當(dāng)歸腹痛寧滴丸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提高

朱 琳 劉東升 朱旭江 蘇 蕊 姚世霞 賀軍權(quán) 楊平榮

1.甘肅省藥品檢驗研究院，甘肅 蘭州 730070；2. 甘肅省中藏藥檢驗檢測技術(shù)工程實驗室，甘肅 蘭州 730070

當(dāng)歸腹痛寧滴丸具有解痙止痛的功效，主要用于婦女痛經(jīng)、產(chǎn)后宮縮痛、感染性腹瀉引起的急性腹痛、小兒秋季腹瀉等的治療。原標(biāo)準(zhǔn)收載于甘肅省藥品標(biāo)準(zhǔn)1988年版。1998年收載入衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑第十七冊，此標(biāo)準(zhǔn)沿用至今，此標(biāo)準(zhǔn)中收載性狀、鑒別(當(dāng)歸)和檢查項，標(biāo)準(zhǔn)較為簡單，不足以控制當(dāng)歸腹痛寧滴丸的質(zhì)量。所以有必要提高現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。當(dāng)歸腹痛寧滴丸是以當(dāng)歸揮發(fā)油為主要原料制成的滴丸劑，當(dāng)歸揮發(fā)油的主要成分為苯酞類，其中藁本內(nèi)酯含量最高[1]，藁本內(nèi)酯有很強(qiáng)的解痙、平喘、鎮(zhèn)定作用，臨床上可用于治療支氣管炎和婦科疾病。研究顯示，藁本內(nèi)酯具有良好的改善微循環(huán)作用，可用于防治與微循環(huán)障礙有關(guān)的疾病[2-3]。與當(dāng)歸腹痛寧滴丸功能主治相吻合，因此當(dāng)歸腹痛寧滴丸的質(zhì)量控制需定量測定藁本內(nèi)酯的含量，確保藥物的有效性。當(dāng)歸揮發(fā)油是當(dāng)歸經(jīng)水蒸氣蒸餾，再經(jīng)二氯甲烷萃取而得到的，當(dāng)歸腹痛寧滴丸中有可能存在二氯甲烷溶劑殘留，所以需要建立二氯甲烷溶劑殘留檢查項，確保藥物的安全性。在驗證原標(biāo)準(zhǔn)時還發(fā)現(xiàn)原標(biāo)準(zhǔn)中收載的當(dāng)歸薄層鑒別方法[4]，由于展開系統(tǒng)極性太小且點樣量過大，因此修改了當(dāng)歸薄層鑒別項。

1 材料

1.1 儀器 薄層色譜自動點樣儀(CAMAG 半自動點樣儀)；薄層自動成像儀(CAMAG TLC成像儀)；Agilent 7890A(CTC頂空進(jìn)樣器)氣相色譜儀；Sartorius天平；電子天平(ME-204)；Waters ALLiance e2695 型高效液相色譜儀；e2695 HPLC Pump、2998 DuaLλ Absorbance Detector 和Empower色譜工作站；資生堂CAPCELL PAK C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱，島津Inertsil ODS-SP(4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱和Welch Ultimate XB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱； KH-500DE超聲波清洗器(上海超聲波儀器廠)。

1.2 試藥 當(dāng)歸對照藥材(中國藥品生物制品檢定所提供，批號：120927-201014)；藁本內(nèi)酯(上海源葉生物科技有限公司提供，批號：Z23M7B15162，含量：98%)；N，N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷、甲醇與乙腈為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純；當(dāng)歸腹痛寧滴丸(蘭州和盛堂制藥有限公司提供，批號：20150401、20150402、20150403、20150406、20150407、20150408、20150409、20150701、20150702、20150703)。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層色譜鑒別 原標(biāo)準(zhǔn)中的當(dāng)歸薄層鑒別方法，由于展開系統(tǒng)極性太小，未將對照藥材與樣品中相應(yīng)的斑點最大程度的展開(如圖1A所示)，所以調(diào)整展開系統(tǒng)的極性(如圖1B所示)。另外，原標(biāo)準(zhǔn)中點樣量過大，因此調(diào)整點樣量。最終的方法改為：取本品20粒，置乳缽中，加乙醚研磨提取2次，每次10 mL，過濾，揮干乙醚，殘渣加乙醇1 mL溶解，作為供試品溶液。另取當(dāng)歸對照藥材0.5 g，加乙醚5 mL，振搖2 min，分取乙醚液，揮去乙醚，殘渣加乙醇1 mL使溶解，作為對照藥材溶液。照薄層色譜法(中國藥典2015年版四部 通則0502)試驗，吸取上述兩種溶液各5 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以正己烷-乙醚(7∶3)為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光主斑點。

