基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討木棉花對肝損傷的作用機制

張夢師 劉美珍 楊 斌

廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，廣西 南寧 530021

木棉花為木棉科植物木棉Gossampinusmalabarica(DC.) Merr.的干燥花,別名斑芝樹、英雄花，攀枝花等。其性味：甘、淡，涼；歸大腸經(jīng)；具有清熱利濕，解毒的功效[1]。藥典記載，由木棉花、廣木香、松石等組成的二十五味松石丸，可用于肝郁氣滯，肝中毒，以及各種急、慢性肝炎等。伍小燕等[2-3]研究發(fā)現(xiàn)木棉花提取物能改善CCl4致大鼠肝纖維，緩解抗結(jié)核藥物引起的肝損傷。本課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)木棉花能降低CCL4和對乙酰氨基酚的AST、ALT值。表明木棉花具有潛在治療肝損傷的作用，但木棉花發(fā)揮保肝作用的有效成分及其相關(guān)作用分子機制目前尚未有研究報道。

中藥往往包含多種有效成分，其成分作用靶點、通路也并非單一。針對多成分，多作用靶點藥物，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)基于系統(tǒng)生物學(xué)和多向藥理學(xué)為理論基礎(chǔ)，通過構(gòu)建藥物-靶點-疾病之間的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)來探討藥物的作用機制，利用專業(yè)網(wǎng)絡(luò)分析軟件及算法，可以系統(tǒng)的、整體的揭示藥物疾病之間的聯(lián)系[4-5]。為新藥研發(fā)提供新途徑和新策略。因此，本研究將借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的技術(shù)與方法，對木棉花的主要成分及護肝的作用機制進行較全面和系統(tǒng)的分析，為進一步研究開發(fā)提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 構(gòu)建木棉花所含化合物數(shù)據(jù)庫 利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺數(shù)據(jù)庫(TCMSP，https：//ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php)檢索“Gossampiniflos”獲取得木棉花所含的所有化學(xué)成分，通過客觀評價藥物口服生物利用度與內(nèi)在質(zhì)量的重要指標的OB值(≥30%)和藥動學(xué)特性與安全性的總和DL值(≥0.18)，篩選木棉花中可能的有效活性成分[6]。將上述活性成分以mol2格式保存各自的結(jié)構(gòu)圖。

1.2 藥物靶點預(yù)測 登陸superpred webserwer和SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫，上傳木棉花活性成分mol格式文件，其余設(shè)置按照條件設(shè)置。檢索匹配得到藥物的預(yù)測靶點，并對其不規(guī)范命名的靶點通過UniProt數(shù)據(jù)庫進行規(guī)范化命名。將獲得的木棉花活性成分和作用靶點的信息導(dǎo)入Cytoscape軟件，構(gòu)建木棉花“活性成分-作用靶點”網(wǎng)絡(luò)圖。淺藍色矩形節(jié)點代表活性成分，紅色圓形節(jié)點代表作用靶點，邊代表活性成分和作用靶點之間的相互作用關(guān)系。

1.3 木棉花-肝損-潛在作用靶點預(yù)測 將木棉花藥物檢索的作用靶點與OMIM 數(shù)據(jù)庫(http://omim.org/)搜集到的肝損傷靶點進行映射，比對分析，歸納總結(jié)獲得木棉花治療肝損傷作用的靶點。將映射后獲得的木棉花與肝損傷相互作用靶點導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(https://stringdb.org/cgi/input.plsessionId=ieh6JADMAFtH&input_page_show_search=on)中獲得靶點-靶點功能相關(guān)蛋白間的作用，并通過Cytoscape_v3.2.1構(gòu)建木棉花-靶點-肝損PPI網(wǎng)絡(luò)。

1.4 核心靶點生物功能和通路富集分析 應(yīng)用DAVID數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/home.jsp)對預(yù)測的相互作用靶點進行GO生物富集分析和KEGG通路注釋分析，整理導(dǎo)入omicshare云平臺(http://www.omicshare.com/tools/Home/Soft/gogsea)對木棉花治療肝損傷的主要靶點可能調(diào)節(jié)的生物過程及涉及的信號通路進行可視化，并根據(jù)P-value繪制生物過程和信號通路高級氣泡圖。

2 結(jié)果

2.1 木棉花活性化合物的篩選 通過 TCMSP 共收集到木棉花所含化合物93個。以O(shè)B≥30%和DL≥0.18 為篩選條件，有10個化合物符合條件，將其作為候選化合物見表1。

