響應(yīng)面法優(yōu)化半夏總黃酮的提取工藝*

陳 亮，孫德妹 ，丁 嵐,2，劉 映,2

(1 南華大學(xué)藥學(xué)院藥學(xué)系，湖南 衡陽 421001；2 湖南省分子靶標(biāo)新藥研究協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南 衡陽 421001)

半夏，天南星科植物，其拉丁名為 Pinellia ternate (Thumb.) Breit.。半夏是我國用藥歷史超千年的傳統(tǒng)中藥，其干燥塊莖經(jīng)炮制后具有散瘀止痛、解毒消腫、治療跌打勞傷等功效[1-4]，經(jīng)現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，其還具有抗心律失常、催吐、抗腫瘤、抗?jié)儭⒅委煿谛牟?、祛痰、止咳、抗血凝等藥理作用[5-8]。半夏的藥理活性廣泛，成分復(fù)雜，研究表明其含有大量的多糖、淀粉、β-谷甾醇、生物堿、植物凝集素、葡萄糖苷等。近年來，分離與檢測(cè)技術(shù)的不斷發(fā)展，研究者從半夏中又分離得到多種成分，如大黃酚、5-羥甲基糠醛、豆甾-5-烯、甘油酯等[9-10]，但是對(duì)于半夏中黃酮的含量及提取方法還鮮有研究。研究者使用薄層板對(duì)清半夏的醇提液進(jìn)行點(diǎn)樣跑板分析，發(fā)現(xiàn)其含有總黃酮類化合物，在上述基礎(chǔ)之上，本文利用清半夏作為原料，使用響應(yīng)面法考察了乙醇浸提法提取半夏中總黃酮時(shí)不同因素對(duì)于提取率的影響，優(yōu)化了半夏中總黃酮類物質(zhì)的乙醇浸提工藝，旨在為半夏的資源開發(fā)及利用提供理論指導(dǎo)。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 材料與儀器

清半夏，購自張仲景大藥房；蘆丁(標(biāo)準(zhǔn)品，100080-200707)，中國藥品生物制品檢定所；乙醇(AR)、亞硝酸鈉(AR)、氫氧化鈉(AR)、硝酸鋁(AR)，天津市大茂化學(xué)試劑廠。

UV-1750紫外可見分光光度計(jì)，日本島津；SY-1220恒溫水浴槽，上海珂淮儀器有限公司；MS105DU電子天平，梅特勒。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定

精密稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，用30%的乙醇溶液將其溶解定容至0.1 mg/mL、0.2 mg/mL、0.3 mg/mL、0.4 mg/mL、0.5 mg/mL，加入5% NaNO2溶液，搖勻，靜置6 min；之后加入10%的Al(NO3)3溶液，搖勻，靜置6 min；隨后加入4%的氫氧化鈉并用30%的乙醇定容，靜置后在510 nm處測(cè)吸光度[11-13]。根據(jù)數(shù)據(jù)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并得出線性回歸方程為y=10.386x+0.012，R2=0.9994。

1.2.2 總黃酮提取工藝及含量測(cè)定

將半夏洗凈，烘干至恒重，粉碎后過100目篩，干燥備用。稱取1 g處理后的半夏，選取不同的乙醇濃度、料液比、提取時(shí)間和溫度進(jìn)行提取，過濾后將濾液旋干至固體，隨后用30%的乙醇溶解定容，按照1.2.1的方法測(cè)定溶液吸光度值，根據(jù)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算粗提物中總黃酮含量，并按下面的公式計(jì)算總黃酮的提取率[14-17]。

提取率Y=[(C×V×D/W)1000]×100%

式中，C為提取液中蘆丁的濃度，g/mL；V為抽濾后獲得的各浸提樣本的總體積mL；D為稀釋倍數(shù)；W為稱取的半夏粉末質(zhì)量，g。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 乙醇濃度對(duì)半夏總黃酮提取率的影響

將提取溫度和提取時(shí)間分別設(shè)定為60 ℃及2 h，料液比設(shè)定為1:30(g/mL)，采用乙醇浸提法來考察不同的乙醇濃度(40%、50%、60%、70%、80%)對(duì)提取率的影響，結(jié)果見圖1。