A B A.原標(biāo)準(zhǔn)的薄層色譜圖 B.展開劑極性與點樣量修改后的薄層色譜圖圖1 薄層色譜圖

2.2 二氯甲烷溶劑殘留[5-7]

2.2.1 氣相色譜條件 以6%氰丙基苯-94%二甲基硅氧烷為固定相的毛細(xì)管柱(DB-624，柱長為30 m，內(nèi)徑為0.32 mm，膜厚度為1.8 μm)；柱溫為程序升溫：初始溫度為30 ℃，保持3.5 min，以每分鐘5 ℃的速率升溫至100 ℃，再以每分鐘50 ℃的速率升溫至220 ℃，保持5 min(250 ℃ 后運行6 min)；氫火焰離子化檢測器檢測，檢測器溫度250 ℃；進(jìn)樣口溫度200 ℃；頂空進(jìn)樣，頂空瓶平衡溫度為90 ℃，平衡時間30 min，進(jìn)樣體積300 μL。

2.2.2 溶液的制備

2.2.2.1 對照品溶液的制備 取二氯甲烷(色譜級)約30 mg，精密稱定(31.5 mg)，加N，N-二甲基甲酰胺稀釋制成每l mL含0.3 mg的溶液，即得。

2.2.2.2 供試品溶液的制備 取重量差異項下的腸溶滴丸，研細(xì)，混勻，取本品約3.0 g，精密稱定，置20 mL頂空瓶中，精密加人N，N-二甲基甲酰胺5 mL，密封，振搖使溶散，即得。

2.2.2.3 陰性樣品溶液的制備 按制備工藝，提取當(dāng)歸藥材的揮發(fā)油，配制不含二氯甲烷的陰性對照品，并按標(biāo)準(zhǔn)擬定的供試品溶液制備方法制成陰性對照液，即得。

2.2.3 專屬性試驗 精密吸取對照品溶液、供試品溶液、陰性樣品溶液以及供試品溶液與對照品溶液的混合溶液，按“2.2.1”項下色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖。結(jié)果表明，陰性樣品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的出峰時間未出現(xiàn)相同的峰，且陰性制劑對所測組分無干擾。對照品溶液中，二氯甲烷的理論塔板數(shù)均大于100000，供試品溶液中二氯甲烷峰及其相鄰色譜峰的色譜分離度均大于1.5，能夠?qū)崿F(xiàn)良好的基線分離。對照品溶液、供試品溶液及陰性樣品溶液的色譜圖如圖2所示。

A.對照品；B.供試品；C.陰性樣品 圖2 二氯甲烷溶劑殘留氣相色譜圖

2.2.4 線性關(guān)系的考察 取二氯甲烷(色譜級)約30 mg，精密稱定(31.7 mg)，加N，N-二甲基甲酰胺稀釋制成每 mL含0.6 mg的溶液，搖勻，作為線性儲備液備用；分別精密量取線性儲備液體1.0、2.5、4.0、5.0、6.0、7.5 mL置10 mL量瓶中，N，N-二甲基甲酰胺定容，搖勻，分別測定分析，以峰面積為縱坐標(biāo)，以樣品濃度為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸處理，得到二氯甲烷的回歸方程為Y=94.818X+1.9965(R=0.999)，結(jié)果表明，二氯甲烷在 0.0634～0.4755 mg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.2.5 精密度試驗 精密吸取2.2.2項下的對照品溶液5 mL，置20 mL頂空瓶中，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，結(jié)果二氯甲烷的RSD為2.6%，表明儀器精密度良好。

