扶正化瘀方體外給藥方法及生物活性差異的探討

薛靜波 陶艷艷 劉成海

摘要?目的：建立扶正化瘀方體外給藥方法，觀察不同批次間藥效差異，為中藥復(fù)方生物活性的質(zhì)控奠定基礎(chǔ)。方法：選擇人肝細(xì)胞L-02、小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7和小鼠原代骨髓來源巨噬細(xì)胞（Bone Marrow-derived Macrophage，BMDM），分別建立肝細(xì)胞過氧化損傷模型和巨噬細(xì)胞活化模型，首先通過考察溶媒、作用濃度等因素對(duì)細(xì)胞效應(yīng)的影響，基于扶正化瘀體外給藥的最佳保肝抗炎效果，建立扶正化瘀浸膏體外配置給藥方法;再比較不同批次的扶正化瘀浸膏對(duì)肝細(xì)胞損傷和巨噬細(xì)胞活化藥效差異。結(jié)果：扶正化瘀浸膏以二甲基亞楓溶解不過濾，不同批次扶正化瘀的化學(xué)指標(biāo)成分不同，但在細(xì)胞生物活性總體無顯著性差異，其中批號(hào)171005與其他批次的部分生物活性略有不同。結(jié)論：確立了扶正化瘀方體外給藥方法，發(fā)現(xiàn)其化學(xué)成分質(zhì)控與細(xì)胞生物活性不一致。

關(guān)鍵詞?中藥質(zhì)量控制;生物活性;扶正化瘀方;抗肝纖維化;體外給藥

Abstract?Objective：To establish in-vitro administration method for Fuzheng Huayu（FZHY） and further to observe the medicinal effect differences of different batches， which will be fundermental for establishment of Traditional Chinese Medicine（TCM） bioactivity-based quality control. Methods：Human hepatocyte cell L-02， mouse leukemia cell of monocyte macrophage Raw264.7， mouse bone marrow-derived macrophage （BMDM） were selected to establish hepatocyte peroxidation injury model and macrophage activation model. Firstly， by investigating the influence of factors such as solvent， concentration and other factors on cellular effects， based on the best hepatoprotective and anti-inflammatory effects of Fuzheng Huayu in vitro medicine， an in vitro drug delivery method for Fuzheng Huayu extract was established; the effect of Fuzheng Huayu extract on liver cell damage and macrophage activation was different. Results：Fuzheng Huayu extract was dissolved in dimethyl sulfoxide and was not filtered. The chemical index components of different batches of Fuzheng Huayu are different， but there is no significant difference in overall cell biological activity. Among them， the biological activity of batch number 171005 was slightly less than that of other batches and was a little different. Conclusion：Hereby， standard in-vitro FZHY administration method was established. We found chemical component-based quality control is not consisted with its cellular bioactivity.

Keywords?Traditional Chinese medicine quality control; Bioactivity; Fuzheng Huayu Formula; Anti hepatic fibrosis; In-vitro administration medicine

中圖分類號(hào)：R285.5;R283文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.19.002

中藥質(zhì)量可控是保證中藥安全有效的重要基礎(chǔ)。目前最常用最重要的中藥質(zhì)控方法基于化學(xué)成分分析。雖然其對(duì)于保障中藥質(zhì)量、提高中藥穩(wěn)定性發(fā)揮了重要作用，但仍存在一定局限性。一方面，中藥制劑的效應(yīng)成分不夠明確，經(jīng)常選用的含量高、容易檢測(cè)的成分進(jìn)行檢測(cè)，但這些指標(biāo)性成分不一定是藥效成分;另一方面，許多適應(yīng)證不同的中藥采用相同的含量測(cè)定指標(biāo)，難以真正反映中藥制劑的質(zhì)量。尤其對(duì)于復(fù)方中成藥，由于其含有多種活性成分且具有多種藥理作用，僅僅控制少數(shù)化學(xué)成分并不能完全控制其質(zhì)量并反映臨床療效[1]。不同批次復(fù)方中藥間的藥效差異也不能完全由化學(xué)質(zhì)控成分差異來解釋。因此建立標(biāo)準(zhǔn)化的中藥配置給藥方法，然后探索基于生物活性評(píng)價(jià)的敏感可重復(fù)的質(zhì)量控制新方法，迫在眉睫[2-3]。本文聚焦抗肝纖維化中藥扶正化瘀片，它具有良好的臨床效果及多靶點(diǎn)效應(yīng)[4-6]，在此我們選擇其保護(hù)肝細(xì)胞過氧化損傷與凋亡[7-10]以及對(duì)巨噬細(xì)胞的消炎作用[11-12]，想基于其細(xì)胞生物活性確定體外標(biāo)準(zhǔn)給藥法。

