響應(yīng)面法優(yōu)化超聲提取雞血藤總黃酮

梁燕妮，劉平江，丘觀玲

(1.2.3.梧州學(xué)院，廣西 梧州 543002)

中藥材雞血藤(Millettiadielsiana)是豆科植物密花豆干燥的藤莖，又稱(chēng)血藤、血風(fēng)藤、九層風(fēng)等[1-3]。雞血藤是傳統(tǒng)的中藥材，在歷代的本草著作中均有記載[4]。雞血藤作為桂藥之一，在廣西有著極大的生產(chǎn)量，在廣東、云南、貴州等地也有種植[5]。雞血藤中的主要活性成分為黃酮類(lèi)物質(zhì)[6-7]。臨床試驗(yàn)證明，雞血藤中的黃酮類(lèi)化合物具有抗腫瘤、抗病毒、降血脂等作用[8]。近年來(lái)，學(xué)者們對(duì)于雞血藤的研究不斷深入，但在提取雞血藤中有效成分方面所取得的成果并不多。利用現(xiàn)代提取技術(shù)提取雞血藤有效成分是現(xiàn)今研究的重點(diǎn)。本試驗(yàn)將通過(guò)超聲提取技術(shù)對(duì)雞血藤總黃酮進(jìn)行提取，運(yùn)用響應(yīng)面法對(duì)雞血藤總黃酮提取的工藝進(jìn)行優(yōu)化，并確定其最佳工藝。

1 材料與儀器

雞血藤、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品、亞硝酸鈉、無(wú)水乙醇、氫氧化鈉(試劑均為AR級(jí))，752N型分光光度計(jì)、中藥粉碎機(jī)、電子天平、SB-5200D型超聲清洗機(jī)等。

2 試驗(yàn)方法

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱(chēng)取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品10.00 mg，用體積分?jǐn)?shù)40%的乙醇溶解，定容至50 mL，搖勻，即獲得質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液。準(zhǔn)確量取上述蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL，置于已編號(hào)碼的10 mL容量瓶中，加入0.3 mL 5%亞硝酸鈉溶液，搖勻靜置6 min；加入0.3 mL 10%硝酸鋁溶液，搖勻靜置6 min；加入4 mL 4%氫氧化鈉溶液，搖勻，最后用30%乙醇定容至刻度，靜置15 min。將波長(zhǎng)調(diào)至510 nm處，測(cè)定各濃度吸光度值。以吸光度A為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度C為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=9.918 6X-0.005 1，R2=0.999 5。線性關(guān)系良好。

2.2 雞血藤總黃酮的提取

準(zhǔn)確稱(chēng)取雞血藤粉末0.25 g，加入50 mL三角瓶中，在一定條件下(料液比、超聲時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù))進(jìn)行超聲提取，然后置于離心機(jī)內(nèi)離心，取上清液測(cè)定吸光度[9]。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算總黃酮含量，并計(jì)算總黃酮的提取率。

2.3 單因素試驗(yàn)

2.3.1 超聲時(shí)間。準(zhǔn)確稱(chēng)取雞血藤粉末0.25 g共6份，按料液比1∶40加入體積分?jǐn)?shù)為40%的乙醇。分別超聲提取20，30，40，50，60，70 min，探討超聲時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的影響。

2.3.2 料液比。準(zhǔn)確稱(chēng)取雞血藤粉末0.25 g共6份，按料液比1∶20，1∶30，1∶40，1∶50，1∶60，1∶70，加入體積分?jǐn)?shù)為40%的乙醇溶液，超聲提取40 min。研究料液比對(duì)總黃酮提取率的影響。

2.3.3 乙醇體積分?jǐn)?shù)。稱(chēng)取雞血藤粉末0.25 g共6份，按料液比1∶40分別加入20%、30%、40%、50%、60%、70%的乙醇溶液，超聲提取40 min。探討乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)總黃酮提取率的影響。

2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，確定Box-Behnken設(shè)計(jì)的自變量，以總黃酮提取率為響應(yīng)值，運(yùn)用統(tǒng)計(jì)軟件Design Expert 8.0.6，根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，設(shè)計(jì)3因素3水平響應(yīng)面分析方案，以確定最佳提取工藝參數(shù)。響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

