新型嗜熱耐堿脂肪酶的純化表征及應(yīng)用

張昕怡，許蕊，王鈺棋，張瑜，王飛，李迅

（1 南京林業(yè)大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院，江蘇南京210037； 2 江蘇省生物質(zhì)綠色燃料與化學(xué)品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京210037）

引 言

生物催化劑因其環(huán)保、高效和特異性等特點(diǎn)而廣泛應(yīng)用于各工業(yè)領(lǐng)域[1]。脂肪酶(EC 3.1.1.3)是自然界中最具潛力的工業(yè)酶之一，能催化水解、酯化、酯交換等反應(yīng)，在食品營(yíng)養(yǎng)、油脂化學(xué)工業(yè)等方面有較好應(yīng)用[2]。工業(yè)用脂肪酶主要來源于酵母和細(xì)菌[3-4]，最適溫度和pH 范圍多為35～45℃和6.5～8.0[5]，適應(yīng)中低溫和偏中性的應(yīng)用環(huán)境。目前，中低溫脂肪酶在工業(yè)應(yīng)用中存在一些普遍問題，如高溫或堿性等條件下易失活等，這在一定程度上限制了脂肪酶的工業(yè)應(yīng)用。在此背景下，人們逐漸關(guān)注來自于極端微生物的極端脂肪酶資源的挖掘，如嗜熱脂肪酶、堿性脂肪酶、低溫脂肪酶及綜合多極端脂肪酶等[6-7]，以達(dá)到工業(yè)應(yīng)用要求。其中，嗜熱脂肪酶多從嗜熱菌中分離得到，具有催化效率高、冷卻能耗低、改善底物可溶性等優(yōu)點(diǎn)，且在應(yīng)用時(shí)較中低溫酶更穩(wěn)定[8]。耐堿脂肪酶則多從土壤、鹽堿湖的耐堿菌中分離得到，常用于洗滌清潔工業(yè)[9]。目前報(bào)道的嗜熱耐堿脂肪酶多來源于芽孢桿菌，其適宜溫度在40～60℃之間，最適pH在7.0～9.0之間[9]。

生物柴油是甘油三酯與醇進(jìn)行酯交換反應(yīng)獲得的脂肪酸烷基酯，是經(jīng)濟(jì)無毒的石油代用品[10]。與傳統(tǒng)的酸堿催化相比，酶法制備生物柴油具有環(huán)境友好、條件溫和、易分離等優(yōu)勢(shì)[11]。然而，目前工業(yè)用脂肪酶多在30～50℃條件下應(yīng)用，催化時(shí)間長(zhǎng)且易失活。堿性高溫條件能促進(jìn)疏水反應(yīng)底物的溶解和加快反應(yīng)速率，若脂肪酶能適應(yīng)堿性高溫的條件，將具有更廣的應(yīng)用前景。近來，已有研究人員使用嗜熱耐堿脂肪酶生產(chǎn)生物柴油，Christopher等[12]利用游離嗜熱耐堿脂肪酶催化廢餐飲油，在65℃下反應(yīng)48 h，收率為76%，Sivaramakrishnan 等[13]把嗜熱耐堿脂肪酶用于叔丁醇體系，在55℃下催化微藻油40 h，收率可達(dá)76%。據(jù)此，已報(bào)道的極端酶都未能滿足生物柴油行業(yè)的需求，主要體現(xiàn)在催化時(shí)間長(zhǎng)、收率低等。因而加大對(duì)脂肪酶資源的挖掘顯得更加迫切，尋找新的嗜熱耐堿脂肪酶對(duì)酶法高收率制備生物柴油具有重要意義。

本研究將在大腸桿菌中克隆表達(dá)來源于肯尼亞堿性溫泉中的解脂嗜熱互營(yíng)桿菌(Thermosyntropha lipolytica)中的脂肪酶(TlLipA)，對(duì)其純化和酶學(xué)性質(zhì)表征，并將TlLipA 初步應(yīng)用于生物柴油的制備，為該酶后續(xù)的基因改造和應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1 材料和儀器

