纖維蛋白膠對骨再生作用的影響

吳怡蓉，謝志剛，鮑濟波

(昆明醫(yī)科大學附屬口腔醫(yī)院種植科，昆明 650000)

纖維蛋白膠(fibrin glue，F(xiàn)G)是在凝血級聯(lián)的最后一步由凝血酶對纖維蛋白原作用后形成的天然生物聚合物。1909年，Bergel[1]首次提出了纖維蛋白可以作為止血劑使用。1940年，纖維蛋白原被Young和Medawar[2]用作周圍神經吻合的黏合劑。1944年，Cronkite等[3]將牛纖維蛋白原和凝血酶混合成FG，用于皮膚移植，這是第一次提到牛凝血酶作為歐洲商業(yè)產品。到了20世紀70年代，大多數(shù)歐洲產品中都使用了病毒滅活的人凝血酶，1972年，Matras等[4]報道了用含有濃縮纖維蛋白原的FG進行神經吻合。1985年，Dresdale等[5]首次描述了用新鮮冰凍血漿和牛凝血酶混合制造FG。20世紀90年代，非商業(yè)形式的FG在美國應用廣泛，直到1998年，商用FG產品第一次被美國食品藥品管理局批準使用[6]。FG生物相容性、生物可降解性良好，可噴灑或滴注，且具有成膠速度快、易于操作以及粘合力中等的特性。目前，F(xiàn)G除在各類外科手術中用于局部止血、防止?jié)B透、防止粘連和促進愈合外，還可作為緩釋載體和骨移植材料的支架應用于骨組織工程[7-11]?，F(xiàn)就FG對骨再生作用的影響予以綜述。

1 FG的活性成分和成膠機制

1.1活性成分 FG主要由纖維蛋白原、凝血酶、凝血因子ⅩⅢ和鈣離子等活性成分組成。纖維蛋白原是一種由肝臟合成的具有凝血功能的蛋白質，能夠溶解于水，是凝血過程、血栓形成過程中的重要物質，相對分子量約為340 000，呈三聯(lián)球形，由α、β、γ三對不同的多肽鏈組成，兩端為D區(qū)，中間為E區(qū)，D區(qū)與E區(qū)通過3條呈α螺旋的肽鏈相連(圖1)；凝血酶是從人體或動物血液中提取的凝血酶原的蛋白水解酶，直接作用于血液凝固過程的最后一步，促使血漿中的可溶性纖維蛋白原轉變?yōu)椴蝗艿睦w維蛋白，加速傷口表面血液凝固，達到速效止血的目的，而且還能促進上皮細胞的有絲分裂，加速創(chuàng)傷愈合，是一種速效的局部止血藥[12]。凝血因子ⅩⅢ是血纖維蛋白穩(wěn)定因子，在鈣離子存在的情況下允許纖維蛋白交聯(lián)并形成穩(wěn)定不易碎的凝塊，還可幫助未分化的間充質干細胞在膠的高度交聯(lián)結構上向外遷移，并促進間充質干細胞增殖[13]。

Aα chain：Aα鏈；Bβ chain：Bβ鏈；γ chain：γ鏈；Central Domain：中心結構域；αC domain：αC 結構域；βC domain：βC 結構域；γC domain：γC 結構域；D Region：D區(qū)；E Region：E區(qū)；Coiled-coil：卷曲螺旋

1.2成膠機制 將纖維蛋白原、凝血因子ⅩⅢ、凝血酶和鈣離子等混合，模擬血液凝固過程的最后一個階段，凝血酶斷裂纖維蛋白原的2鏈(Aα,Bβ)而釋放酸性多肽A和B，使纖維蛋白原轉化為纖維蛋白單體，而各單體自發(fā)聚集成無橋鍵相連的多聚體；同時凝血酶激活凝血因子ⅩⅢ，激活的凝血因子ⅩⅢ在鈣離子的作用下催化各纖維蛋白單體間兩條γ鏈的谷氨酰胺殘基和賴氨酸的ε-氨基形成共價鍵，最終形成穩(wěn)定的纖維蛋白多聚體，呈一種十字交叉、多層、均勻的三維網狀結構，能夠網羅住紅細胞及有效成分，同時也為成纖維細胞和毛細血管的爬行及生長提供了生物支架[14]。

2 FG對成骨作用的影響

骨組織工程的三大重要組成包括合適的支架、種子細胞以及生長因子等活性成分。FG具有良好的生物相容性和生物可降解性，在骨再生修復中得到廣泛應用，可以用作支架材料、復合材料的涂層劑以及細胞、生長因子、基因、藥物或其他生物活性分子的載體[15-17]。FG中的生長因子可以刺激和促進組織修復，與其他成分(如骨移植材料、成骨細胞和生物活性分子)聯(lián)合應用時，可以改善單一材料的物理性能，提高其生物性能，對骨再生修復有積極作用。

