三七、黃芪總皂苷聯(lián)合骨髓干細(xì)胞移植對糖尿病潰瘍miRNA-146a的影響

杜玉青 劉亞莉 李友山 劉鳳桐 黃天一

摘要?目的：探討三七總皂苷（PNS）、黃芪總皂苷（TSA）聯(lián)合自體骨髓干細(xì)胞治療糖尿病潰瘍對miRNA-146a的影響。方法：選取SD大鼠60只，在雙足背上制成糖尿病足模型，采用全骨髓培養(yǎng)加貼壁法分離、擴(kuò)增至第4代的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，按隨機(jī)數(shù)字法將大鼠分為空白組、對照組、干細(xì)胞組、黃芪組;三七組干細(xì)胞組、黃芪組、三七組創(chuàng)面每日注射自體骨髓干細(xì)胞（0.3 mL/cm2），黃芪組每日加注黃芪注射液（0.3 mL/cm2），三七組每日加注血塞通（0.4 mL/cm2），7 d后處死，采用PCR法檢測miRNA-146a水平，Western blot法檢測TLR4 miRNA、NOD1 miRNA、核因子-κB miRNA的表達(dá)。結(jié)果：與對照組比較，干細(xì)胞組、黃芪組和三七組大鼠創(chuàng)面愈合率極顯著增大，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;與對照組比較，干細(xì)胞組、黃芪組和三七組大鼠miRNA-146a、TLR4 miRNA、核因子-κB miRNA、NOD1 miRNA表達(dá)量顯著增大，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;與干細(xì)胞組比較，三七組miRNA-146a、TLR4 miRNA、核因子-κB miRNA、NOD1 miRNA表達(dá)量顯著增大，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：三七總皂苷、黃芪總皂苷聯(lián)合骨髓干細(xì)胞治療糖尿病足潰瘍有效，其愈合機(jī)制可能與TLR4/核因子-κB通路上調(diào)miRNA-146a的表達(dá)有關(guān)。

關(guān)鍵詞?三七;黃芪;大鼠;糖尿病潰瘍;自體骨髓干細(xì)胞移植

Abstract?Objective：To explore the mechanism of panax notoginseng saponins，total saponins of Astragalus combined with autologous bone marrow stem cell transplantation for treating diabetic ulcer on mirna-146a.Methods：A total of 60 SD rats were selected to make diabetic foot model on the dorsum of both feet.The fourth generation of bone marrow mesenchymal stem cells were isolated and expanded by whole bone marrow culture and adherent method.According random number table method，the rats were randomly divided into a blank group，a control group，a stem cell group，and Radix Astragali seu Hedysar group.The wounds of Radix Notoginseng，stem cell group，Radix Astragali seu Hedysar group were injected with autologous bone marrow stem cells（0.3 mL/CM2）every day，Radix Astragali seu Hedysar group was injected with astragalus injection（0.3 mL/CM2）every day，and Radix Notoginseng group was injected with Xuesaitong（0.4 mL/CM2）every day.After 7 days，they were sacrificed.The content of miRNA-146a was detected by PCR.The expression of TLR4 miRNA，NOD1 miRNA，and NF-κB miRNA was detected by Western blot.Results：Compared with the control group，the wound healing rate of rats in stem cell group，Radix Astragali seu Hedysar group and Radix Notoginseng group increased significantly（P<0.01），and the expression of miRNA-146a，TLR4 miRNA，NF-κ B miRNA and NOD1 miRNA in stem cell group，Radix Astragali seu Hedysari group and Radix Notoginseng group increased significantly compared with the control group（P<0.05）.Compared with stem cell group，the expression of miRNA-146a，TLR4 miRNA，NF-κ B miRNA and NOD1 miRNA in Radix Notoginseng group was significantly increased（P<0.05）.Conclusion：Panax notoginseng saponins and astragalus saponins combined with bone marrow stem cells are effective in the treatment of diabetic foot ulcer，and the healing mechanism may be related to the up-regulation of miRNA-146a expression by TLR4/NF-κ B pathway.