2.2.6 檢出限及定量限試驗 將線性項下溶液圖譜進(jìn)行計算信噪比為10的為定量限，信噪比為3的為檢出限之間。結(jié)果二氯甲烷的檢出限為3.1500 μg/mL，定量限為12.6000 μg/mL。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液，在0、2、4、8、12、16 h進(jìn)行測定，記錄峰面積，結(jié)果均未檢出，表明供試品溶液在16 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.8 加樣回收率試驗 精密量取2.2.4項下線性儲備液適量，每三份一組，第一組加入線性儲備液5.0 mL；第二組加入線性儲備液10.0 mL；第三組加入線性儲備液15.0 mL，分別置20 mL量瓶中用2.2.2項下的陰性樣品溶液溶解并稀釋至刻度，按供試品溶液制備方法制備，測定，計算回收率。二氯甲烷的平均加樣回收率為97.7%，RSD為2.2%(n=9)，本方法回收率良好。結(jié)果見表1。

表1 二氯甲烷加樣回收率試驗結(jié)果

2.2.9 樣品測定 取10批樣品(批號20150401、20150402、20150403、20150406、20150407、20150408、20150409、20150701、20150702、20150703)，按“ 2.2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件進(jìn)行測定，記錄測定結(jié)果。10批樣品均未檢出二氯甲烷溶劑殘留。

2.3 藁本內(nèi)酯的含量測定[8-10]

2.3.1 色譜條件 色譜柱選用資生堂CAPCELL PAK C18 (5μm，4.6 mm ×250 mm)，以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以甲醇-乙腈-水 (15∶35∶50)為流動相，檢測波長為327nm，柱溫30 ℃，流速：1.0 mL/min，進(jìn)樣量：10 μL。

2.3.2 溶液的制備

2.3.2.1 供試品溶液的制備 取供試品，研細(xì)，取約0.5 g，精密稱定，置50 mL量瓶中，加入甲醇約40 mL，超聲提取15 min(功率500 W，頻率40 kHz)，放冷，用甲醇定容至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3.2.2 對照品溶液的制備 取藁本內(nèi)酯對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含藁本內(nèi)酯50 μg，即得。

2.3.2.3 陰性樣品溶液的制備 按處方比例及制備工藝，配制不含當(dāng)歸油的陰性樣品，并按標(biāo)準(zhǔn)擬定的供試品溶液制備方法制成陰性對照液。

2.3.3 專屬性試驗 精密吸取對照品溶液、供試品溶液及陰性樣品溶液，按“2.3.1”項下色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖。結(jié)果表明，供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的出峰時間出相同的峰，且陰性樣品溶液所測組分無干擾。供試品溶液中，藁本內(nèi)酯的理論塔板數(shù)均大于10000，目標(biāo)色譜峰及其相鄰色譜峰的色譜分離度均大于1.5，能夠?qū)崿F(xiàn)良好的基線分離。對照品溶液、供試品溶液及陰性樣品溶液的色譜圖如圖3所示。

A.對照品；B.供試品；C.陰性樣品 圖3 當(dāng)歸腹痛寧滴丸液相色譜圖

2.3.4 線性關(guān)系的考察 分別精密吸取“2.3.2.2”項下對照品溶液 2、5、10、15、20、30、40 μL注入高效液相色譜儀，在“2.3.1”條件下測定峰面積。以進(jìn)樣量(X, μg)為橫坐標(biāo)，峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到藁本內(nèi)酯回歸方程為：Y=2760000X+3640，R=0.999999；線性范圍為0.1064～2.1290 μg。

2.3.5 精密度試驗 精密吸取同一對照品溶液10 μL，按“2.3.1”項下條件重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。按峰面積計算，結(jié)果藁本內(nèi)酯RSD為0.8%(n=6)，表明儀器精密度良好。

2.3.6 重復(fù)性試驗 取同一批號的當(dāng)歸腹痛寧滴丸樣品6份(批號20150703)，按“2.3.2.1”項下方法平行制備6份供試品溶液，各吸取10 μL進(jìn)樣，記錄峰面積，結(jié)果藁本內(nèi)酯含量的 RSD為1.8% (n=6)，表明本方法重復(fù)性良好。