2.1FG對細胞成骨作用的影響 FG可促進成骨過程中的成骨細胞或有成骨潛能的干細胞增殖、遷移、分化和礦化，為細胞提供初始基質，促進骨再生。Rao等[18]用纖維蛋白原和纖維蛋白處理鈦植入物表面，并在體外與人成骨細胞共培養(yǎng)，結果發(fā)現(xiàn)，經處理的鈦植入物的表面可促進更多的細胞增殖、黏附、基因表達和礦化?？赡苁抢w維蛋白原和纖維蛋白的加入增強了親水性和細胞相容性，使它們具有加速骨整合的能力。同時，有研究表明，在同樣成骨誘導條件下，與骨髓間充質干細胞和磷酸鹽緩沖液混合相比，骨髓間充質干細胞和FG混合誘導了更多的骨髓間充質干細胞向成骨細胞分化，獲得了更好的骨再生[19]。另一方面，Woo等[20]觀察到，與未添加FG相比，在硫酸鈣骨水泥中添加FG可促進成骨細胞的增殖和分化，且進一步提高了硫酸鈣骨水泥作為骨移植材料的可行性。另外，F(xiàn)G在骨再生中作為支架、載體或緩釋系統(tǒng)，具有修復組織的能力。Perumcherry等[21]首次將纖維蛋白均勻電紡成納米纖維，掃描電鏡圖像顯示形成了尺寸為50～500 nm的纖維支架，且該支架支持人臍血間充質干細胞的黏附、擴散和增殖。除纖維蛋白納米支架外，還有纖維蛋白納米管和纖維蛋白納米顆粒，可以通過水-肌醇乳化-擴散法制備[22]。這些結構表現(xiàn)出優(yōu)異的抗聚集性和高溫穩(wěn)定性，并具有以可控方式傳遞生長因子和緩慢釋放藥物的能力。Fujioka-Kobayashi等[23]將生長因子人骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)-9加入FG中與成骨細胞共培養(yǎng)，結果顯示，F(xiàn)G有極好的保留人BMP-9的能力，使人BMP-9在10 d內逐漸釋放，F(xiàn)G單一成分對成骨細胞分化的影響很小，但與人BMP-9聯(lián)合運用后，堿性磷酸酶活性增強，茜素紅染色增多，并且成骨細胞分化標志物堿性磷酸酶、骨唾液蛋白和骨鈣素的信使RNA水平均顯著升高。此外，F(xiàn)G還可作為藥物的緩釋劑。Kim等[24]利用牛骨粉和FG制備了一種載血管緊張素的支架，評估支架的結構、形態(tài)和力學性能以及血管緊張素的體外釋放曲線，結果顯示，骨粉在支架內均勻分布，血管緊張素在25 d內持續(xù)釋放，且釋放的血管緊張素可刺激細胞增殖和黏附，無細胞毒性。綜上，F(xiàn)G與細胞混合培養(yǎng)時表現(xiàn)出良好的生物相容性，不會引起炎癥反應，與細胞、骨移植材料和(或)生物活性分子聯(lián)合運用，能夠促進有成骨潛能的細胞黏附、增殖、遷移和分化，使生物活性分子緩慢釋放，延長作用時間，促進骨再生。

