重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)檢測(cè)霍亂弧菌

蔣麗婷 孫浩洋 趙培靜 周廣彪 楊礎(chǔ)華 梁希揚(yáng)

（1.廣州市微生物研究所有限公司（廣州工業(yè)微生物檢測(cè)中心） 廣東廣州 510663；2.廣東省海洋工程職業(yè)技術(shù)學(xué)校；3.汕頭海關(guān)）

1 前言

霍亂弧菌是一種革蘭陰性菌，在蝦、蟹、牡蠣等甲殼類及貝類水生動(dòng)物中廣泛存在，可引起烈性腸道傳染病霍亂，發(fā)病急、傳染性強(qiáng)且病死率高，曾在世界上引發(fā)多次大流行，是對(duì)人類危害極大的一種食源性致病菌[1，2]。 1817 年至今，歷史上共發(fā)生 7 次霍亂大流行，造成數(shù)百萬(wàn)人的死亡，霍亂被列入國(guó)際檢疫傳染病，在我國(guó)被列為甲類法定傳染病。 霍亂在我國(guó)南方相對(duì)多發(fā)，政府每年都會(huì)投入大量的人力、物力進(jìn)行霍亂防控，因此霍亂弧菌的快速、高效檢測(cè)在公共衛(wèi)生防疫方面具有極其重要的意義[3，4]。

目前，傳統(tǒng)選擇性培養(yǎng)基分離培養(yǎng)鑒定法仍是霍亂弧菌檢測(cè)的主要方法，先增菌培養(yǎng)后結(jié)合生化及血清學(xué)方法進(jìn)行鑒定，這種方法雖然檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確，但卻存在操作煩瑣、檢測(cè)效率與檢測(cè)靈敏度低、檢測(cè)目標(biāo)單一且耗時(shí)長(zhǎng)等缺點(diǎn)，為實(shí)現(xiàn)霍亂弧菌等致病菌的快速檢測(cè)，技術(shù)人員建立了酶聯(lián)熒光免疫檢測(cè)法、膠體金試紙條法、API 生化鑒定試紙條法、實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）、環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增（LAMP）等方法。其中，實(shí)時(shí)熒光PCR 及其他相關(guān)的改良方法如雙啟動(dòng)寡核苷酸引物-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（DPO-PCR）法等以其靈敏度高、操作簡(jiǎn)便快捷等顯著優(yōu)勢(shì)，近年來(lái)在霍亂弧菌、擬態(tài)弧菌等致病菌的檢測(cè)中，得到越來(lái)越廣泛應(yīng)用[5]，但是熒光檢測(cè)相關(guān)設(shè)備存在售價(jià)偏高、引物探針設(shè)計(jì)要求較高、產(chǎn)物片段偏小等缺陷，在很大程度上限制了其推廣應(yīng)用，基層實(shí)驗(yàn)室及非實(shí)驗(yàn)室環(huán)境下現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的推廣應(yīng)用更是受到了極大限制。

重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)（RPA）是繼LAMP 之后的另一種等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)，具有反應(yīng)時(shí)間短、恒溫實(shí)現(xiàn)核酸的解鏈和退火、檢測(cè)結(jié)果易辨識(shí)等優(yōu)點(diǎn)[6]。本研究擬根據(jù)編碼霍亂弧菌外膜蛋白（ompW）的基因保守序列，設(shè)計(jì)霍亂弧菌RPA 檢測(cè)引物，構(gòu)建了一種霍亂弧菌的RPA 檢測(cè)手段，并驗(yàn)證該方法的靈敏度、特異性，從而建立一種高效簡(jiǎn)便、靈敏度高、特異性強(qiáng)并適用于現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用檢測(cè)的技術(shù)方法。

2 試驗(yàn)部分

2.1 材料與儀器

材料：霍亂弧菌、副溶血弧菌、創(chuàng)傷弧菌、擬態(tài)弧菌、金黃色葡萄球菌、河流弧菌、大腸埃希菌、溶藻弧菌、沙門(mén)菌、哈維弧菌、單增李斯特菌等標(biāo)準(zhǔn)菌株（中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所）；電泳級(jí)瓊脂糖、DNA Marker 及顯色劑（寶生物大連生物技術(shù)有限公司）；RPA 擴(kuò)增試劑盒（TwistDX 公司）；DNA 提取試劑盒（天根生化科技有限公司）。

儀器：核酸蛋白分析儀（ND-1000，Thermo fisher公司）；凝膠成像系統(tǒng)（Tanon-1600，天能公司）；PCR擴(kuò)增儀（Veriti，ABI 公司）；電泳儀（DYY-6C，北京六一生物科技有限公司）。