Keywords?Radix Notoginseng; Radix Astragali seu Hedysari; Rats; Diabetic ulcer; Autologous bone marrow stem cell transplantation

中圖分類號：R284文獻(xiàn)標(biāo)識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.19.010

糖尿病足（Diabetic Foot，DF）是糖尿病的嚴(yán)重并發(fā)癥。據(jù)統(tǒng)計(jì)，截肢患者每年約50%是由于糖尿病引起的，其中糖尿病患者發(fā)生的原因是足部潰瘍加重引發(fā)潰瘍面大面積感染以及壞疽[1-2]。糖尿病足在中醫(yī)學(xué)中屬于“脫疽”“消渴”范疇，多因病情纏綿難愈，傷津耗氣，氣虛則無力行血，久病脈絡(luò)瘀阻，發(fā)生脫疽，患病人群主要是中老年人，氣血漸弱，以氣虛血瘀證型多見[3]。有研究表明，黃芪總皂苷（Total Saponins of Astragalus，TSA）能抑制胰脂肪酶活性和醛糖還原酶活性，減少糖尿病的誘發(fā)因素，延緩糖尿病并發(fā)癥的病程[4]。另外，三七總皂苷（Panax Notoginseng Saponins，PNS）通過抑制轉(zhuǎn)化生長因子（Transforming Growth Factor-β，TGF-β）抗氧化，加速細(xì)胞凋亡，其Caspase-3基因轉(zhuǎn)錄上調(diào)，減輕糖尿病腎病足細(xì)胞損害[5]。目前，利用現(xiàn)代生物工程技術(shù)-自體骨髓干細(xì)胞（Bone Marrow Stem Cell，BMSC）移植在臨床上治療糖尿病足掀起熱潮[6]，其主要成分是造血干細(xì)胞（Hematopoietic Stem Cell，HSC）和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（Bone Mesenchymal Stem Cells，BMSC），在缺血環(huán)境中生成平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞（Endothelial Cels，ECs）并增殖，在局部組織生成許多微細(xì)血管，重建細(xì)胞外基質(zhì)，改善缺血、缺氧的下肢狀態(tài)[7]。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA（microRNA）可以調(diào)控骨髓干細(xì)胞內(nèi)miRNA的水平，可有效改善干細(xì)胞移植的治療效果，針對細(xì)胞分化、移植后干細(xì)胞的生存能力、血管新生及細(xì)胞凋亡等方面有著積極的作用[8]。但如何通過骨髓干細(xì)胞分化和調(diào)控促進(jìn)糖尿病足潰瘍愈合的機(jī)制尚不明確。本課題旨在探究中藥三七、黃芪外治干預(yù)大鼠自體骨髓干細(xì)胞治療糖尿病潰瘍過程中，如何調(diào)控miRNA水平促進(jìn)糖尿病足潰瘍愈合的機(jī)制。

1?材料與方法

1.1?材料

1.1.1?動(dòng)物?8周齡SPF級SD大鼠，雄性，體質(zhì)量80～100 g，購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物所，合格證號SCXK（京）2016-0001。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究均符合中國中醫(yī)科學(xué)院動(dòng)物倫理委員會有關(guān)動(dòng)物研究指導(dǎo)原則。動(dòng)物飼養(yǎng)條件：在三級動(dòng)物室無菌飼料喂養(yǎng)，每5只1籠，溫度（25±2）℃，相對濕度（55±5）%，12 h光照晝夜循環(huán)，自由獲取食物和水。

1.1.2?藥物?黃芪注射液（神威藥業(yè)集團(tuán)有限公司，國藥準(zhǔn)字Z13020999），血塞通注射液（廣西梧州制藥股份有限公司，國藥準(zhǔn)字Z20025652）。