1?材料與方法

1.1?材料

1.1.1?動(dòng)物?C57BL/6小鼠，雄性，SPF級(jí)，采購至北京維通利華實(shí)驗(yàn)技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK（京）2016-0006，飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，溫度18～22 ℃，濕度55%～65%，以12 h/12 h為光暗周期飼養(yǎng)，動(dòng)物均自由飲食，倫理編號(hào)為PZSHUTCM200814020。人肝細(xì)胞（L-02），小鼠單核巨噬細(xì)胞（RAW264.7），小鼠成纖維細(xì)胞（L929）均購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所;小鼠骨髓來源原代巨噬細(xì)胞（BMDM）分離自C57BL/6小鼠，詳見方法。

1.1.2?藥物?5批次扶正化瘀浸膏粉，均來自上海黃海制藥，批號(hào)分別為180206、180207、180208、181118和171005，各批次成分質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)如下。見表1。

1.1.3?試劑與儀器?Dulbecco′s modification of Eagle′s Medium（DMEM）高糖培養(yǎng)基（貨號(hào)：12800017）;1640培養(yǎng)基（貨號(hào)：31800022）;Endothelial Cell Medium（MEM）培養(yǎng)基（貨號(hào)：11090-081）;Glutamax（貨號(hào)：35050061），Sodium Pyruvate（貨號(hào)：11360070），Non-essential Amino Acids（貨號(hào)：11140050），以上均購于Invitrogen公司，美國。馬血清（Gibco公司，美國，貨號(hào)：26050-070）。LDH試劑盒（貨號(hào)：A020-1-2）;ALT試劑盒（貨號(hào)：A009-1-1）;AST試劑盒（貨號(hào)：A010-1-1），以上均購于南京建成生物工程研究所。Cell Counting Kit-8（CCK8）試劑盒（MCE公司，美國，貨號(hào)：HY-K0301）;JC-1熒光探針（Invitrogen公司，美國，貨號(hào)：T3168）;離心機(jī)（Thermo公司，美國，型號(hào)：Biofuge Primo R）;微孔板分光光度計(jì)（Bio-Tek公司，美國，型號(hào)：Bio-Tek PowerWave XS）;電子天平（Sartorius公司，德國，型號(hào)：BSA224S-CW）;倒置顯微鏡（Olympus公司，日本，型號(hào)：IX70）。

1.2方法

1.2.1?分組與模型制備

1.2.1.1?肝細(xì)胞過氧化損傷模型?將L-02細(xì)胞以10 000個(gè)/孔接種于96孔板，培養(yǎng)24 h，無血清饑餓6 h后，予0.5 mmol/L H2O2刺激0.5 h誘導(dǎo)肝細(xì)胞損傷模型。

1.2.1.2?巨噬細(xì)胞LPS促炎模型?將RAW264.7細(xì)胞以5 000個(gè)/孔接種于96孔板，培養(yǎng)24 h，無血清饑餓6 h后，予100 ng/mL LPS持續(xù)刺激24 h，誘導(dǎo)細(xì)胞炎性反應(yīng)模型。

1.2.2?給藥方法

1.2.2.1?扶正化瘀浸膏粉的配置方法?稱取扶正化瘀浸膏粉，分別用DMSO與DMEM震蕩溶解，予40 kHz、37 ℃超聲后，各配制成100 mg/mL的扶正化瘀儲(chǔ)存液。各取一半溶液用0.45 μm PTFE膜過濾，一半不予過濾。最終配置成4組儲(chǔ)存液，分別是DMSO溶液、DMSO過濾溶液、DMEM溶液和DMEM過濾溶液。各儲(chǔ)存液分裝置于-20 ℃冰箱保存。

1.2.2.2?BMDM細(xì)胞分離?取8～10周齡小鼠股骨和脛骨，用1 mL針管吸取ECM培養(yǎng)基沖洗骨髓，500×g 4 ℃離心5 min，吸棄上清，加入2 mL紅細(xì)胞裂解液裂解2 min，再加入8 mL含血清培養(yǎng)基后500×g 4 ℃離心5 min，70 μm濾網(wǎng)過濾后，加入含20% L929上清液和10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)4 d后換液，然后繼續(xù)培養(yǎng)至7 d待用。

