jià)

如表2和圖1所示,CFJ發(fā)酵前后的感官特性變化主要表現(xiàn)在:直接提取的茶質(zhì)柑果汁口感酸澀,難以入口,添加了40%葡萄糖后,甜味明顯增加,但是苦澀感強(qiáng);發(fā)酵后的CFJ口感酸甜適中,苦澀感較弱。發(fā)酵前的CFJ果香味較濃;發(fā)酵后的CFJ發(fā)酵風(fēng)味較濃而果香味較淡。發(fā)酵前的CFJ質(zhì)地均勻,無(wú)沉淀;發(fā)酵后的CFJ有少量沉淀。CFJ發(fā)酵前后口感的變化需要結(jié)合后續(xù)的理化指標(biāo)進(jìn)行分析。

圖1 CFJ感官評(píng)價(jià)雷達(dá)圖Fig.1 Radar map of sensory evaluation of CFJ

2.2 CFJ發(fā)酵過(guò)程主要活性成分含量變化

如圖2a所示,從0～96 h隨著發(fā)酵的進(jìn)行,CFJ中的還原糖被菌體利用而減少,其中在發(fā)酵0～24 h期間,還原糖含量下降幅度最大,減少了14.1%,可能是因?yàn)榻湍妇N處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,碳源迅速消耗。同時(shí),總酸含量逐漸下降,然后趨于穩(wěn)定,檸檬酸和蘋(píng)果酸是各種柑橘中主要的酸類(lèi)物質(zhì)[20],在兼性厭氧或厭氧條件下被酵母菌分解,生成乙醇和CO2,從而導(dǎo)致總酸含量的下降,在其它果汁發(fā)酵過(guò)程中總酸含量也表現(xiàn)出相似的變化趨勢(shì)[21]。

表3 CFJ發(fā)酵過(guò)程中揮發(fā)性成分和相對(duì)含量Table 3 Volatile extracts and their relative contents in fermentation process of CFJ

圖2 CFJ發(fā)酵過(guò)程中總酸、還原糖、總酚、總黃酮含量的變化Fig.2 Changes of the total acid,reducing sugar,total phenolicand total flavonoid contents in fermentation process of CFJ注:a:總酸和還原糖;b:總酚和總黃酮。

發(fā)酵0～48 h,總酚和總黃酮含量亦呈下降趨勢(shì)(圖2b),與陳亞楠等[22]用乳酸菌發(fā)酵陳皮柑飲料的結(jié)果相似,可能是酚類(lèi)物質(zhì)自身容易氧化分解導(dǎo)致含量下降。48～96 h,總酚和黃酮含量略有增加,可能是隨著發(fā)酵的進(jìn)行,乙醇和CO2的含量增加,有利于茶枝柑果汁中的酚類(lèi)物質(zhì)被浸出,導(dǎo)致其含量的增加。

2.3 GC-MS測(cè)定香氣成分的含量的結(jié)果

通過(guò)GC-MS檢測(cè)CFJ發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的揮發(fā)性成分及其相對(duì)含量(表3),可知0～96 h發(fā)酵過(guò)程中,烯烴的相對(duì)含量最高,從53.70%增加至77.77%,主要成分為d-檸檬烯和γ-萜烯。其中d-檸檬烯在所有香氣成分中含量最高,和文獻(xiàn)[17]的報(bào)道一致。d-檸檬烯和γ-萜烯是同分異構(gòu)體,分子式為C10H16,也是柑橘類(lèi)水果中的天然成分和橙皮精油中的主要成分,分別呈新鮮橙子和檸檬香氣[23]。其次是醇類(lèi),由34.50%降至16.05%,主要成分為α-松油醇和4-萜烯醇;α-松油醇和4-萜烯醇也是同分異構(gòu)體,分子式為C10H18O,分別呈丁香味[24]、辛香和木香味[25]。酯類(lèi)由7.74%降至2.14%,主要成分為2-(甲氨基)苯甲酸甲酯,周欣等[26]報(bào)道2-(甲氨基)苯甲酸甲酯作為新會(huì)陳皮含有的特定揮發(fā)性成分,可用于新會(huì)陳皮的鑒定。因此在果肉發(fā)酵液中也檢測(cè)出了該成分。醛酮、酚類(lèi)的相對(duì)含量均較低(<1%)。

綜合上述結(jié)果,0～96 h發(fā)酵過(guò)程中上述烯烴成分增加,而醇類(lèi)和酯類(lèi)成分減少,這和茶枝柑果肉發(fā)酵后果香味有所保留,但是整體仍然減輕的感官評(píng)價(jià)是一致的。另外,發(fā)酵24 h以后香茅醇后沒(méi)有檢出,而香茅醇具有一定的苦味[27],可以推測(cè)感官評(píng)價(jià)中果汁經(jīng)過(guò)發(fā)酵后,苦澀感降低可能與之存在一定的關(guān)聯(lián)。這些揮發(fā)性物質(zhì)種類(lèi)和含量的變化有助于理解感官分析的結(jié)果,但是這些成分變化和感官變化之間的關(guān)系還需要深入研究,尤其是發(fā)酵后果汁液體組分中檸檬苦素、檸檬酸、蘋(píng)果酸等含量的變化規(guī)律,需要結(jié)合對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行精確的定性和定量。

表4 主要化學(xué)成分與兩種自由基清除率的相關(guān)性分析Table 4 Correlation analysis between main chemical components and scavenging rate of two free radicals