表1 10個候選化合物的化學(xué)信息

續(xù)表1

續(xù)表1

2.2 活性化合物靶點的預(yù)測 通過PharmMapper數(shù)據(jù)庫檢索到個木棉花驗證靶點329個、預(yù)測靶點156個，swiss target prediction數(shù)據(jù)庫檢索到靶點150個。木棉花 “活性成分-作用靶點”網(wǎng)絡(luò)如圖1所示，該網(wǎng)絡(luò)包含372 個節(jié)點和525條邊。圓形節(jié)點代表作用靶點，邊代表活性成分和作用靶點之間的相互作用關(guān)系。由表可知，同一活性成分對應(yīng)不同的作用靶點，同一作用靶點也對應(yīng)于不同的活性成分，表現(xiàn)出了木棉花多成分、多靶點的特點。

圖1 成分靶點圖

2.3 木棉花-肝損-潛在作用靶點預(yù)測 將木棉花有效化合物預(yù)測作用靶點與Drugbank數(shù)據(jù)庫檢索到的肝損傷靶點進行映射后獲得20個木棉花治療肝損的潛在作用靶點。分別是UGT1A9、GSR、CYP2E1、CA3、ABCB1、MMP2、CYP2A6、CYP2C9、CHRM3、CYP2A7、CYP2C19、ABCC1、PTGS2、FASN、SORD、NR1H3、NFE2L2、ENPP2、ABCC2、NOX4。如圖2所示。

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 用STRING數(shù)據(jù)庫中獲得靶點-靶點功能相關(guān)蛋白間的作用，通Cytoscape_v3.2.1構(gòu)建木棉花-靶點-肝損傷PPI網(wǎng)絡(luò)。該網(wǎng)絡(luò)共包含17個節(jié)點、41條邊。其中，各節(jié)點表示靶標蛋白，每條邊表示各靶標蛋白間的相互作用關(guān)系，邊數(shù)越多表示該節(jié)點對應(yīng)的靶標蛋白越重要。如圖3所示。

圖2 木棉花抗肝損傷靶點網(wǎng)絡(luò)圖

圖3 木棉花-靶點-肝損傷PPI網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 木棉花活性成分治療肝損傷潛在靶點的通路注釋 將預(yù)測出的 20 個作用靶點通過MAS3.0生物分子功能注釋系統(tǒng)及omicshare云平臺可視化分析，對獲取靶點信息進行GO富集分析和KEGG通路注釋分析。TOP10生物功能富集分析結(jié)果如圖4所示，Heterocycle metabolic process，response to oxidative stress，response to drug，xenobiotic metabolic process，exogenous drug catabolic process，monoterpenoid metabolic process，steroid metabolic process，drug metabolic process，oxidation-reduction process，epoxygenase p450 pathway。這些生物過程主要與氧化應(yīng)激、氧化還原過程、各種代謝的調(diào)控反應(yīng)等的發(fā)生發(fā)展密不可分，意味著木棉花可能是通過調(diào)節(jié)以上生物過程發(fā)揮其抗肝損傷的作用。通過DAVID數(shù)據(jù)庫及omicshare云平臺可視化分析，TOP10信號通路富集分析結(jié)果如圖4所示。結(jié)果表明，信號通路主要涉及pentose and glucuronate interconversions，serotonergic synapse，metabolic pathyways，retinol metabolism，ABC transporters，Linoleic acid metabolism，metabolism of xenobiotics by cytochrome P450，Arachidonic acid metabolism，Drug metabolism-cytochrome p450，chemical carcinogenesis。表明木棉花抗肝損傷可能通過體內(nèi)的相互轉(zhuǎn)化、ABC轉(zhuǎn)運蛋白、花生四烯酸代謝等通路發(fā)揮作用。

圖4 生物功能和富集通路分析

3 討論

肝臟是腹腔內(nèi)最大的實質(zhì)性器官，擔(dān)負人體的重要生理功能，易受到體內(nèi)外的各種刺激因子或致病因素的侵襲，引起損傷，不及時治療控制，可以導(dǎo)致脂肪肝、肝硬化甚至肝癌[7]。大量研究表明中藥及其有效成分可以通過抗氧自由基損傷、減少炎癥的產(chǎn)生、改善肝功能等途徑達到保護肝細胞治療肝損傷的作用[8]。木棉花為木棉生長過程中產(chǎn)生大量的落花，地域分布廣，資源豐富。木棉花始載于何克諫《生草藥性備用》 “木棉花治痢癥，白者更妙”，清代趙其光《本草求原》：“紅者去赤痢，白者治白痢，同武彝茶煎常飲”，以木棉花作為組成的中成藥被收錄在藥典及部版標準上[9-10]。木棉花巨大的資源和悠久的藥用價值表明木棉花具有非常大的開發(fā)價值。既往研究及本課題組前期研究表明木棉花具有潛在治療肝損傷的作用[2-3]。本研究應(yīng)用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺，利用STRING等軟件和數(shù)據(jù)庫研究化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)、木棉花-靶點-疾病之間的相互作用關(guān)系。