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料 大腸桿菌Top10 和BL21(DE3)菌株由本實(shí)驗(yàn)室保存。引物由上海生工有限公司合成。Taq DNA 聚合酶、限制性內(nèi)切酶和T4 DNA Ligase 購(gòu)于Takara 生物技術(shù)公司。胰化蛋白胨、酵母提取物等購(gòu)于Oxoid(Hampshire,England)公司，常用生物試劑卡那霉素、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)購(gòu)于BIOFROXX(廣州，賽國(guó)生物科技有限公司)。系列底物對(duì)硝基苯酯(p-NP) 和系列脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品(色譜級(jí))都購(gòu)于Sigma 公司。月桂醇醚磷酸酯(AEO-7)、十二烷基硫酸鈉(SDS)、月桂酸鈉(LAS)、吐溫80(Tween 80)、聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)、乙二胺四乙酸(EDTA)、苯甲基磺酰氟(PMSF)、Tris(三羥甲基氨基甲烷)、磷酸二氫鈉、甘氨酸、氫氧化鈉等購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，以上試劑未經(jīng)特殊指明均為分析純?cè)噭?。大豆油?gòu)自益海糧油工業(yè)有限公司(泰州，中國(guó))。親和層析柱(HisTrapTMHP柱)購(gòu)于美國(guó)Novagen公司。

1.1.2 主要儀器 低溫液相層析柜、酶標(biāo)儀，德國(guó)Thermo公司；PCR 儀、全自動(dòng)凝膠成像儀，美國(guó)Bio-Rad 公司；氣相色譜儀，美國(guó)Aglilent 公司；離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf 公司；高速冷凍離心機(jī)，美國(guó)Beckman 公司；超凈工作臺(tái)，蘇州安泰技術(shù)有限公司；恒溫培養(yǎng)振蕩器，上海知楚有限公司。

1.2 重組質(zhì)粒pET28a-TLL1的構(gòu)建

根據(jù)大腸桿菌優(yōu)勢(shì)密碼子，對(duì)獲得的TlLipA氨基酸序列(Genbank No.SHG68904.1)進(jìn)行密碼子優(yōu)化，優(yōu)化的TlLipA 基因序列由上海捷瑞生物工程有限公司通過全基因合成。分別以Nco I 和EcoR I 對(duì)TlLipA 基因(tll1)及pET28a 進(jìn)行雙酶切反應(yīng)，酶切后將質(zhì)粒pET28a 和tll1 連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Top10 中，經(jīng)驗(yàn)證，獲得正確的重組質(zhì)粒pET28a-TLL1。

1.3 重組脂肪酶TlLipA的表達(dá)純化

LB 培養(yǎng)基按參考文獻(xiàn)配制[14]。將重組質(zhì)粒pET28a-TLL1 熱激轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)細(xì)胞內(nèi)，37℃過夜培養(yǎng)。挑取單菌落接種于含有卡那霉素(50 μg/ml)抗性的LB 液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至OD600nm值達(dá)到0.6～0.8，經(jīng)終濃度為0.5 mmol/L IPTG 在25℃誘導(dǎo)表達(dá)24 h 后，在4℃、8000 g 離心5 min收集菌體細(xì)胞。用5 mmol/L咪唑緩沖液(pH 8.0)重懸細(xì)胞后，超聲波破碎細(xì)胞30 min，離心收集上清液獲得粗酶液。經(jīng)60℃，15 min 熱處理去除非耐熱雜蛋白，離心收集上清液獲得熱處理酶液。

使用HisTrapTMHP 柱親和層析柱純化熱處理酶液，收集洗脫產(chǎn)物并經(jīng)SDS-PAGE電泳驗(yàn)證。

1.4 重組脂肪酶TlLipA的酶活測(cè)定方法

以10 μl 20 mmol/L p-NPP 為底物，加入180 μl 50 mmol/L Tris-HCl 緩沖液(pH 8.0)，在65℃預(yù)熱5 min 后，加入10 μl 純酶液，準(zhǔn)確計(jì)時(shí)反應(yīng)10 min，加入600 μl 1mol/L 的Na2CO3試劑終止反應(yīng)，在410 nm 下測(cè)定吸光值，以釋放的對(duì)硝基苯酚的量計(jì)算酶活力[15]。酶活力單位(U)定義：在pH 8.0、65℃條件下，每分鐘生成1 μmol 對(duì)硝基苯酚所需要的酶量為1 U。酶液的蛋白濃度采用Bradford法測(cè)定[16]。