1.2.2.4?細(xì)胞培養(yǎng)?Raw264.7細(xì)胞培養(yǎng)于含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基;L-02細(xì)胞培養(yǎng)于含10%FBS的1640培養(yǎng)基;L929細(xì)胞培養(yǎng)于含10%馬血清，1%Glutamax，1% Sodium Pyruvate與1% Non-essential Amino Acids的MEM培養(yǎng)基。BMDM細(xì)胞培養(yǎng)于含20% L929細(xì)胞上清液，10%FBS的DMEM培養(yǎng)基。所有細(xì)胞均置于37 ℃、5% CO2、95%濕度的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞長至亞單層后用于實(shí)驗(yàn)。將各細(xì)胞以適宜的濃度接種于96孔板中，培養(yǎng)于相應(yīng)的培養(yǎng)基中。

1.2.3?檢測(cè)指標(biāo)與方法

1.2.3.1?pH值測(cè)定?用pH計(jì)對(duì)4組扶正化瘀溶液進(jìn)行pH值的測(cè)定，并用零度滲透壓測(cè)試儀對(duì)其進(jìn)行滲透壓的測(cè)定。

1.2.3.2?采用LC-MS方法檢測(cè)扶正化瘀DMEM和DMSO溶液的主要成分?選用甲醇作為標(biāo)準(zhǔn)溶劑對(duì)照。稱取0.75 mg扶正化瘀浸膏粉，加入甲醇震蕩超聲后定溶到25 mL后，配置成濃度為50 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照溶液。吸取4 μL扶正化瘀DMSO及DMEM 100 mg/mL儲(chǔ)存溶液，分別加入20 mL乙腈稀釋，配置成濃度為20 μg/mL樣品溶液。吸取對(duì)照品溶液10 mL，樣品溶液20 mL注入液相色譜儀進(jìn)行梯度洗脫，得到總離子流色譜圖，分別計(jì)算各峰對(duì)應(yīng)總峰面積的相對(duì)百分含量，以對(duì)照品的峰面積為標(biāo)準(zhǔn)，分別計(jì)算各組分的含量。

1.2.3.3?細(xì)胞增殖與毒性?將L-02和RAW264.7細(xì)胞分別以5 000個(gè)/孔和10 000個(gè)/孔接種于96孔板，培養(yǎng)24 h。無血清饑餓6 h后，分別加入濃度為50、100、200、400、800 μg/mL的扶正化瘀不同溶劑過濾各組工作液，每個(gè)濃度均設(shè)4個(gè)復(fù)孔，設(shè)正常對(duì)照組，細(xì)胞與藥物連續(xù)共孵育，以20、24和48 h為動(dòng)態(tài)觀察點(diǎn)，吸棄上清，按照CCK8原液：培養(yǎng)基=1∶10的比例混合，100 μL/孔，在37 ℃孵育2 h，讀取A450值，檢測(cè)細(xì)胞活力，觀察最大無毒濃度。

1.2.3.4?肝細(xì)胞過氧化損傷模型生化測(cè)定以及線粒體膜電位測(cè)定?將L-02誘導(dǎo)肝細(xì)胞損傷模型后（詳見1.2.1.1），與25、50、100、200 μg/mL扶正化瘀各組工作液孵育18 h，每個(gè)濃度均設(shè)4個(gè)復(fù)孔。設(shè)正常對(duì)照組，模型組，不同濃度扶正化瘀組。CCK8試劑盒檢測(cè)細(xì)胞活力;留取細(xì)胞上清，用生化試劑盒分別檢測(cè)上清中的ALT、AST和LDH含量。另用無血清培養(yǎng)基清洗細(xì)胞2次，加入2.5 μg/mL工作濃度的JC-1，在37 ℃孵育30 min，PBS洗滌3次，5 min/次，熒光顯微鏡下529 nm和590 nm波長進(jìn)行觀察。