2.3.7 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品(批號20150703)溶液，按“2.3.1”項下條件分別在0、4、12、24、48、96 h進(jìn)行測定，記錄峰面積，結(jié)果藁本內(nèi)酯的RSD為1.2%(n=6)，表明供試品溶液在96 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.8 加樣回收率試驗 精密稱取當(dāng)歸腹痛寧滴丸( 批號 20150703) 9 份，每份0.25 g，分為3 組。按供試品中待測化合物含量的50%，100% 和150% 分別加入對照品溶液(0.1330644 mg/mL、0.443548 mg/mL)，按“2.3.2.1”項下方法制備供試品溶液，按“2.3.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積，計算藁本內(nèi)酯的平均回收率為98.0%，RSD 為2.6%，結(jié)果見表2。

表2 藁本內(nèi)酯加樣回收率試驗結(jié)果

2.3.9 樣品測定 取10批樣品(批號20150401、20150402、20150403、20150406、20150407、20150408、20150409、20150701、20150702、20150703)，每批2份，按“ 2.3.2.1”項下方法制備供試品溶液，按“2.3.1”項下色譜條件進(jìn)行測定，記錄峰面積，測定含量。結(jié)果見表3。

表3 樣品測定結(jié)果 (n=10)

2.3.10 耐用性試驗(不同色譜柱的影響) 為了考察該含量測定方法的耐用性，實驗分別采用不同和品牌的色譜柱分別測定樣品(批號：20150703)的同一供試品溶液，RSD為1.1%，說明不同色譜柱對其結(jié)果的影響較小。見表4。

表4 不同色譜柱測定結(jié)果

3 討論

在藁本內(nèi)酯的含量測定中，分別對以下四種流動相進(jìn)行了考察：1.甲醇-水2.甲醇-1%醋酸溶液；3.乙腈-水；4.甲醇-乙腈-水。流動相1、2和3均不符合系統(tǒng)適用性要求，1和2不能使藁本內(nèi)酯峰與其左側(cè)峰的分離度達(dá)到要求，3不能使藁本內(nèi)酯峰與其右側(cè)峰的分離度達(dá)到要求，最后使用三相系統(tǒng)達(dá)到了色譜峰的很好分離，繼續(xù)調(diào)整流動相比例，調(diào)整為甲醇-乙腈-水(15∶35∶50)，保證主峰出峰時間盡量小的前提下，使主峰達(dá)到完全分離。對一批樣品(20150409)分別采用甲醇、乙酸乙酯與三氯甲烷進(jìn)行提取，三種溶劑的提取效率相似，但考慮到環(huán)保，所以采用甲醇為提取溶劑。

二氯甲烷溶劑殘留檢查項色譜條件的選擇中：比較了不同色譜柱, 如HP-5、Rxi-17和DB-624等, 結(jié)果有的樣品中有雜峰干擾, 有的二氯甲烷與相鄰的峰分離, 最終選擇DB-624(30 m×0.320 mm 1.80 μm) 為分析柱, 并對不同起始柱溫和保持時間 (70 ℃ 7 min、50 ℃ 5 min和30 ℃ 3.5 min) 進(jìn)行了比較 (后續(xù)升溫速度和保持時間均相同)， 結(jié)果在30℃ 3.5 min的起始溫度條件下, 目標(biāo)峰得到基線分離。依據(jù)中國藥典2015年版規(guī)定，二氯甲烷限量為0.06%。實際樣品中檢測到的二氯甲烷殘留量均遠(yuǎn)在藥典規(guī)定的限量以下。方法學(xué)研究結(jié)果顯示本法具有足夠的靈敏度, 可檢出樣品中二氯甲烷的含量分別0.0008%。表明本法能有效控制當(dāng)歸腹痛寧滴丸原料藥中殘留溶劑量。

綜上所述，本實驗采用薄層色譜法和高效液相色譜法對當(dāng)歸腹痛寧滴丸分別進(jìn)行了定性和定量鑒別，采用氣相色譜法建立二氯甲烷溶劑殘留的檢查項。本方法專屬性強(qiáng)，結(jié)果準(zhǔn)確，可用于當(dāng)歸腹痛寧滴丸的質(zhì)量控制，為臨床安全科學(xué)用藥提供了指導(dǎo)。