1.5 重組脂肪酶TlLipA酶學(xué)性質(zhì)的表征方法

最適反應(yīng)溫度的測(cè)定：在45～85℃溫度范圍內(nèi)分別測(cè)定酶活力，以最高酶活力為100%計(jì)；熱穩(wěn)定性的測(cè)定：將酶液于55～70℃分別保溫不同時(shí)間，測(cè)定酶活力，以初始酶活力為100%計(jì)。

最適反應(yīng)pH 的測(cè)定：在pH 4.0～11.0 范圍內(nèi)分別測(cè)定重組脂肪酶TlLipA 的酶活力，以最高酶活力為100%計(jì)；pH 穩(wěn)定性的測(cè)定：將酶液于不同pH 緩沖液中室溫(25℃)放置1 h，測(cè)定酶活力，以初始酶活力為100%計(jì)。

金屬離子和化學(xué)試劑對(duì)酶影響的測(cè)定：在反應(yīng)體系中加入不同的金屬離子及化學(xué)試劑至其終濃度為1 mmol/L，Tween 80 終濃度為0.05%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))，混合保溫1 h 后，測(cè)定酶活力，以加入等量蒸餾水的酶樣品為對(duì)照。

底物特異性的測(cè)定：測(cè)定重組脂肪酶TlLipA 對(duì)不同碳鏈長(zhǎng)度對(duì)硝基苯酯(p-NP)的偏好特性。測(cè)定的底物如下：棕櫚酸對(duì)硝基苯酯(p-NPP，C16)、肉豆蔻酸對(duì)硝基苯酯(p-NPM，C14)、月桂酸對(duì)硝基苯酯(p-NPL，C12)、癸酸對(duì)硝基苯酯(p-NPD，C10)、辛酸對(duì)硝基苯酯(p-NPO，C8)、己酸對(duì)硝基苯酯(p-NPC，C6)、乙酸對(duì)硝基苯酯(p-NPA，C2)。

動(dòng)力學(xué)反應(yīng)參數(shù)的測(cè)定：取不同濃度(0.1～2 mmol/L)的p-NPP 在最適條件下與純化的TlLipA 反應(yīng)，測(cè)定酶活力，用Sigma-Plot 軟件作圖，得出動(dòng)力學(xué)反應(yīng)參數(shù)。以上每組實(shí)驗(yàn)均做三個(gè)平行樣，并計(jì)算三個(gè)平行數(shù)據(jù)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。除測(cè)定最適pH 和最適溫度實(shí)驗(yàn)外，其余實(shí)驗(yàn)均在最適條件pH 8.0、65℃下測(cè)定酶活力。

1.6 重組脂肪酶TlLipA 催化制備生物柴油條件優(yōu)化

在TlLipA 加量為200 U/g 油、55℃、180 r/min 條件下，采取分批加入甲醇(間隔12 h)的方式，測(cè)試不同反應(yīng)溶劑體系(無溶劑、正己烷、DES) 、不同醇油比(3∶1～5∶1)、不同含水率(5%～60%基于油重，下同)條件下的生物柴油收率。

反應(yīng)溶劑體系的優(yōu)化：在體系含水率10%，分別設(shè)置醇油比為3∶1 和4∶1，在無溶劑、正己烷、DES體系中分別進(jìn)行反應(yīng)；醇油比的優(yōu)化：在含水率10%的無溶劑體系中，分批加入甲醇(單次醇油摩爾比1∶1)，間隔12 h 補(bǔ)加，醇油比分別為3∶1、4∶1、5∶1；含水率的優(yōu)化：在無溶劑體系中，保持醇油比4∶1，分別加入5%～60%油重的水，測(cè)試其對(duì)生物柴油收率的影響。DES 的配制∶氯化膽堿∶甘油=1∶2(摩爾比)于80℃水浴攪拌1 h。

1.7 生物柴油的檢測(cè)