1.1.3?試劑與儀器

試劑：MEM/F12干粉培養(yǎng)基（Gibco Invitrogen Corporation）（Sigma公司，美國，批號：1322013），鏈脲佐菌素（Streptozocin，STZ）（Sigma公司，美國，批號：3444091），血糖試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，批號：7603061），磷酸緩沖鹽溶液（Phosphate Buffer Saline，PBS）（北京百奧萊博科技有限公司，批號：3342213），椎蟲藍(lán)（上海生工公司，批號：8713518），SV總RNA分離試劑盒（Promega公司，美國，批號：2273041），反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Promega公司，美國，批號：3357123），SYBRGreenⅠ實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒（ABI公司，美國，批號：KS14679），TLR4（Santa Cruz公司，美國，批號：0284381），NOD1受體（Santa Cruz公司，美國，批號：55556231），核因子-κB（Santa Cruz公司，美國，批號：4439720），ki67的抗體試劑盒（Santa Cruz公司，美國，批號：3802342）。相關(guān)引物序列由北京優(yōu)博蘭基因技術(shù)有限公司合成。見表1。

儀器：熒光倒置相差顯微鏡（尼康公司，日本，型號：Ti-E/U/S），多功能酶標(biāo)儀（BioTek公司，美國，型號：bio-tek ELX800），生化自動(dòng)分析儀檢測（Beckman公司，美國，型號：Dxc 800），PCR儀（Applied Biosystems公司，美國，型號：7500 Real-time），圖像分析系統(tǒng)（Molecular Devices公司，美國，型號：MetaMorph）。

1.2?方法

1.2.1?分組與模型制備

糖尿病足大鼠模型：經(jīng)高脂飼料（配方：蛋黃2.5%，蔗糖20%，豬油10%，基礎(chǔ)飼料67.5%）飼養(yǎng)1個(gè)月，體質(zhì)量控制在300～350 g，進(jìn)行腹腔40 mg/kg注射STZ。觀察1周，取成模穩(wěn)定的糖尿病大鼠，在大鼠腹腔注射3.5%水合氯醛1 mL/100 g進(jìn)行麻醉，用電動(dòng)剃須刀除去大鼠背部長毛，面積約4 cm×4 cm，在脫毛區(qū)用直徑為3 cm的圓形塑料蓋蘸龍膽紫標(biāo)記造模面積，在無菌條件下剪去造模區(qū)皮膚，深達(dá)筋膜。六層醫(yī)用紗布覆蓋創(chuàng)面，用醫(yī)用紙膠帶包扎固定。優(yōu)選60只健康成模的糖尿病潰瘍大鼠及15只空白對照潰瘍大鼠供實(shí)驗(yàn)使用?？瞻讓φ战M潰瘍大鼠15只（簡稱空白組）;對照組糖尿病潰瘍大鼠15只（簡稱：對照組）;單純干細(xì)胞組糖尿病潰瘍大鼠15只（簡稱：干細(xì)胞組）干細(xì)胞+黃芪組糖尿病潰瘍大鼠15只（簡稱黃芪組）干細(xì)胞+三七組糖尿病潰瘍大鼠15只（簡稱三七組）[10]。

自體骨髓干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)、標(biāo)記：從SD大鼠股骨提取骨髓細(xì)胞，采用全骨髓培養(yǎng)加貼壁選擇法對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分離、擴(kuò)增，對第4代的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行BrdU標(biāo)記，標(biāo)記終濃度為10 mg/L，標(biāo)記時(shí)間24 h[11];然后收集培養(yǎng)細(xì)胞，采用椎蟲藍(lán)拒染活細(xì)胞計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù);并且取一滴懸液制作爬片。最終計(jì)數(shù)細(xì)胞時(shí)采用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板，按照分組應(yīng)用PBS緩沖細(xì)胞。

1.2.2?給藥方法?空白對照組、對照組大鼠創(chuàng)面不予處理，干細(xì)胞組創(chuàng)面注射一次自體骨髓干細(xì)胞（0.3 mL/cm2）[12]，每日清潔換藥1次，以小紗布（4 cm×4 cm）覆蓋，醫(yī)用紙膠帶包扎固定;黃芪組創(chuàng)面注射一次自體骨髓干細(xì)胞（0.5 mL/cm2），每日創(chuàng)面內(nèi)注射黃芪注射液0.3 mL/cm2[13]，以小紗布（4 cm×4 cm）覆蓋，醫(yī)用紙膠帶包扎固定;三七組創(chuàng)面注射1次自體骨髓干細(xì)胞（0.5 mL/cm2），每日創(chuàng)面內(nèi)注射血塞通注射液0.4 mL/cm2[14]，以小紗布（4 cm×4 cm）覆蓋，醫(yī)用紙膠帶包扎固定。7 d后將大鼠麻醉（3.5%水合氯醛1 mL/100 g），腹主動(dòng)脈取血（量約8 mL）處死[15]。同時(shí)創(chuàng)面中心點(diǎn)肉芽組織2份（各5 g左右），立即冷凍于液氮中保存，用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR法和Western blot檢測。