1.2.3.5?巨噬細(xì)胞促炎模型一氧化氮NO、腫瘤壞死因子TNF-α含量測(cè)定?將RAW264.7細(xì)胞以LPS誘導(dǎo)炎性反應(yīng)模型（詳見1.2.1.2），并同時(shí)給予扶正化瘀工作液連續(xù)孵育24 h，每個(gè)濃度均設(shè)4個(gè)復(fù)孔。CCK8試劑盒檢測(cè)細(xì)胞活力;留取細(xì)胞上清。按1∶1配置1%磺胺與0.1%N-1-萘基乙二胺鹽酸混合液，再與細(xì)胞上清1∶1混合，根據(jù)NaNO2標(biāo)準(zhǔn)曲線，在540 nm波長下測(cè)定吸光度來確定一氧化氮含量。將BMDM細(xì)胞以30 000個(gè)/孔接種于96孔板，培養(yǎng)24 h，予100 ng/mL LPS持續(xù)刺激24 h，誘導(dǎo)細(xì)胞炎性反應(yīng)模型。同時(shí)給予扶正化瘀工作液連續(xù)孵育24 h，每個(gè)濃度均設(shè)4個(gè)復(fù)孔。CCK8試劑盒檢測(cè)細(xì)胞存活率;留取細(xì)胞上清，ELISA試劑盒測(cè)定細(xì)胞上清TNF-α含量。96孔板中一抗200 μL 4 ℃孵育過夜，去掉上清后用>250 μL PBS-T溶液洗滌3次，加入封閉液室溫孵育1 h后用PBS-T溶液洗滌1次。分別加入100 μL細(xì)胞上清及標(biāo)準(zhǔn)品，4 ℃孵育過夜。次日用PBS-T溶液洗滌3～5次后，加入100 μL二抗室溫孵育1 h。PBS-T溶液洗滌3～5次后，加入100 μL Avidin-HRP予室溫孵育30 min，再次用PBS-T溶液洗滌5～7次，加入100 μLTMB顯色試劑予室溫孵育15 min，最后加入50 μL終止液，讀取A540值。

1.3?統(tǒng)計(jì)學(xué)方法?采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，GraphPad Prism 6.0軟件作圖。計(jì)量資料以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，組間差別采用單因素方差分析，2組間比較采用Turkey檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2?結(jié)果

2.1?基于扶正化瘀浸膏粉不同配置方法的物理、化學(xué)性質(zhì)?扶正化瘀浸膏粉以不同溶劑（DMSO、DMEM）、再選擇過濾不過濾，比較各組在理化性質(zhì)方面的差異。實(shí)驗(yàn)可見，4組溶液均溶解差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，并且物理性質(zhì)pH值、滲透壓上沒有顯著區(qū)別。見表2。但是DMEM與DMSO溶液的某些組分含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，譬如腺嘌呤、尿苷、原兒茶醛、五味子酯甲、丹參酮IIA、五味子乙素、五味子丙素和五味子醇乙。見表3。

2.2?基于扶正化瘀浸膏粉不同配置方法的生物活性?在L-02、RAW264.7、BMDM細(xì)胞中，各扶正化瘀溶液組的細(xì)胞毒性均沒有明顯差異，在400、800 μg/mL高濃度時(shí)，對(duì)細(xì)胞可能具有潛在毒性。見圖1。同樣，在L-02細(xì)胞過氧化損傷模型、RAW264.7和BMDM細(xì)胞LPS炎性反應(yīng)模型中，各扶正化瘀溶液組的生物活性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖2。由于上述各組在物理、化學(xué)、生物活性上差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而DMSO溶液比DMEM溶液更穩(wěn)定，而且細(xì)菌在DMSO內(nèi)無法存活，更適合長久保存，我們最終選取扶正化瘀浸膏粉DMSO溶液不過濾作為標(biāo)準(zhǔn)配置方法，儲(chǔ)存液濃度為100 mg/mL，分裝置于-20 ℃冰箱中保存。

2.3?扶正化瘀標(biāo)準(zhǔn)體外給藥法在肝細(xì)胞及巨噬細(xì)胞中的藥效?將-20 ℃保存的100 mg/mL扶正化瘀儲(chǔ)存液置于室溫解凍，配置成工作濃度。實(shí)驗(yàn)可見，在RAW264.7細(xì)胞LPS模型中，扶正化瘀能顯著降低一氧化氮（NO）的產(chǎn)生，并促進(jìn)細(xì)胞增殖。見圖3。同樣在BMDM細(xì)胞LPS模型中，扶正化瘀能明顯減少細(xì)胞腫瘤壞死因子（TNF-α）的表達(dá)，且呈劑量依賴關(guān)系。見圖3。在的L-02細(xì)胞過氧化損傷模型中，扶正化瘀不但能恢復(fù)損傷肝細(xì)胞的數(shù)量，并能顯著降低細(xì)胞上清中ALT、AST與LDH的含量，呈劑量依賴關(guān)系。見圖4。同時(shí)熒光可見，不同濃度的扶正化瘀也能劑量依賴地提高肝細(xì)胞的線粒體膜電位。見圖5。