內(nèi)標(biāo)法定量生物柴油收率。反應(yīng)結(jié)束后，離心取上層產(chǎn)物，用正己烷稀釋成一定濃度，加入一定濃度的內(nèi)標(biāo)物(十七烷酸甲酯，正己烷配制)，混勻后進(jìn)行氣相色譜(GC，Aglilent 7890A)分析。分析條件為：PEG-20M 極性毛細(xì)管柱，F(xiàn)ID 檢測(cè)器，載氣為高純氮?dú)猓魉贋?0 ml/min。進(jìn)樣量1 μl，分流比50∶1，進(jìn)樣口和檢測(cè)器溫度分別設(shè)為250℃和260℃，初始溫度180℃，保溫2 min，然后以3℃/min 升至240℃，保溫10 min。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1 重組脂肪酶TlLipA 的表達(dá)與純化

重組質(zhì)粒pET28a-TLL1 經(jīng)轉(zhuǎn)化和表達(dá)后獲得粗酶液，粗酶液通過熱處理得到熱處理酶液，再經(jīng)鎳柱親和層析純化獲得純酶。如圖1 列7 所示，鎳柱親和層析洗脫液經(jīng)SDS-PAGE電泳驗(yàn)證在53×103附近有單一條帶，這與目標(biāo)蛋白TlLipA 大小相符。重組脂肪酶TlLipA 純化步驟及提純倍數(shù)見表1，由表可知，粗酶液比酶活為1.99 U/mg；熱處理后TlLipA 比酶活為6.48 U/mg，酶活回收率為72.42%，純化倍數(shù)為3.26倍；通過鎳柱親和層析純化，TlLipA比酶活為22.11 U/mg，酶活回收率為24.39%，純化倍數(shù)為11.11倍。

2.2 重組脂肪酶TlLipA 的酶學(xué)性質(zhì)表征

2.2.1 TlLipA 的最適反應(yīng)溫度和溫度穩(wěn)定性 以p-NPP 為底物，分別在45～85℃下測(cè)定重組脂肪酶TlLipA 的酶活，圖2(a)結(jié)果表明，45～65℃該重組脂肪酶TlLipA 酶活力呈直線上升趨勢(shì)，65℃時(shí)酶活力最高，高于70℃后，隨著溫度的升高酶活呈劇烈下降趨勢(shì)。重組脂肪酶TlLipA 的最適溫度與來自Geobacillus thermodenitrificans AV-5的嗜熱脂肪酶的最適溫度相當(dāng)[12]，但高于來源Thermophilic Anoxybacillus flavithermus HBB 134、Acinetobacter sp.RAG-1的脂肪酶最適溫度[17-18]。

表1 重組脂肪酶TlLipA 的純化Table 1 The purification of recombinant lipase TlLipA

由圖2(b)可得，重組脂肪酶TlLipA 于60℃下保溫120 min 后，酶活力為初始活力的70%；于65℃下保溫1 h 后酶活保持初始酶活的51%；70℃保溫20 min 相對(duì)酶活僅為初始酶活的30%。來源于G.thermodenitrificans AV-5 的脂肪酶穩(wěn)定范圍為50～60℃[12]，重組脂肪酶TlLipA的熱穩(wěn)定性與之相當(dāng)。

2.2.2 TlLipA 的最適pH 和pH 穩(wěn)定性 由圖3 可知，重組脂肪酶TlLipA在pH 8.0(50 mmol/L Tris-HCl緩沖液)酶活力最佳且最穩(wěn)定，圖3(a)表明其適宜的pH 范圍較寬，在pH 7.0～10.0 酶活力維持在最高酶活力的60%以上。為探究重組脂肪酶TlLipA 的pH 穩(wěn)定性，將酶液于不同pH 緩沖液中室溫(25℃)放置1 h，測(cè)定酶活力，以初始酶活力為100%計(jì)。圖3（b）顯示重組脂肪酶TlLipA 的pH 穩(wěn)定范圍寬，在pH 為7.0～11.0 緩沖液中，酶活力保持在80%以上，以上結(jié)果表明重組脂肪酶TlLipA 是一種耐堿脂肪酶。

圖1 重組脂肪酶TlLipA 的SDS-PAGE 分析Fig.1 SDS-PAGE analysis of the recombinant lipase TlLipA

圖2 溫度對(duì)重組脂肪酶TlLipA酶活力的影響Fig.2 Effect of temperature on lipase activity(a)and stability(b)