2.2 試驗(yàn)方法

2.2.1 基因組DNA 提取

按照傳統(tǒng)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法先對(duì)標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行復(fù)壯增菌及生化鑒定， 再參照檢測(cè)試劑盒中的操作流程，提取上述增菌液的基因組DNA，最后再使用核酸蛋白分析儀對(duì)DNA 純度及濃度進(jìn)行測(cè)定，并統(tǒng)一稀釋至 100 ng/μL 備用。

2.2.2 引物設(shè)計(jì)

參照RPA 的引物設(shè)計(jì)操作方法，結(jié)合霍亂弧菌ompW 基因的保守序列，采用引物設(shè)計(jì)軟件（Oligo V6.22），對(duì)引物進(jìn)行設(shè)計(jì)和篩選，再采用NCBI 的引物設(shè)計(jì)和特異性檢測(cè)工具（Primer Blast），對(duì)入選的序列進(jìn)行特異性確認(rèn)，委托上海生物工程技術(shù)有限公司進(jìn)行合成[7]。 最終設(shè)計(jì)檢測(cè)霍亂弧菌RPA 檢測(cè)引物的擴(kuò)增產(chǎn)物為280 bp，具體序列為：上游引物：5′- GAAGGTGACTTTATTGTGCGCGCGGGTATTGCC-3′；下游引物：5′-CACCAAAGTAGTATTGGACCAT AAAGGTAGGT-3′。

2.2.3 方法建立

以提取的標(biāo)準(zhǔn)菌株基因組DNA 為模板，采用設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行RPA 擴(kuò)增，陰性對(duì)照為超純水，測(cè)定在恒溫（37℃）及 30、40、50、60 min 反應(yīng)時(shí)長(zhǎng)下的擴(kuò)增效果。

配制RPA 擴(kuò)增體系方法為：將再水化緩沖液29.5μL，上、下游引物各 2μL（終濃度為 0.4μmol/L），去離子水 12.5 μL 以及模板 DNA 1 μL 分別加入含有0.2 mL 凍干酶粉的Twist Amp 反應(yīng)管中，最后加入醋酸鎂溶液 2.5 μL（280 mmol/L）。

反應(yīng)結(jié)束后，將50 μL 苯酚/氯仿溶液加入到RPA擴(kuò)增產(chǎn)物中，充分混勻，然后在12 000 r/min 轉(zhuǎn)速下離心2 min，取5 μL 上清液點(diǎn)樣于1.5%瓊脂糖凝膠，使用1×TBE 緩沖液在5 V/cm 條件下進(jìn)行恒壓電泳40～60 min，最終在凝膠成像系統(tǒng)上觀察結(jié)果。

2.2.4 特異性評(píng)價(jià)

按照RPA 檢測(cè)方法，對(duì)11 種標(biāo)準(zhǔn)菌株的基因組DNA 進(jìn)行檢測(cè)，并評(píng)價(jià)所建立RPA 檢測(cè)方法的特異性。

2.2.5 靈敏度評(píng)價(jià)

將提取的霍亂弧菌基因組DNA 進(jìn)行10 倍梯度稀釋（稀釋成5 個(gè)稀釋度），并以稀釋后的DNA 為模板，按照RPA 檢測(cè)方法進(jìn)行方法靈敏度測(cè)試，并與魏霜等[8]建立的檢測(cè)霍亂弧菌的DPO-PCR 方法進(jìn)行靈敏度比較，引物序列ompW-F：5′-CGCTCCTGT ATTTGCTCACCAAGIIIIIGACTTTATTGTG-3′；ompW-R：5′-GAGCATTAATCAAAGCCAACGTTAIIIIIAAGT CCCCAT-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為 463 bp。

2.2.6 應(yīng)用效果評(píng)價(jià)

選取水質(zhì)監(jiān)控樣本及金昌魚(yú)、凍鳳尾對(duì)蝦、凍蝦仁、活青蟹、凍牡蠣檢測(cè)留樣樣品50 份（其中霍亂弧菌陽(yáng)性樣品5 份），按照建立方法對(duì)霍亂弧菌進(jìn)行檢測(cè)，以結(jié)果的一致性來(lái)評(píng)價(jià)方法的應(yīng)用效果。

3 結(jié)果

3.1 RPA 檢測(cè)方法的構(gòu)建

按照RPA 檢測(cè)方法，測(cè)得的不同擴(kuò)增時(shí)長(zhǎng)的RPA 檢測(cè)效果詳見(jiàn)圖1。檢測(cè)結(jié)果顯示，檢測(cè)時(shí)長(zhǎng)在40 min 時(shí)就可以達(dá)到比較理想的擴(kuò)增效果，ompW擴(kuò)增條帶與預(yù)期目的條帶的大小一致，約280 bp，而超純水陰性對(duì)照沒(méi)有條帶，結(jié)果表明，ompW 基因通過(guò)采用建立的RPA 檢測(cè)體系可以被準(zhǔn)確檢測(cè)到。