2.2FG植入動物體內后對成骨作用的影響 FG具有良好的生物學性能，常與細胞、骨移植材料和生長因子等復合后植入骨缺損的動物模型，作為細胞和生長因子的載體，提高細胞接種效率，減少顆粒狀骨移植材料的移位，加速骨組織的愈合。Park等[25]將包埋人骨髓間充質干細胞或牙囊間充質干細胞的FG注入脫鈣骨基質支架中，然后植入裸鼠皮下進行體內成骨實驗，證實了骨髓間充質干細胞和牙囊間充質干細胞的成骨能力以及FG作為細胞載體的可行性。同樣，Seebach等[26]的研究證實了FG對大鼠股骨缺損植入間充質干細胞的早期作用，如宿主細胞的募集、早期炎癥反應的調節(jié)、新血管的形成和骨組織再生等，F(xiàn)G可作為一種良好的載體用于組織工程。研究人員還將骨移植材料和(或)生物活性分子與FG混合，以達到加速骨修復的目的。例如，Cassaro等[27]研究了FG、雙相磷酸鈣和間充質干細胞在大鼠股骨缺損中的聯(lián)合再生能力，結果表明，F(xiàn)G有利于優(yōu)化手術過程，并且可以促進細胞黏附和增殖，是一種適合于骨缺損的支架材料。van der Stok等[28]用負載BMP-2的FG填充多孔鈦植入物，并將該生物材料用于修復大鼠股骨節(jié)段性骨缺損，結果發(fā)現(xiàn)，在單純鈦植入物及FG填充的鈦植入物填充缺損的對照組中骨再生沒有發(fā)生，換言之，F(xiàn)G本身并不能提高鈦植入物的骨再生潛能，而是作為BMP-2的載體，改善了骨修復過程。而Zhang等[29]則發(fā)現(xiàn)，將血管內皮生長因子/聚乳酸-乙醇酸/FG輸送到犬股骨缺損處，可以顯著改善血管重建以及骨愈合的質量和速度。同樣，Vila等[30]將纖維蛋白與血小板衍生生長因子和BMP-2混合后植入小鼠顱骨缺損處，結果顯示，與對照組相比，纖維蛋白介導的血小板衍生生長因子和BMP-2可改善血管生成，使血管更加豐富和粗大，可誘導更多的骨形成。還有學者發(fā)現(xiàn)，將以FG/纖維連接蛋白/肝素為基礎的BMP-2給藥系統(tǒng)植入大鼠顱骨缺損處后，BMP-2可穩(wěn)定釋放，給藥系統(tǒng)可顯著促進大鼠顱骨缺損模型的骨再生，表明FG可作為理想的緩釋劑應用于組織工程[31]。此外，F(xiàn)G還可用于基因治療，Li等[32]將聚丙交酯-乙交酯/FG負載脂質體/pDNA-轉化生長因子-β1與間充質干細胞復合組作為實驗組，將無纖維蛋白組作為對照組，其中聚丙交酯-乙交酯/FG復合物充當軟骨形成的支架，基因復合物脂質體/pDNA-轉化生長因子-β1均勻地分布于復合支架中，F(xiàn)G使基因緩慢釋放，且FG包裹骨髓間充質干細胞，有助于提高復合支架中的細胞負載密度；體內實驗結果表明，實驗組轉化生長因子-β1的表達水平顯著高于對照組，實驗組治療12周后，與正常軟骨組織相似的新組織修復軟骨全層缺損。這些研究均證實了FG植入動物體內后對成骨作用的積極影響。

但也有少量研究報道了FG在骨再生方面的負面影響。例如，Gerngross等[33]發(fā)現(xiàn)，在自體松質骨移植上添加FG，對綿羊模型脛骨皮質骨重建有負面影響。Lappalainen等[34]也發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)G與自體顆粒骨在修復兔顱骨缺損中可延遲骨礦化，但愈合情況仍優(yōu)于未植入任何材料的陰性空白對照組。分析副作用的原因可能是FG限制了血管在移植骨中的生長方面的潛在作用，或者FG作為一種空隙填充物阻止了天然纖維蛋白的形成。同樣，Carmagnola等[35]指出，在Bio-Oss顆粒中添加FG可使犬下頜骨缺損的骨與生物材料之間的組織接觸減少，與Bio-Oss單獨治療組相比，在Bio-Oss/FG治療組的骨缺損中未觀察到新骨形成，F(xiàn)G破壞了生物骨顆粒與骨組織的結合。還有學者指出，高濃度的纖維蛋白原(35～55 mg/mL)可能會阻礙細胞長入骨缺損處，導致骨愈合延遲[36]。

綜上，F(xiàn)G用于動物體內成骨時延遲骨愈合的原因，可能是FG用量不恰當或各組分的濃度不合適，導致骨組織與生物材料間的接觸減少，妨礙了生物骨顆粒與骨組織的結合或者限制了新生血管的長入。但是，F(xiàn)G聯(lián)合其他骨移植材料植入骨缺損區(qū)，并選擇合適的用量及配比，可以改善新生血管形成、提高骨愈合能力。因此，需要進一步研究FG的最適用量及各組分的濃度后，再植入FG與骨移植材料復合物，才能改善骨再生，加速骨愈合，否則可能適得其反。