圖3 pH對(duì)重組脂肪酶TlLipA酶活力的影響Fig.3 Effect of pH on lipase activity(a)and stability(b)

大多數(shù)脂肪酶的pH 為中性到堿性[5]。來自Bacillus coagulans BTS-3、 Geobadllus stearothermophilus strain-5 純化的脂肪酶最適pH 分別為8.5、8.0，穩(wěn)定pH 分別為8.0～10.5、5.0～9.0[19-20]，重組脂肪酶TlLipA 最適pH 與兩種脂肪酶相當(dāng)，且其pH穩(wěn)定范圍(7.0～11.0)更為寬泛。

2.2.3 金屬離子和化學(xué)試劑的影響 由表2 所示，二價(jià)陽離子Mg2+、Mn2+對(duì)重組脂肪酶TlLipA 有輕微的激活作用，其他測(cè)試的金屬離子及化學(xué)試劑對(duì)脂肪酶有一定抑制作用，其中Fe3+和Zn2+，化學(xué)試劑SDS、Tween 80、EDTA、AEO-7 的存在下，酶活力嚴(yán)重下降，僅能保持酶初始活力的2%～20%，表明Fe3+和Zn2+，化學(xué)試劑EDTA、Tween 80、SDS、AEO-7 對(duì)TlLipA 有強(qiáng)烈抑制作用。文獻(xiàn)報(bào)道來源于T.Anoxybacillus flavithermus HBB 134 的脂肪酶也被Fe3+和Zn2+抑制[17]，推測(cè)可能的原因是Fe3+和Zn2+占據(jù)了底物與酶的結(jié)合位點(diǎn)，改變了酶的構(gòu)象，從而抑制了酶的活性[21]；而SDS 作為蛋白變性劑，破壞了酶的空間結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致酶活性降低[22]；較高濃度的非離子型表面活性劑Tween 80、AEO-7，會(huì)進(jìn)入脂肪酶的活性中心并與其緊密結(jié)合，使脂肪酶的活性中心被占據(jù)，而無法催化其他底物，因此脂肪酶的活力受到抑制[23]；EDTA 對(duì)酶有強(qiáng)烈的抑制作用，初步推測(cè)該酶是一種金屬酶。因此在該酶的使用過程中應(yīng)嚴(yán)格控制Fe3+、Zn2+，化學(xué)試劑SDS、EDTA、Tween 80 和AEO-7 的濃度，避免這些金屬離子和化學(xué)試劑對(duì)酶活力造成強(qiáng)烈的抑制。而蛋白酶抑制劑PMSF 對(duì)重組脂肪酶TlLipA 的抑制作用較弱，分析其原因，PMSF 是通過與酶活性中心的絲氨酸反應(yīng)來抑制蛋白酶活性的，雖然在大多數(shù)脂肪酶中，都有絲氨酸殘基存在于酶的活性部位[24]，但脂肪酶有蓋子結(jié)構(gòu)，蓋住了活性部位的入口，因此，部分脂肪酶不受PMSF的抑制或略有抑制[25]。

表2 金屬離子和化學(xué)試劑對(duì)酶活性的影響Table 2 Effects of ions and reagents on the activity of the lipase

2.2.4 底物特異性 使用不同碳鏈長(zhǎng)度脂肪酸對(duì)硝基苯酯表征TlLipA 的底物特異性。研究表明，該酶偏好的碳鏈長(zhǎng)度范圍寬，但對(duì)中等碳鏈長(zhǎng)度的脂肪酸對(duì)硝基苯酯(辛酸對(duì)硝基苯酯，C8)的催化效果最佳(圖4)。重組脂肪酶TlLipA 對(duì)底物乙酸對(duì)硝基苯酯(C2)催化效果較差。來源于Bacillus subtilis 168的脂肪酶對(duì)中長(zhǎng)碳鏈脂肪酸對(duì)硝基苯酯水解效果好[26]，重組脂肪酶TlLipA與之類似。

圖4 重組脂肪酶TlLipA的底物特異性Fig.4 The activities of TlLipA toward substrates with different acyl chain lengths