2.4?不同批次的扶正化瘀浸膏粉在肝細(xì)胞及巨噬細(xì)胞中的藥效?將不同批次的-20 ℃保存的100 mg/mL扶正化瘀儲(chǔ)存液（批號(hào)分別為180206、180207、180208、181118和171005）置于室溫解凍，配置成工作濃度。根據(jù)廠方質(zhì)量控制數(shù)據(jù)可見，雖然5批次扶正化瘀浸膏粉在廠家質(zhì)控的3個(gè)標(biāo)志物的含量有所差異，但對(duì)肝細(xì)胞過氧化損傷均能產(chǎn)生保護(hù)作用，并均能降低細(xì)胞上清中ALT和AST的含量，不同批次間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖6。在小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7與小鼠原代骨髓來源巨噬細(xì)胞BMDM中，各批次扶正化瘀均能明顯降低LPS模型中TNF-α與的NO的表達(dá)，各批次間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖7、圖8。然而在BMDM與浸膏粉單獨(dú)孵育時(shí)，比較其他批次，批次171005浸膏粉對(duì)TNF-α的表達(dá)的影響較弱。見圖8。由以上結(jié)果可見，扶正化瘀的化學(xué)成分質(zhì)控并不能與其細(xì)胞藥效直接相關(guān)，因此建立以生物活性為基礎(chǔ)的復(fù)方中藥質(zhì)量控制體系作為傳統(tǒng)化學(xué)質(zhì)控的補(bǔ)充是大勢(shì)所趨。

3?討論

扶正化瘀方由六味中藥組成，臨床效果好，復(fù)方中成藥成分復(fù)雜，機(jī)制多樣[13-15]。在本實(shí)驗(yàn)中比較了扶正化瘀浸膏粉在不同溶媒、不同過濾條件下，物理、化學(xué)、生物性質(zhì)的差異，發(fā)現(xiàn)扶正化瘀在水中溶解度很差，在DMSO及DMEM，有無過濾組中，pH值、滲透壓、主要成分含量、細(xì)胞毒性以及細(xì)胞藥效上沒有顯著卻別。因而從中選擇了最穩(wěn)定的配置方法，即用DMSO溶解不過濾，基本確立可行、穩(wěn)定的扶正化瘀浸膏粉配置方法。然后在肝細(xì)胞及巨噬細(xì)胞中確認(rèn)了藥效，確立了標(biāo)準(zhǔn)的體外給藥方法。然而在不同批次的扶正化瘀浸膏粉之間，雖然在化學(xué)指標(biāo)性成分上有所差異，但是總體在細(xì)胞藥效上差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此僅僅依賴化學(xué)成分檢測(cè)作為中藥質(zhì)量控制是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的，后續(xù)批次間產(chǎn)生差異的各靶標(biāo)基因?qū)⒈恢攸c(diǎn)關(guān)注，并以此建立以生物活性為基礎(chǔ)的質(zhì)控新方法。

另外，肝星狀細(xì)胞的活化與肝竇內(nèi)皮細(xì)胞的血管增生也是扶正化瘀抗肝纖維化的機(jī)制[16-18]。后期將會(huì)針對(duì)扶正化瘀在肝星狀細(xì)胞及肝竇內(nèi)皮細(xì)胞上進(jìn)行藥效評(píng)估，與肝細(xì)胞、肝巨噬細(xì)胞一起找出各細(xì)胞上最敏感、穩(wěn)定的藥效靶點(diǎn)，然后構(gòu)建含有靶點(diǎn)的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株來進(jìn)行藥效評(píng)估，并予動(dòng)物模型中進(jìn)行驗(yàn)證，從而成功建立扶正化瘀的生物活性質(zhì)量控制體系。

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（2020-09-10收稿?責(zé)任編輯：王明）