本研究發(fā)現(xiàn)槲皮素、橙皮素、3-甲基山奈酚、β-谷甾醇、菠菜甾醇、油酸乙酯等10個是木棉花的關(guān)鍵性有效成分。其中槲皮素、橙皮素、木樨草素、3-甲基山奈酚屬于黃酮類化合物。大量研究[11-13]表明黃酮類化合物具有抗氧化、抗纖維化、抗炎、抑癌、抗病毒、抗衰老、抗抑郁和保護心血管、維持血糖穩(wěn)定等藥理作用。槲皮素可減輕肝炎、肝硬化所致的肝損傷，改善脂多糖誘導(dǎo)的L02細胞的炎性損傷[14]。橙皮素對肝臟單氧化酶系p450具有調(diào)節(jié)特有作用，由橙皮素能夠顯著提高免疫系統(tǒng)的效力，增加抗氧化劑的活性等[15]。β-谷甾醇、菠菜甾醇、豆甾醇為植物甾醇類化合物，研究表明具有抗炎、抗氧化、降血脂、調(diào)節(jié)免疫、抑癌等藥理活性[16]。亞油酸乙酯據(jù)實驗驗證其對HepG2細胞均具有明顯的保護作用[17]。表明這幾個化合物可能是木棉花的潛在活性物質(zhì)。

通過構(gòu)建木棉花-靶點-肝損相關(guān)蛋白網(wǎng)絡(luò),發(fā)現(xiàn)多個相互作用的關(guān)鍵靶點PTGS2、CYP2E1、GSR、ABCB1、UGT1A9等20個。PTGS2基因是前列素環(huán)氧化物合成酶(PTGS)的一種亞型， PTGS2特異性抑制劑能抑制肝癌細胞增殖和誘導(dǎo)細胞凋亡[18-19]。細胞色素P450酶(CYP450)是肝微粒體混合功能氧化酶中最重要的一族，在外源性物質(zhì)和內(nèi)源性物質(zhì)的代謝中具有極其重要的作用[20]。CYP1A2、CYP2E1等是P450酶系的重要亞型，均能催化許多前毒物和前致癌物轉(zhuǎn)化為有毒物和致癌物質(zhì)，對肝臟產(chǎn)生危害，抑制 CYP1A2和CYP2E1的表達可拮抗CCL4產(chǎn)生的肝毒性[21, 22]。NOX是最早發(fā)現(xiàn)于吞噬細胞中的一種多亞基跨膜酶復(fù)合體，其主要利用 NADPH 將電子傳遞給氧分子，從而產(chǎn)生超氧自由基及活性氧。其中 NOX4 是 NOX 的催化性亞基中分布最廣泛的一種[23-24]。在肝臟中，NOX4可參與四氯化碳誘導(dǎo)的肝星狀細胞的增殖，促進肝臟纖維化等[25]。表明木棉花可能是通過上述預(yù)測的相互作用靶點發(fā)揮作用。

對關(guān)鍵靶點進行GO 功能富集和KEGG 通路富集分析，發(fā)現(xiàn)木棉花預(yù)測靶點富集在調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激、氧化還原過程、花生四烯酸代謝、P450酶系等各種代謝的調(diào)控、信號通路反應(yīng)等方面功能。

本研究通過系統(tǒng)藥理學(xué)的研究方法，對木棉花治療肝損傷多成分、多靶標、多途徑的復(fù)雜作用機制進行分析，結(jié)果表明木棉花有效化合物質(zhì)槲皮素、β-谷甾醇、3-甲基山奈酚等可能通過氧化應(yīng)激、氧化還原過程、花生四烯酸代謝、P450酶系代謝等信號通路等和作用于PTGS2、CYP2E1、GSR、ABCB1、UGT1A9等靶標蛋白進而發(fā)揮其改善肝臟損傷的作用，為中藥木棉花的進一步開發(fā)利用提供理論參考。