3 FG對人口腔頜面部骨再生的影響

雖然FG植入動物體內改善骨愈合的觀點尚無定論，但仍有FG作為黏合劑、緩釋劑和支架與不同骨移植材料聯(lián)合應用于骨增量手術的報道。單獨運用FG時，由于機械強度較差以及降解速度與骨再生速度不完全匹配，故不足以維持骨再生過程中所需的空間。臨床上多將FG加入其他骨移植材料用于骨增量手術，這樣既保持了骨移植材料的骨傳導和空間維持作用，又能使FG充分發(fā)揮緩慢釋放生長因子及促進細胞遷移的作用，進而改善骨愈合，增強骨再生。將FG與骨移植材料聯(lián)合運用，證實了加入FG后的骨移植材料更易于臨床操作，且不容易移位[37-38]。FG作為顆粒狀骨移植材料之間的生物連接物，將顆粒黏合在一起，可提高臨床操作效率，而且纖維蛋白網絡能促進細胞遷移，這是新生血管形成、血管化和移植材料成骨所必需的。Giannini等[39]將5例使用自體骨碎片和纖維蛋白血小板膠混合物行骨重建手術患者的結果與20例具有相同手術指征未使用纖維蛋白血小板膠患者的結果進行比較，結果表明，自體骨碎片和纖維蛋白血小板膠的混合物有利于改善骨再生，減少感染，且可縮短住院時間。Tayapongsak等[40]指出，使用自體FG治療人下頜骨缺損，加速了血運重建，并刺激了成纖維細胞和成骨細胞的生長。Segura-Castillo等[41]也發(fā)現(xiàn)，在治療牙槽裂時使用FG，移植骨吸收顯著減少，F(xiàn)G在移植材料與正常骨之間形成橋，通過促進細胞遷移改善移植材料的整合。因自體骨移植應用具有局限性，出現(xiàn)了其他骨替代材料與FG聯(lián)合應用的情況。例如，Reppenhagen等[42]使用雙相陶瓷(60%羥基磷灰石和40%β-磷酸三鈣)結合FG，對51例良性骨腫瘤或腫瘤樣病變刮除后的缺損進行修復，結果50例患者在56個月后骨缺損均完全愈合，且術后未見骨折，組織學分析顯示新骨形成，表明植入材料具有良好的生物相容性和骨整合性，雙相陶瓷結合FG是一種有效的骨移植替代物，可降低供區(qū)并發(fā)癥的發(fā)生率。同時，有學者將自體細胞加載到FG復合的陶瓷顆粒上，治療8例低位肱骨近端骨折患者，治療期間無不良反應，12個月后對修復組織進行活檢，發(fā)現(xiàn)骨形成，表明復合材料有良好的生物相容性[43]。此外，F(xiàn)G還可將抗生素高效輸送至所需位置。Tofuku等[44]報道指出，使用FG包裹的抗生素，可顯著降低接受骨科手術患者深部手術部位感染的發(fā)生率，在未使用FG治療的188例患者中有11例患者深部手術部位感染，而在196例使用FG包裹抗生素的患者中無一例深部手術部位感染。這可能是由于FG作為緩釋系統(tǒng)使抗生素緩慢釋放，延長了抗生素的作用時間。

近年來，將黏性骨應用于臨床骨增量手術，并取得了良好的成骨效果。黏性骨是自體FG和骨移植材料的混合物，術中易于操作，可以塑造成所需的形狀，防止骨移植材料分散，而且自體FG富含各種生長因子，十分有利于骨再生；另外，黏性骨還可以在不使用任何骨釘或鈦網的情況下，將移植材料穩(wěn)定到骨缺損處，從而加速骨組織愈合[45]。Joshi等[46]用異體牙顆粒聯(lián)合自體FG治療上頜右尖牙區(qū)牙槽嵴缺損，臨床和放射學結果均證實，牙槽骨寬度和高度有顯著增加。在另一項研究中，Dhanaraj[47]用自體FG和異質骨混合成黏性骨，并將黏性骨置于去除的舊種植體與新植入種植體之間的骨缺損處，治療期間因植入物壓迫引起了下頜神經疼痛，結果術后1個月疼痛完全消失，6個月后行種植義齒修復效果良好，表明黏性骨可以促進新骨的形成，對組織愈合產生積極作用。因此，臨床上可將FG與其他骨移植材料聯(lián)合應用于骨增量手術，既可縮短臨床操作時間，穩(wěn)定骨移植材料，又可為細胞遷移提供支架，使生長因子緩慢釋放，加速新生血管形成的同時促進骨再生，為骨組織工程提供了一種更有效的骨移植材料。

4 小 結

FG在骨形成過程中具有促進細胞遷移、增殖、分化和礦化的作用。然而，F(xiàn)G單一成分對成骨作用不顯著，往往需要聯(lián)合其他骨移植材料和(或)生物活性分子，作為支架、傳遞系統(tǒng)和(或)緩釋劑運用于骨組織工程。這種組合可以改善單一材料的物理性能，使生長因子緩慢釋放，促進新生血管的形成和骨組織的愈合。臨床應用時還能將骨移植材料穩(wěn)定在骨缺損處，縮短操作時間，獲得良好的成骨效果。在未來，F(xiàn)G還有很大的發(fā)掘空間，纖維蛋白原和凝血酶作為FG的重要活性成分，其最佳作用濃度以及FG與其他生物材料或生物活性分子的最佳運用配比，仍需深入研究。