1.2.3?檢測指標(biāo)與方法

觀察一般情況：觀察并記錄SD大鼠情況，尤其是大鼠每日的體質(zhì)量數(shù)值改變。

創(chuàng)面愈合情況：記錄每日創(chuàng)面愈合面積，計(jì)算創(chuàng)面愈合率，創(chuàng)面愈合率=（給藥前創(chuàng)面面積-未愈合創(chuàng)面面積）/給藥前創(chuàng)面面積×100%。

熒光定量PCR法：取冰凍創(chuàng)面組織塊稱重后剪碎，使用一步法提取RNA，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測組織中miRNA-146a水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，收集血管組織，SV總RNA分離試劑盒提取組織的總RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒擴(kuò)增，用相對定量表達(dá)法進(jìn)行結(jié)果的定量分析。

Western blot法：收集血管組織，MBST裂解液裂解組織和抽提組織總蛋白，用Bradford法測定蛋白濃度，調(diào)蛋白濃度使各組一致。等量樣品上樣，SDS-聚丙稀酰胺凝膠電泳，然后將蛋白電轉(zhuǎn)移至PVDF上電泳，依次用一抗和二抗，加入增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑后用感光膠片曝光。用圖像分析系統(tǒng)對Western blot結(jié)果進(jìn)行灰度掃描，以對照組的面積灰度值為1.0與實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行比較和定量分析。檢測皮膚組織中TLR4 miRNA，NOD1 miRNA和核因子-κB miRNA表達(dá)。

1.3?統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用單因素方差分析，方差齊的數(shù)據(jù)兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2?結(jié)果

2.1?體質(zhì)量?與空白組比較，糖尿病大鼠體質(zhì)量顯著減小，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;與對照組比較，三七組、黃芪組大鼠體質(zhì)量顯著增大，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;與干細(xì)胞組比較，三七組大鼠體質(zhì)量極顯著增大，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表2。

2.2?創(chuàng)面愈合率?與空白組比較，糖尿病大鼠創(chuàng)面愈合率顯著減小，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;與對照組比較，干細(xì)胞組、黃芪組和三七組大鼠創(chuàng)面愈合率極顯著增大，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;與干細(xì)胞組比較，三七組大鼠創(chuàng)面愈合率顯著增大，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表3。

2.3?實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測皮膚組織中miRNA-146a表達(dá)?與空白組比較，糖尿病大鼠miRNA-146a表達(dá)量顯著減小，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;與對照組比較，干細(xì)胞組、黃芪組和三七組大鼠皮膚組織miRNA-146a表達(dá)量顯著增大，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;與干細(xì)胞組比較，三七組大鼠皮膚組織miRNA-146a表達(dá)量顯著增大，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表4。

2.4?Western blot法檢測皮膚組織中TLR4 miRNA，NOD1 miRNA和核因子-κB miRNA表達(dá)

2.4.1?皮膚組織中TLR4 miRNA表達(dá)?與空白組比較，糖尿病大鼠TLR4 miRNA表達(dá)量顯著減小，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;與對照組比較，干細(xì)胞組、黃芪組和三七組大鼠皮膚組織TLR4 miRNA表達(dá)量顯著增大，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;與干細(xì)胞組比較，三七組大鼠皮膚組織TLR4 miRNA表達(dá)量顯著增大，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見圖1，表5。

2.4.2?Western blot法檢測皮膚組織NOD1 miRNA表達(dá)?與空白組比較，糖尿病大鼠NOD1 miRNA表達(dá)量顯著減小，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;與對照組比較，干細(xì)胞組、黃芪組和三七組大鼠皮膚組織NOD1 miRNA表達(dá)量顯著增大，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;與干細(xì)胞組比較，三七組大鼠皮膚組織NOD1 miRNA表達(dá)量顯著增大，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見圖1，表6。