3 結(jié)果與分析

3.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

3.1.1 超聲時(shí)間對(duì)雞血藤總黃酮提取率的影響。由圖1可見(jiàn)，曲線呈現(xiàn)出先增后減的趨勢(shì)，這表明總黃酮的提取率受到超聲時(shí)間的影響，隨超聲時(shí)間的變化而變化。當(dāng)超聲時(shí)間為20～40 min時(shí)，總黃酮提取率隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)而增加；超聲時(shí)間為40 min時(shí)，曲線達(dá)到最高點(diǎn)，此時(shí)提取率最高。此后，隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，總黃酮提取率則逐漸緩慢降低。分析原因可能是由于超聲波的作用使藥粉細(xì)胞內(nèi)的黃酮化合物逐漸溶出，在一定超聲時(shí)間內(nèi)，溶出量逐漸增加；但是超聲時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，藥粉中的黃酮類(lèi)物質(zhì)也會(huì)因超聲作用分解，影響了總黃酮的提取率，提取率降低[10-11]。因此最適的超聲時(shí)間考察范圍為30～50 min。

圖1 超聲時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的影響

3.1.2 料液比對(duì)雞血藤總黃酮提取率的影響。由圖2可見(jiàn)，當(dāng)料液比為1∶20～1∶50時(shí)，提取率的大小隨著料液比的增大而增加。料液比為1∶50時(shí)，提取率達(dá)到最大；繼續(xù)增加料液比，總黃酮的提取率則緩慢下降?？赡苡捎谠谝欢康姆勰┲校S酮類(lèi)物質(zhì)是一定的，料液比的增加也只是增加了溶劑的量，當(dāng)溶劑達(dá)到一定量時(shí)，溶入溶劑的黃酮類(lèi)物質(zhì)達(dá)到了平衡，不會(huì)隨著料液比的增加而上升[12-13]；在此之后，繼續(xù)增加料液比會(huì)增加雜質(zhì)的溶出量，使總黃酮提取率反而變小。

圖2 料液比對(duì)總黃酮提取率的影響

3.1.3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)雞血藤總黃酮提取率的影響。由圖3可見(jiàn)，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為20%～40%時(shí)，曲線呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，說(shuō)明溶入溶劑中的黃酮類(lèi)物質(zhì)逐漸增加，提取率上升；當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%時(shí)提取率達(dá)最大值。因溶劑乙醇的極性隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)上升而增大，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%時(shí)，溶劑的極性與樣品中黃酮類(lèi)化合物的極性十分相似，黃酮類(lèi)物質(zhì)的溶出率最高，總黃酮的提取率也達(dá)到最大值；此后，繼續(xù)增加乙醇體積分?jǐn)?shù)，使極性增加，但總黃酮提取率反而降低，其原因可能是雞血藤中所含有的糖類(lèi)物質(zhì)、脂溶性物質(zhì)以及粘稠性的物質(zhì)會(huì)在高體積分?jǐn)?shù)的乙醇大量析出，從而對(duì)粉末中黃酮類(lèi)物質(zhì)的溶出造成影響，使總黃酮提取率下降[14]。因此，最適的乙醇體積分?jǐn)?shù)考察范圍為30%～50%。

圖3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)總黃酮礙率的影響

3.2 響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝

3.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果。根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以雞血藤黃酮提取率為響應(yīng)值，以超聲時(shí)間、料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)為自變量，進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

3.2.2 建立擬合回歸模型方程。通過(guò)Design-Expert8.0.6軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到響應(yīng)面二次多項(xiàng)回歸模型方程：

Y=6.23+0.054A+0.056B+0.10C-0.050AB+0.0025AC-0.057BC-0.16A2-0.016B2-0.18C2。

其中，A為超聲時(shí)間，B為料液比，C為乙醇體積分?jǐn)?shù)。

3.2.3 回歸模型方差分析。根據(jù)表2的數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表3。

由表3可知，模型P=0.000 1<0.01，表明該模型極顯著。失擬項(xiàng)P=0.123 1>0.05，模型失擬項(xiàng)不顯著，說(shuō)明本試驗(yàn)無(wú)其他因素影響。模型的決定系數(shù)R2=0.973 3，說(shuō)明此模型可以解釋97.33%的響應(yīng)值變化。該模型擬合度較好，試驗(yàn)誤差小，可以使用此模型進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)超聲輔助提取雞血藤總黃酮提取率各因素的影響。

