草甘膦農(nóng)藥對斑馬魚的急性毒性和慢性毒性研究*

廖藝鈺，惠呂佳，嚴吉祥，計偉佳，陳夏偉，楊華云

(杭州師范大學錢江學院，浙江 杭州 310018)

隨著社會現(xiàn)代化的不斷發(fā)展，各種污染物大量地進入水體環(huán)境，農(nóng)藥作為一種十分常見的污染物，是水域安全評價的重要指標。作為有機氯農(nóng)藥的替代品，有機磷農(nóng)藥在我國使用量非常大。該類農(nóng)藥是一類高效經(jīng)濟的常用殺蟲殺螨劑，但其利用率非常低，約在20%左右，剩下的80%則全部進入環(huán)境中。經(jīng)過生物富集與食物鏈的傳遞和逐級濃縮、放大等作用，有機磷農(nóng)藥對生物和人類的健康以及環(huán)境造成很大的危害。通過河流、大氣工業(yè)排放等方式，有機磷農(nóng)藥一般最終將匯入海洋，因此海洋成為了有機磷的最終歸宿。然而，大多數(shù)海洋生物對有機磷農(nóng)藥十分敏感，因此引發(fā)大量的魚、蝦、貝等的大量死亡，危及了非靶生物的生存，導致海洋動物數(shù)量劇減，甚至滅絕，威脅到海水養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展[1]。草甘膦對人和土壤生物等均有不同程度的毒性，但目前關于這種除草劑對水生態(tài)危害的報道較少，研究斑馬魚對這種除草劑的響應，旨在引起人們關注水生態(tài)中除草劑的安全問題，并為其合理施用提供科學依據(jù)。本文以斑馬魚作為模式生物，研究有機磷農(nóng)藥對斑馬魚的急性毒性以及慢性毒性的影響，以期得到有機磷農(nóng)藥對斑馬魚的毒性效應，為保障居民身體健康以及環(huán)境保護提供理論依據(jù)。

1 實 驗

1.1 材 料

作為國際標準化組織推薦的實驗魚種，斑馬魚購于杭州某花鳥市場，平均體長1～2.5 cm，體重100～400 mg。草甘膦農(nóng)藥標準品購于國家標準物質中心，實驗時需要現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2 實驗方法

1.2.1 急性毒性實驗

(1)斑馬魚預先購買放置在實驗室內(nèi)馴養(yǎng)7 d，每24 h喂食一次，實驗用水為實驗室蒸餾水，目的是排除氯離子的干擾，并同時使用增氧泵，保證溶解氧≥5.0 mg/L，試驗用水溫度控制在(25±1)℃，試驗前兩天停止喂食。

(2)經(jīng)過預實驗，確定各實驗藥物的質量濃度范圍(96 h全活質量濃度上限和96 h全致死質量濃度下限)后，在室溫條件下，在長寬高為20×17×15(cm)的魚缸中，按一定的間距設置不同的濃度梯度組，試驗共五組，一組空白對照組，采用靜態(tài)實驗法，開展單一有機磷農(nóng)藥對斑馬魚的急性毒性實驗。每個濃度梯度放置10尾實驗動物，各魚缸中溶液的體積均為2 L，連續(xù)觀察受試對象的活動狀態(tài)，以用鑷子觸碰魚頭部5 s以上完全無反應作為死亡判斷標準，及時取出死亡個體，分別記錄24 h，48 h，72 h，96 h的死亡數(shù)量，計算一次的總體平均死亡率。

(3)數(shù)據(jù)處理

采用寇氏法[2]計算斑馬魚的半致死濃度LC50：

LogLC50=Xm-d(∑P-0.5)

安全質量濃度SC按以下公式計算：

SC=48 h LC50×0.3/(24 h LC50/48 h LC50)2

1.2.2 慢性毒性實驗

(1)斑馬魚的馴養(yǎng)過程和急性毒性實驗的馴養(yǎng)過程相同，試驗前兩天停止喂食，根據(jù)急性毒性實驗的結果，設置5個不同濃度梯度的實驗組，一個空白對照組，每個濃度梯度放置10尾魚。采用靜態(tài)實驗法，分別于1 d，7 d，14 d后采集樣本。

(2)酶的測定

分別在7 d、14 d時，在每缸中取5尾實驗動物，在冰塊上冰麻后稱量其體重，放入勻漿管中，再按照體重49倍加入生理鹽水進行勻漿，充分研碎，使組織勻漿化。將配制好的勻漿用離心機1500 r/min進行離心10 min，離心后取上清液放入1 cm光徑比色皿，于412 nm處使用分光光度計測量其吸光度，空白管用來調零，測各管的吸光度。同標準乙酰膽堿酯酶溶液對比后并計算酶活。

(3)標準曲線配制

精確量取乙酰膽堿酯酶的標準液，分別制得0、0.2、0.4、0.6、1 ppm的酶溶液，以酶濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線如圖1所示。得到標準曲線為Y = 0.3599x-0.0046，相關系數(shù)R2=0.9967。實驗以此標準曲線為準。