2.4 CFJ發(fā)酵過(guò)程抗氧化活性變化

CFJ發(fā)酵過(guò)程中體外抗氧化活性的測(cè)試結(jié)果見(jiàn)圖3。發(fā)酵前含果肉的果汁混合液·OH和DPPH·清除率均為最大值,分別為85.57%和84.40%。發(fā)酵0～24 h兩種自由基清除率有所下降,其中·OH清除率下降13.24%,DPPH·清除率下降26.98%,說(shuō)明發(fā)酵后CFJ中抗氧化成分的含量減少。發(fā)酵48～96 h兩種自由基清除率基本趨于平穩(wěn),說(shuō)明茶枝柑果汁的部分活性物質(zhì)和抗氧化性能在一定程度上達(dá)到穩(wěn)定。已有陳皮提取物抗氧化活性與多酚含量呈正相關(guān)的報(bào)道[28],這和本研究中0～24 h CFJ抗氧化活性降低和黃酮、多酚類(lèi)物質(zhì)含量減少的實(shí)驗(yàn)結(jié)果是一致的。

圖3 CFJ對(duì)·OH和DPPH·清除率的變化Fig.3 Changes of scavenging rateagainst ·OH and DPPH·by CFJ

2.5 主要活性成分與抗氧化活性能力相關(guān)性分析

利用SPSS 21.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性分析(表4),可見(jiàn)DPPH·清除率與·OH清除率、總酚含量、總黃酮含量、總酸含量和還原糖含量均呈顯著正相關(guān)(P<0.05),說(shuō)明總酚含量、總黃酮含量、總酸含量和還原糖含量對(duì)DPPH·的清除有顯著的影響。·OH清除率與總酸含量呈極顯著相關(guān)(P<0.01);與總黃酮含量和還原糖含量均呈顯著相關(guān)(P<0.05);與總酚含量無(wú)顯著的相關(guān)性(P=0.075)。說(shuō)明總酸含量對(duì)·OH的清除有極顯著的影響,總黃酮含量和還原糖含量對(duì)·OH的清除有顯著的影響,總酚含量對(duì)·OH的清除無(wú)顯著的影響。綜合上述結(jié)果說(shuō)明,與·OH清除率相比較,DPPH·清除率可以更好地用于該發(fā)酵過(guò)程中總酚、總黃酮抗氧化活性的檢測(cè)。

上述結(jié)果也可以說(shuō)明,茶枝柑果汁中的活性成分含量決定果汁的抗氧化活性能力,但抗氧化活性能力的強(qiáng)弱并不是由單一的某種活性成分所決定的,而是各種抗氧化活性成分協(xié)同作用的結(jié)果。相關(guān)的報(bào)道有:Sicari等[29]研究了15種柑橘,發(fā)現(xiàn)酚類(lèi)物質(zhì)在柑橘水果總抗氧化能力占主導(dǎo)地位,黃酮類(lèi)化合物具有重要的清除自由基的能力;Park等[30]采用乳酸菌發(fā)酵混合漿果汁后,其抗氧化活性呈現(xiàn)上升的趨勢(shì);Mousavi等[31]利用乳酸菌發(fā)酵石榴汁,發(fā)現(xiàn)花青素含量均顯著降低,抗氧化活性呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。還有研究報(bào)道,采用混菌發(fā)酵方式,能增加發(fā)酵果汁中的黃酮、多酚含量,并提高其抗氧化能力[32-33]。因此,不同的實(shí)驗(yàn)研究得到的結(jié)果表現(xiàn)出一定的差異,這與實(shí)驗(yàn)材料、微生物菌種、處理方法和發(fā)酵條件等有關(guān)。需要說(shuō)明的是,大多數(shù)果肉、果渣或果汁采用酵母菌發(fā)酵時(shí)溫度為20～28 ℃,本實(shí)驗(yàn)中采用了耐高溫的安琪酵母,主要是考慮到大規(guī)模發(fā)酵時(shí)相對(duì)較高的溫度有利于降低發(fā)酵過(guò)程降溫消耗的能源成本,表明在40 ℃進(jìn)行的發(fā)酵達(dá)到了預(yù)期的目標(biāo)。由于發(fā)酵溫度不僅影響發(fā)酵終點(diǎn)到達(dá)的時(shí)間,還會(huì)影響菌體的氧化應(yīng)激、代謝產(chǎn)物的類(lèi)型[34],因而溫度對(duì)茶枝柑果肉發(fā)酵過(guò)程的具體影響還有待深入。

3 結(jié)論

以茶枝柑果肉為原料,經(jīng)安琪酵母40 ℃發(fā)酵96 h后制備成一種茶枝柑發(fā)酵果汁。在感官評(píng)價(jià)方面,茶枝柑發(fā)酵果汁口感酸甜適中,苦澀感較弱,帶有淡淡的果香和濃郁的發(fā)酵風(fēng)味,與酸澀的茶枝柑果肉相比在風(fēng)味口感上有很大的改善。對(duì)揮發(fā)性香味物質(zhì)的GS-MS分析表明,發(fā)酵后揮發(fā)性香氣物質(zhì)相對(duì)含量最高的為烯烴,由53.70%增加至77.77%;而醇類(lèi)、酯類(lèi)則有所降低,分別由34.50%降至16.05%,7.74%降至2.44%;醛酮類(lèi)、酚類(lèi)的含量均低于1%。發(fā)酵風(fēng)味的改善與發(fā)酵過(guò)程中主要化學(xué)成分的改變有關(guān)。在體外抗氧化活性評(píng)價(jià)方面,茶枝柑發(fā)酵果汁對(duì)·OH和DPPH·的清除率有所下降,抗氧化活性能力有所降低,這與茶枝柑發(fā)酵果汁中多酚、黃酮等成分含量的下降有關(guān)。研究初步揭示了茶枝柑果肉發(fā)酵過(guò)程中風(fēng)味成分和抗氧化活性變化的規(guī)律,為茶枝柑果肉飲料的開(kāi)發(fā)提供了依據(jù)。