2.4.3?PCR和Western blot檢測皮膚組織核因子-κB miRNA表達(dá)?與空白組比較，糖尿病大鼠核因子-κB miRNA表達(dá)量顯著減小，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;與對照組比較，干細(xì)胞組、黃芪組和三七組大鼠皮膚組織核因子-κB miRNA表達(dá)量顯著增大，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;與干細(xì)胞組比較，黃芪組和三七組大鼠皮膚組織核因子-κB miRNA表達(dá)量顯著增大，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見圖1，表7。

3?討論

潰瘍創(chuàng)面愈合要通過新生肉芽組織、形成新血管、膠原蛋白集聚、重建組織等過程。但是糖尿病足的潰瘍面組織分化水平降低、血管形成速度緩慢等原因阻礙潰瘍愈合，甚至日久不愈。干細(xì)胞能夠分化、增殖細(xì)胞，在潰瘍區(qū)分泌多種細(xì)胞因子，增強(qiáng)血管新生能力，改建微循環(huán)通路，促進(jìn)創(chuàng)面修復(fù)。研究發(fā)現(xiàn)，MSC注射STZ的加強(qiáng)版糖尿病大鼠修復(fù)潰瘍面的速度顯著提高，其原因可能是骨髓干細(xì)胞能夠在缺血的組織中增殖、分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞，在潰瘍組織中滿足創(chuàng)面愈合的血管量，增強(qiáng)局部潰瘍面的細(xì)胞營養(yǎng)以及促進(jìn)壞死組織的排泄[16]。肖青青等[17]認(rèn)為降低糖尿病足潰瘍面miRNA水平，會引起潰瘍的過度炎性反應(yīng)發(fā)生，降低創(chuàng)面修復(fù)能力。

miRNA是在近些年來生物分子中探知的真核內(nèi)源性RNA，是一類含有18～24 bp的非編碼單鏈分子，主要發(fā)揮調(diào)控功能[18]。miRNA裝載入RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RNA Induced Silencing Complex，RISC）的單鏈miRNA經(jīng)過自體局部互補(bǔ)（多和miRNA第2～8的Seed Sequence互補(bǔ)）和識別的靶分子miRNA，提高靶分子翻譯能力和穩(wěn)定能力，在很大程度上降低基因表達(dá)能力[19]。miRNA-146種類分為2種，分別是miRNA-146a（5號染色體），miRNA-146b（10號染色體），其作用基本相同，目前主要研究miRNA-146a[20]。李鴻飛[21]在體內(nèi)敲掉老鼠的miRNA-146a，引起血管組織完全破裂，血管內(nèi)皮細(xì)胞分化、參與血運(yùn)的能力下降，甚至發(fā)生嚴(yán)重壞死，說明miRNA-146a的表達(dá)調(diào)節(jié)了內(nèi)皮細(xì)胞增殖，遷移及參與血形成的能力。而Bhaumik等[22]研究表明，白細(xì)胞介素、脂多糖、腫瘤壞死因子等炎性反應(yīng)遞質(zhì)等通過核因子-κB依賴途徑上調(diào)miRNA表達(dá)，促進(jìn)血管平滑肌增殖。Toll樣受體（Toll-like Receptor，TLR）是新發(fā)現(xiàn)的一類天然免疫受體，對先天性免疫和獲得性免疫有積極影響。Taganov等[23]發(fā)現(xiàn)TLRs能夠誘導(dǎo)miRNA的表達(dá)，而TLR4是所有TLRs中唯一能夠經(jīng)分子傳遞信號的受體。而NOD樣受體與TLRs相似，是一種新型功能胞質(zhì)型固有免疫模式識別受體（PRR），最有代表性的是NODl和NOD2[24]。Franchi等[25]用NODl特異性配體刺激誘導(dǎo)的離體人脂肪細(xì)胞誘核因子-κB p65的核轉(zhuǎn)導(dǎo)，炎性反應(yīng)遞質(zhì)的產(chǎn)生顯著增加。