圖1 乙酰膽堿酯酶標準曲線

(4)數(shù)據(jù)處理

酶活計算公式：

式中：ΔA412為反應前后吸光度的差值；V為反應體系總體積；ε為產(chǎn)物的摩爾吸光系數(shù)；T為反應時間；d為比色皿寬。

2 結果與討論

2.1 斑馬魚急性毒性實驗試驗結果

草甘膦對斑馬魚的急性毒性實驗結果表明：草甘膦濃度達到2.0 mg/gL以上時，24 h內(nèi)試驗魚全部死亡；草甘膦的濃度達到3.0 mg/gL時，2 h內(nèi)個別魚開始出現(xiàn)側翻，身體不平衡的現(xiàn)象，8 h后在底部掙扎，嚴重失衡，12 h內(nèi)全部死亡。隨著時間的推移，各個濃度的魚都有出現(xiàn)個別死亡。草甘膦對斑馬魚的毒性比較強，斑馬魚剛開始出現(xiàn)急躥現(xiàn)象，而且伴有集群現(xiàn)象，但很快就消失，稍后魚群都聚集在水底。隨著中毒程度的加深，魚出現(xiàn)了身體不平衡、顫抖或者游動緩慢，身體開始立于水中，出現(xiàn)了反應遲鈍，張口喘氣等中毒現(xiàn)象，最后鰓部充血死亡，腹部朝上浮在水面上，或者以側躺的姿勢沉在水底。濃度高的組別從開始試驗、中毒到死亡時間更短，中毒效果也更加明顯。

2.2 斑馬魚對草甘膦急性毒性的LD50和安全濃度的評價

斑馬魚對草甘膦急性毒性的半致死濃度和安全濃度如表1所示。根據(jù)國家環(huán)保局發(fā)布的毒性分類標準[3]，急性毒性96h LC50<0.1 mg/L為劇毒，0.1～1.0 mg/L為高毒，1.0～10.0 mg/L為中毒，>10.0 mg/L為低毒。本實驗結果表明，草甘膦的96h LC50為0.879 ppm，屬于高毒農(nóng)藥。草甘膦是目前使用最廣泛、用量最大的除草劑種類之一，如此高毒性農(nóng)藥的大量使用并在環(huán)境中大量殘留會給環(huán)境帶來了巨大的潛在風險。有研究表明近年其主要用于治理河塘、湖泊中的水生雜草，在水中的殘留會對魚類的生存產(chǎn)生較大的危害[4]。

表1 草甘膦對斑馬魚的LD50和SC

2.3 斑馬魚對草甘膦慢性毒性試驗的結果

有機磷農(nóng)藥對乙酰膽堿酯酶酶活性的影響見圖2。從圖2可以看出，隨著時間的推遲，乙酰膽堿酯酶的酶活會持續(xù)降低且濃度越高，乙酰膽堿酯酶的酶活越低。但隨著時間的無限延長，乙酰膽堿酯酶的酶活下降幅度會逐漸減少，并穩(wěn)定在一個確定值范圍內(nèi)，直至生物體死亡。高濃度有機磷農(nóng)藥的使用將使得水生生物出現(xiàn)大批量的死亡現(xiàn)象，即使?jié)舛容^低，毒素也會在生物體內(nèi)滯留，并影響其正常新陳代謝，經(jīng)過生物放大作用，甚至影響人類健康，但同時經(jīng)過實驗研究以及對文獻的分析，發(fā)現(xiàn)如今水生生物已經(jīng)對有機磷農(nóng)藥出現(xiàn)了抗性，且不同水域的抗性不盡相同[5-6]。Modesto等[7]研究發(fā)現(xiàn)，草甘膦制農(nóng)藥能對魚類產(chǎn)生毒害作用，具體表現(xiàn)為：血液中的血球容積增大，體內(nèi)的抗氧化酶活性改變，紅細胞和白細胞數(shù)量增加。Lajmanovich等[8]報道，草甘膦對水生動物魚、蝦、青蛙、蝌蚪等產(chǎn)生毒害，草甘膦農(nóng)藥在施藥48 h后降低青蛙體內(nèi)乙酰膽堿脂酶和谷胱甘肽酶活性，且3.80 mg/L草甘膦可使蝌蚪大量死亡。劉曉偉等[9]也研究表明，低濃度的草甘膦對多刺裸腹溞具有毒性，LC50(48 h)=26.29 mg/L。

圖2 有機磷農(nóng)藥對乙酰膽堿酯酶酶活性的影響

3 結 論

我國是產(chǎn)糧、用糧大國，農(nóng)藥的使用問題一直以來都是國民關心的重要問題。而農(nóng)藥本身的安全性與使用上的科學性的提升是對我國現(xiàn)階段的發(fā)展來說至關重要的因素。本實驗以斑馬魚為模式生物，嘗試性地探究有機磷類農(nóng)藥草甘膦在斑馬魚身上的急性與慢性毒性效應。急性毒性結果表明，草甘膦屬于高毒農(nóng)藥，其96 h LC50為0.879 mg/L；慢性毒性表明，草甘膦農(nóng)藥會顯著得抑制乙酰膽堿酯酶的活性。那么對于草甘膦農(nóng)藥的使用，給出以下建議：在進行農(nóng)藥施藥時，不要逆風和在大風天以及高溫時段噴藥，在保證農(nóng)藥適用范圍之外，減少農(nóng)藥的污染面積，以及高溫揮發(fā)對空氣的污染，特別是環(huán)湖邊的農(nóng)田尤其不要再大風時候施藥。同時應該嚴格控制農(nóng)田中高農(nóng)藥的使用情況以及在使用過程中時刻觀察附近生物的活動情況。