2.2.5 TlLipA 的動(dòng)力學(xué)參數(shù) 在含有適當(dāng)酶量的反應(yīng)體系中分別加入終濃度0.1～2 mmol/L 的p-NPP，于pH 8.0、65℃條件下反應(yīng)10 min，測(cè)定重組脂肪酶TlLipA 酶活，由Sigma-Plot 軟件擬合得到圖5所示的米氏方程曲線(R2=0.99)，由軟件分析得該酶的米氏常數(shù)Km為0.23 mmol/L，Vmax為33.50 mmol/(L·min)，經(jīng)計(jì)算kcat為22.83 s-1。目前報(bào)道的嗜熱耐堿脂肪酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)如表3 所示，與來源于T.Anoxybacillus flavithermus HBB 134 的脂肪酶相比，TlLipA 的Km較大，但Vmax比其高出26倍[17]。此外，與其他脂肪酶相比，重組脂肪酶TlLipA 與底物p-NPP親和力和反應(yīng)速率都較高，具有明顯優(yōu)勢(shì)。

圖5 重組脂肪酶TlLipA反應(yīng)速率和底物濃度的關(guān)系Fig.5 Relationship of reaction velocity and substrate concentration of lipase

表3 各嗜熱耐堿脂肪酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)比較Table 3 Comparison of kinetic parameters of various thermo-alkaline lipases

2.3 TlLipA催化制備生物柴油

以重組脂肪酶TlLipA 為生物催化劑，催化大豆油制備生物柴油，采用氣相法檢測(cè)，內(nèi)標(biāo)法定量。如圖6所示，十七烷酸甲酯(2)為內(nèi)標(biāo)物，催化產(chǎn)物由棕櫚酸甲酯(1)、硬脂酸甲酯(3)、油酸甲酯(4)、亞油酸甲酯(5)、亞麻酸甲酯(6)組成，結(jié)果與原料大豆油中脂肪酸種類一致，產(chǎn)物中亞油酸甲酯最為豐富，硬脂酸甲酯較少。

圖6 氣相色譜圖Fig.6 Gas chromatography spectrometry of standard sample mixture and reaction production

本文初步優(yōu)化了生物柴油的制備條件。由于制備過程涉及疏水底物的溶解等問題，不同溶劑體系對(duì)生物柴油的制備有著重要影響。本文選用傳統(tǒng)有機(jī)溶劑正己烷體系、綠色廉價(jià)的深度共熔溶劑DES 體系與無溶劑體系進(jìn)行比較。在體系含水率10%，重組脂肪酶TlLipA 加量為200 U/g 油，55℃、180 r/min 條件下，分別設(shè)置醇油比為3∶1 和4∶1 反應(yīng)。如圖7所示，以上三種溶劑體系中，無溶劑體系在不同醇油比下收率都較高，分別為68.31%和82.75%。正己烷作為溶劑的體系，收率僅為50.94%和64.24%，分析其原因，可能是由于其對(duì)副產(chǎn)物甘油、?；荏w甲醇的溶解度較差，且不利于酶穩(wěn)定[31-32]。DES 作為反應(yīng)溶劑的收率分別為51.92%和73.32%，收率也不如無溶劑體系，且DES 溶劑的回收利用不便，而無溶劑體系最為經(jīng)濟(jì)，因而選擇無溶劑體系進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖7 反應(yīng)溶劑體系的比較Fig.7 Comparison of reaction systems

圖8 醇油比對(duì)收率的影響Fig.8 Effect of methanol to oil ratio on the yield

圖9 含水率對(duì)收率的影響Fig.9 Effect of water content on the yield

在制備過程中，過量的甲醇易從脂肪酶表面剝離出必要的水分子，使其失去其良好的結(jié)構(gòu)和活性，從而抑制脂肪酶活性[33-34]。本實(shí)驗(yàn)在無溶劑體系中，含水率10%，重組脂肪酶TlLipA 加量為200 U/g油，55℃、180 r/min條件下反應(yīng)，采取分批加入甲醇的方式(間隔12 h)，減少甲醇對(duì)酶的抑制作用。如圖8所示，醇油比由4∶1增至5∶1時(shí)對(duì)收率進(jìn)一步提高幫助不大，過量甲醇對(duì)該酶有一定抑制作用，因而醇油比4∶1為最佳。