本實(shí)驗(yàn)中，干細(xì)胞組miRNA-146a、TLR4 miRNA、核因子-κB miRNA表達(dá)量比對照組顯著增大，推測miRNA-146a是通過TLR4/核因子-κB信號通路發(fā)揮作用的。TLR4通路的激活導(dǎo)致miRNA-146a表達(dá)，上調(diào)的miRNA-146a又可以活化TLR4信號通路中核因子-κB上游的2個(gè)靶基因IRAKl和TRAF6，發(fā)揮對TLR信號通路的負(fù)性調(diào)控作用，減少炎性反應(yīng)的過度發(fā)生，促進(jìn)骨髓干細(xì)胞增殖，改善微循環(huán)，加速創(chuàng)面愈合。NODl miRNA表達(dá)的增加可能是NODl miRNA刺激產(chǎn)生炎性反應(yīng)遞質(zhì)，炎性遞質(zhì)經(jīng)核因子-κB通路上調(diào)miRNA-146a，在TLR4通路的負(fù)調(diào)節(jié)下，改善創(chuàng)面的炎性反應(yīng)。

藥理研究表明，黃芪能促進(jìn)小鼠外周血造血干細(xì)胞移植術(shù)后早期白細(xì)胞的重建[26]。而陳媛媛等[27]證實(shí)三七花總皂苷在吸收炎性物質(zhì)、肉芽新生以及表皮形成等方面效用顯著。程龍等[28]表明三七總皂苷能加速大腦合成分泌堿性成纖維細(xì)胞生長因子，誘導(dǎo)側(cè)腦室外側(cè)壁神經(jīng)干細(xì)胞的分化生長。但三七、黃芪總皂苷較骨髓干細(xì)胞移植，為何更能促進(jìn)糖尿病潰瘍，其作用機(jī)制需要進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)

[1]Boulton AJ.The diabetic foot：a global view[J].Diabetes Metab Res Rev，2000，16（1）：S2-5.

[2]Apelqvist J，Larsson J.What is the most effective way to reduce incidence of amputation in the diabetic foot？[J].Diabetes Metab Res Rev，2000，16（1）：S75-83.

[3]中華中醫(yī)藥學(xué)會糖尿病分會.糖尿病足中醫(yī)診療標(biāo)準(zhǔn)[J].世界中西醫(yī)結(jié)合雜志，2011，6（7）：618-625.

[4]王月，王濤，吳建霞，等.金芪降糖片組分體外抗糖尿病的作用及機(jī)制[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2015，21（16）：105-109.

[5]孫文，馮麗園，趙宗江，等.三七總皂苷干預(yù)糖尿病腎病大鼠氧化應(yīng)激及足細(xì)胞凋亡機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究[J].中華中醫(yī)藥雜志，2011，26（5）：1062-1067.

[6]Kirana S，Stratmann B，Lammers D，et al.Wound therapy with autologous bone marrow stem cells in diabetic patients with ischaemia-induced tissue ulcers affecting the lower limbs[J].Int J Clin Pract，2007，61（4）：690-692.

[7]萬江波，蔡黔，劉毅.小腿肌肉移植骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療大鼠糖尿病足潰瘍的療效觀察[J].南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，32（12）：1730-1736.

[8]Li M，Marin-Muller C，Bharadwaj U，et al.MicroRNAs：Control and Loss of Control in Human Physiology and Disease[J].World J Surg，2009，33（4）：667-684.

[9]張曉艷，劉明明，李炳蔚，等.觀察鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的BALB/c糖尿病小鼠睪丸微循環(huán)損害[J].微循環(huán)學(xué)雜志，2015，25（3）：1-4，91.

[10]劉寬芝，李靜波，呂海莉，等.黃芪、三七總皂苷對2型糖尿病大血管病變患者M(jìn)MP-9的影響[J].中國中藥雜志，2004，29（3）：264-266.

[11]Jia G，Cheng G，Agrawal DK.Differential effects of insulin-like growth factor-1 and atheroma-associated cytokines on cell proliferation and apoptosis in plaque smooth muscle cells of symptomatic and asymptomatic patients with carotid stenosis[J].Immunol Cell Biol，2006，84（5）：422-429.