表3 回歸模型方差分析

比較各F值可知，A、B、C3個(gè)因素對(duì)總黃酮提取率的影響由大到小排列如下：C>B>A；一次項(xiàng)中，A、B顯著，C項(xiàng)極顯著，交互項(xiàng)BC對(duì)總黃酮提取率的影響顯著，AB、AC項(xiàng)不顯著；模型純誤差的均方為1.02×103。由此可知，各因素對(duì)響應(yīng)值的影響并不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。

3.2.4 兩因素交互作用對(duì)總黃酮提取率的影響。圖4為超聲時(shí)間與料液比的等高線及響應(yīng)面圖。等高線圖反映出：總黃酮的提取率隨著超聲時(shí)間增加，表現(xiàn)出先增加后降低的趨勢(shì)，料液比的改變對(duì)總黃酮提取率的影響也如此。當(dāng)超聲時(shí)間為40 min，料液比1∶50時(shí)，總黃酮的提取率達(dá)到最大值；比較料液比與超聲時(shí)間變化曲面，料液比坡度較陡，表明出料液比對(duì)總黃酮提取率影響較大，此結(jié)果與回歸方程的結(jié)果一致。在三維空間曲面圖中，料液比軸向等高線稍密集，表明料液比對(duì)雞血藤總黃酮提取率的影響較大；超聲時(shí)間軸向等高線稍稀疏，說(shuō)明超聲時(shí)間對(duì)于提取率的影響較小。

圖4 超聲時(shí)間與料液比的等高線及響應(yīng)面圖

圖5為超聲時(shí)間與乙醇體積分?jǐn)?shù)的等高線及響應(yīng)面圖。由圖5可見(jiàn)，雞血藤總黃酮提取率隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)及超聲時(shí)間的改變而表現(xiàn)出先增后降的趨勢(shì)，但乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)提取率的影響較大；響應(yīng)面三維圖中，超聲時(shí)間這一變化曲面坡度較緩，表明超聲時(shí)間對(duì)于提取率的影響較小。

圖5 超聲時(shí)間與乙醇體積分?jǐn)?shù)的等高線及響應(yīng)面圖

圖6為料液比與乙醇體積分?jǐn)?shù)的等高線及響應(yīng)面圖，由圖6可見(jiàn)，乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)雞血藤總黃酮的提取率影響較大。

圖6 料液比與乙醇體積分?jǐn)?shù)的等高線及響應(yīng)面圖

3.2.5 最佳工藝條件的預(yù)測(cè)與驗(yàn)證。將單因素試驗(yàn)所得出的結(jié)果，用響應(yīng)面分析軟件進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)并進(jìn)行試驗(yàn)；將試驗(yàn)結(jié)果輸入軟件中進(jìn)行響應(yīng)面分析，確定出超聲輔助提取雞血藤總黃酮的最佳提取條件。最優(yōu)工藝參數(shù)為超聲提取時(shí)間40.95 min、料液比1∶52.18、乙醇體積分?jǐn)?shù)為40.45%，此條件下總黃酮提取率理論值為6.24%?？紤]到實(shí)際試驗(yàn)操作的可行性，在對(duì)提取率影響不大的情況下，對(duì)提取工藝進(jìn)行修正，修正后的工藝條件為超聲時(shí)間41 min，料液比1∶52，乙醇體積分?jǐn)?shù)41%。采用修正后的工藝條件進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果總黃酮提取率為6.19%，相對(duì)誤差約為0.8%，說(shuō)明所建立的數(shù)學(xué)模型具有較好的可靠性，響應(yīng)面法優(yōu)化雞血藤總黃酮提取的工藝條件可行。

4 結(jié)論

對(duì)雞血藤總黃酮的提取，一直是眾多學(xué)者所研究的課題。近年來(lái)，作為現(xiàn)代提取技術(shù)之一的超聲提取技術(shù)被廣泛應(yīng)用于中藥材有效成分的提取中。為了提高雞血藤藥材中有效成分的提取率，本試驗(yàn)采用超聲波輔助提取，響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝條件。先選擇影響提取率較大的3個(gè)因素：超聲時(shí)間、料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)進(jìn)行單因素試驗(yàn)；得到各單因素提取總黃酮的較優(yōu)條件范圍，將優(yōu)化后的參數(shù)進(jìn)行響應(yīng)面分析，建立二次多元回歸模型方程。利用回歸方程，得到提取雞血藤總黃酮的最佳工藝參數(shù)為超聲時(shí)間40 min，料液比1∶52，乙醇體積分?jǐn)?shù)41%，在此條件下實(shí)際測(cè)得雞血藤總黃酮的提取率為6.19%。