3.2 RPA 檢測(cè)方法的特異性評(píng)價(jià)

從ompW 的RPA 特異性評(píng)價(jià)結(jié)果可以看出，霍亂弧菌可以檢測(cè)到280 bp 的特異性條帶，而副溶血弧菌、創(chuàng)傷弧菌、擬態(tài)弧菌、金黃色葡萄球菌等其他10 株標(biāo)準(zhǔn)菌株均未檢測(cè)到條帶，說(shuō)明該方法特異性較強(qiáng)，詳見(jiàn)圖2。

圖1 RPA 技術(shù)檢測(cè)ompW 基因的擴(kuò)增時(shí)長(zhǎng)結(jié)果

圖2 ompW 基因的RPA 特異性檢測(cè)結(jié)果

3.3 RPA 檢測(cè)方法的靈敏度評(píng)價(jià)

RPA 檢測(cè)方法的靈敏度測(cè)試結(jié)果詳見(jiàn)圖3。 結(jié)果表明，在反應(yīng)時(shí)間為40 min，DNA 含量為0.1 ng 時(shí)，RPA 檢測(cè)方法可以檢測(cè)到280 bp 大小的目的條帶，該靈敏度結(jié)果與魏霜等建立的檢測(cè)霍亂弧菌owpW 基因的DPO-PCR 方法一致；而在DNA 的含量為0.01 ng時(shí)，RPA 方法與PCR 方法都不能擴(kuò)增到目的條帶，這種結(jié)果表明，RPA 檢測(cè)方法可以實(shí)現(xiàn)與PCR 檢測(cè)方法相當(dāng)?shù)撵`敏度。

3.4 RPA 檢測(cè)方法的應(yīng)用效果

采用建立的RPA 檢測(cè)方法， 對(duì)50 份留樣樣品進(jìn)行檢測(cè)， 檢測(cè)結(jié)果表明，RPA 檢測(cè)方法與傳統(tǒng)增菌培養(yǎng)及生化鑒定結(jié)果完全一致，表明RPA 方法測(cè)定霍亂弧菌結(jié)果準(zhǔn)確，應(yīng)用效果良好。

4 討論

圖3 ompW 基因的RPA 檢測(cè)靈敏度

周廣彪、凌莉等[9，10]曾采用 RPA 技術(shù)建立針對(duì)擬態(tài)弧菌、創(chuàng)傷弧菌特異性基因的檢測(cè)方法，并對(duì)樣品進(jìn)行了應(yīng)用測(cè)試，結(jié)果表明該方法在靈敏度、特異性及應(yīng)用檢測(cè)等方面都能較好實(shí)現(xiàn)預(yù)期效果。 為測(cè)定RPA 檢測(cè)方法對(duì)其他致病菌的檢測(cè)效果，以更好應(yīng)用于水生動(dòng)物及其加工制品多種致病菌的檢測(cè)和監(jiān)控監(jiān)測(cè)，本研究進(jìn)行了霍亂弧菌的RPA 檢測(cè)的研究，并同時(shí)進(jìn)行了應(yīng)用效果的驗(yàn)證。

靈敏度及特異性是評(píng)價(jià)檢測(cè)方法優(yōu)劣的關(guān)鍵性參數(shù)，本研究建立的RPA 檢測(cè)方法特異性強(qiáng)，靈敏度與普通PCR 方法及LAMP 方法相當(dāng)， 但RPA 方法相比普通PCR 方法，反應(yīng)更為快速，且該方法無(wú)需依賴PCR 儀，更易滿足基層單位和現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的需要。 而相比于LAMP，RPA 技術(shù)的引物設(shè)計(jì)難度更小、產(chǎn)物片段單一，且便于后續(xù)進(jìn)行測(cè)序確證，因而具有更高的使用價(jià)值。

RPA 技術(shù)作為一種新興檢測(cè)手段，在發(fā)展過(guò)程中還存在一些地方需要完善，例如，試劑成本相對(duì)較高，對(duì)蛋白活性要求較高，且在電泳前需純化去除蛋白等。 但RPA 技術(shù)作為一種后起的核酸擴(kuò)增技術(shù)，由于其方便快捷、靈敏度高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，正被越來(lái)越多得用于病原體檢測(cè)及食品安全性檢測(cè)等領(lǐng)域，具有廣闊的技術(shù)發(fā)展及應(yīng)用前景。