脂肪酶制備生物柴油的過程中，過量的水存在時(shí)可能導(dǎo)致反應(yīng)平衡向逆反應(yīng)方向移動(dòng)，從而導(dǎo)致收率下降[35]。水量過少，酶的活動(dòng)空間受限，影響其與反應(yīng)底物的結(jié)合，因而選擇優(yōu)化體系含水率。本實(shí)驗(yàn)在無溶劑體系中，醇油比4∶1，重組脂肪酶TlLipA 加量為200 U/g 油，55℃、180 r/min 條件下反應(yīng)48 h，設(shè)置5%～60%的含水率進(jìn)行比較。當(dāng)體系含水率達(dá)到20%時(shí)，收率最高(圖9)。由上述實(shí)驗(yàn)可知，在無溶劑體系中，含水率為20%，重組脂肪酶TlLipA 加量為200 U/g 油，醇油比為4∶1，在55℃催化反應(yīng)48 h，生物柴油收率可達(dá)91.75%。

表4 各嗜熱耐堿脂肪酶制備生物柴油比較Table 4 Comparison of preparation of biodiesel using various thermo-alkaline lipases

已報(bào)道的利用嗜熱耐堿脂肪酶制備生物柴油匯總?cè)绫? 所示，本研究脂肪酶在較短時(shí)間內(nèi)獲得的收率最高。以上結(jié)果表明，重組脂肪酶TlLipA 能較好地應(yīng)用于生物柴油的制備，且制備過程簡(jiǎn)單經(jīng)濟(jì)，生物柴油收率較高。在后續(xù)研究中，針對(duì)耗酶量較大和穩(wěn)定性稍遜的問題，將對(duì)該酶進(jìn)行定向進(jìn)化等研究，以有效提高重組TlLipA 的活性和穩(wěn)定性，使其更具工業(yè)化應(yīng)用的潛力。

3 結(jié) 論

(1)本文將解脂嗜熱互營(yíng)桿菌(T. lipolytica)的脂肪酶基因源tll1 全基因合成，并通過酶切反應(yīng)構(gòu)建重組質(zhì)粒pET28a-TLL1，在大腸桿菌中成功表達(dá)。經(jīng)熱處理和鎳柱親和層析獲得純酶，SDS-PAGE 顯示其分子量為53×103，純化倍數(shù)為11.11 倍，比酶活為22.11 U/mg。

(2)表征重組脂肪酶TlLipA 的酶學(xué)性質(zhì)，結(jié)果表明重組脂肪酶TlLipA 的最適反應(yīng)溫度為65℃，在65℃保溫1 h 后其相對(duì)酶活力保持51%；其最適pH 8.0，在pH 7.0～10.0 范圍內(nèi)有較高的穩(wěn)定性。重組脂肪酶TlLipA 的酶活力主要受到金屬離子Zn2+、Fe3+和化學(xué)試劑SDS、EDTA、Tween 80、AEO-7 的抑制，需要在該酶的使用過程中嚴(yán)格控制這些組分的濃度。該酶催化中長(zhǎng)鏈脂肪酸對(duì)硝基苯酯能力較強(qiáng)，以p-NPP 為底物時(shí)，米氏常數(shù)Km為0.23 mmol/L，表明其對(duì)底物p-NPP的親和性較高。

(3)將重組脂肪酶TlLipA 用于催化大豆油制備生物柴油，含水率20%，加酶量為200 U/g 油，于55℃、醇油比為4∶1 的無溶劑體系中反應(yīng)48 h，生物柴油收率可達(dá)91.75%，說明該酶于生物柴油的生產(chǎn)有較好的適應(yīng)性。與其他來源的嗜熱耐堿脂肪酶相比，本文的嗜熱耐堿脂肪酶TlLipA 除了具有較佳的酶學(xué)特性之外，在生物柴油的制備應(yīng)用中，能在無溶劑含水體系中以較短的時(shí)間獲得更高的收率，簡(jiǎn)單經(jīng)濟(jì)，因此該酶在生物柴油制備中更具利用前景，后續(xù)研究將進(jìn)一步著重改善酶穩(wěn)定性和催化效率以期更貼近工業(yè)需求。