[12]李志營，步星耀，張圣旭，等.自體骨髓干細(xì)胞動(dòng)員移植與手術(shù)移植治療脊髓損傷的比較[J].中國組織工程研究與臨床康復(fù)，2009，13（45）：8911-8916.

[13]秦瑞君.黃芪注射液聯(lián)合硫辛酸注射液治療糖尿病足的效果[J].中藥藥理與臨床，2017，33（2）：215-218.

[14]李明初，廖長琦，楊曉平.血塞通注射液聯(lián)合阿托伐他汀鈣治療糖尿病合并腦梗死療效及對患者神經(jīng)功能的影響[J].中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2015，25（31）：49-52.

[15]Zhu B，Jiang RY，Yang C，et al.Adenosine monophosphate-activated protein kinase activation mediates the leptin-induced attenuation of cognitive impairment in a streptozotocin-induced rat model[J].Exp Ther Med，2015，9（5）：1998-2002.

[16]萬江波，蔡黔，劉毅.小腿肌肉移植骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療大鼠糖尿病足潰瘍的療效觀察[J].南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，32（12）：1730-1736.

[17]肖青青，王一飛，李欣，等.糖尿病皮膚潰瘍創(chuàng)面修復(fù)機(jī)制的研究進(jìn)展[J].中國中西醫(yī)結(jié)合皮膚性病學(xué)雜志，2014，13（2）：133-136.

[18]Ramirez HA，Liang L，Pastar I，et al.Comparative Genomic，MicroRNA，and Tissue Analyses Reveal Subtle Differences between Non-Diabetic and Diabetic Foot Skin[J].PLoS One，2015，10（8）：e0137133.

[19]王歡，唐學(xué)章，丁海濤，等.桂皮醛對miRNA-146a干擾的骨關(guān)節(jié)炎滑膜炎性反應(yīng)影響的實(shí)驗(yàn)研究[J].世界中醫(yī)藥，2017，12（10）：2408-2413.

[20]Xie YF，Shu R，Jiang SY，et al.MicroRNA-146 inhibits pro-inflammatory cytokine secretion through IL-1 receptor-associated kinase 1 in human gingival fibroblasts[J].J Inflamm（Lond），2013，10（1）：20.

[21]李鴻飛.miRNA-126與大鼠DVT血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的相關(guān)性研究[D].昆明：昆明醫(yī)科大學(xué)，2015.

[22]Bhaumik D，Scott GK，Schokrpur S，et al.Expression of microRNA-146 suppresses NF-kappaB activity with reduction of metastatic potential in breast cancer cells[J].Oncogene，2008，27（42）：5643-5647.

[23]Taganov KD，Boldin MP，Chang KJ，et al.NF-kappaB-dependent induction of microRNA miR-146，an inhibitor targeted to signaling proteins of innate immune responses[J].Proc Natl Acad Sci U S A，2006，103（33）：12481-12486.

[24]Chen G，Shaw MH，Kim YG，et al.NOD-like receptors：role in innate immunity and inflammatory disease[J].Annu Rev Pathol，2009，4：365-398.

[25]Franchi L，Warner N，Viani K，et al.Function of Nod-like receptors in microbial recognition and host defense[J].Immunol Rev，2009，227（1）：106-128.

[26]劉曉，武正炎，范萍.黃芪與粒細(xì)胞-集落刺激因子對外周血干細(xì)胞移植術(shù)后早期造血功能重建影響的觀察[J].南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2000，20（4）：281-284.

[27]陳媛媛，潘慧婕，曾臣紅，等三七花總皂苷水凝膠促進(jìn)大鼠急性皮膚創(chuàng)傷愈合作用研究[J].上海中醫(yī)藥雜志，2016，50（9）：72-76，84.

[28]程龍，朱培純，司銀楚，等.三七總皂甙對去大腦皮層血管后成年大鼠前腦側(cè)腦室室管膜下層Nestin和bFGF表達(dá)的作用[J].北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，26（3）：18-20.

（2019-07-22收稿?責(zé)任編輯：楊覺雄）