圖1 乙醇濃度對(duì)半夏總黃酮提取率的影響

由圖1可知，當(dāng)乙醇濃度為40%～60%時(shí)，總黃酮提取率會(huì)隨著乙醇濃度的增大而增加；當(dāng)乙醇濃度大于60%時(shí)，總黃酮提取率達(dá)到了最大值，隨后，隨著乙醇濃度的增加，提取率趨于平緩甚至有所下降?？赡苁?0%乙醇濃度下半夏中總黃酮的溶解度更好，考慮到提取工藝中黃酮提取率及提取成本等綜合因素，最終選擇乙醇濃度為60%。

2.1.2 料液比對(duì)半夏總黃酮提取率的影響

結(jié)合前面的結(jié)果，將乙醇濃度設(shè)定為60%，提取時(shí)間和提取溫度分別設(shè)定為60 ℃及2 h，在此條件下考察不同的料液比1:10、1 :20、1 :30、1 :40、1:50(g/m L)對(duì)半夏中總黃酮提取率的影響，結(jié)果如圖2所示。

圖2 料液比對(duì)半夏總黃酮提取率的影響

由圖2可知，提取率會(huì)先隨著料液比的增加而提高，然后提取率達(dá)到峰值，之后提取率會(huì)隨著料液比的繼續(xù)增加而降低。料液比為1:40時(shí)黃酮的提取率最大。

2.1.3 半夏黃酮類化合物提取率受提取溫度的影響

基于前期的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，將乙醇濃度設(shè)定為60%，料液比設(shè)為1:40 (g/mL)，提取時(shí)間為2 h，考察不同的提取溫度40、50、60、70、80 ℃對(duì)半夏中總黃酮提取率的影響。結(jié)果如圖3所示，提取率會(huì)先隨著溫度的增長而提高，60 ℃時(shí)黃酮的提取率達(dá)到峰值，隨后，隨著溫度的增加，提取率的增加不明顯。分析可能是溫度的升高有利于半夏中總黃酮物質(zhì)的溶出，在短時(shí)間內(nèi)可以達(dá)到固態(tài)平衡，從而提高其提取率；而另一方面，溫度的升高也會(huì)加速總黃酮物質(zhì)的氧化、縮合、降解等反應(yīng)，從而降低其提取率?？紤]到提取率及提取時(shí)的經(jīng)濟(jì)性及安全性，選擇溫度為60 ℃。

圖3 提取溫度對(duì)半夏總黃酮提取率的影響

2.1.4 半夏總黃酮提取率受時(shí)間的影響

基于前面的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，將乙醇濃度設(shè)定為60%，料液比設(shè)為1:40 (g/mL)，提取溫度設(shè)定為60 ℃，考察不同的提取時(shí)間1、2、3、4、5 h對(duì)半夏中總黃酮提取率的影響，結(jié)果見圖4。

由圖4可知，提取率會(huì)先隨著時(shí)間的增加而增加，然后提取率達(dá)到峰值，之后提取率會(huì)隨著時(shí)間的繼續(xù)增加而降低。3 h時(shí)其提取率最大，有可能是隨著時(shí)間的增加，部分黃酮類物質(zhì)發(fā)生降解，致使提取率降低。

圖4 提取時(shí)間對(duì)半夏總黃酮提取率的影響

2.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)

2.2.1 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

按照以下的因素水平表(表1)，通過Design-Expert 8.0軟件對(duì)本次實(shí)驗(yàn)進(jìn)行設(shè)計(jì)與結(jié)果的統(tǒng)計(jì)，見表2，并分析數(shù)據(jù)結(jié)果[18-19]。

表1 因素水平表

2.2.2 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

基于前面的單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，根據(jù)Box-Behnken中心組合原理，以半夏中總黃酮的提取率為響應(yīng)值進(jìn)行分析，結(jié)果如表2所示。

表2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

續(xù)表2

2.2.3 模型方程的建立與顯著性檢查

通過Design-Expert 8.0軟件對(duì)以上的四個(gè)因素?cái)?shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果回歸模型方程擬合后所得的響應(yīng)曲面二次多元回歸模型方程為：

Y=7.78+0.99*A+0.010*B-0.20*C+0.64*D+0.25*A*B-0.63*A*C+0.30*A*D-0.38*B*C+1.13*B*D-0.35*C*D-2.12*A2-1.47*B2-0.77*C2-0.75*D2-0.69*A2*B-0.74*A2*C-0.94*A2*D-0.48* A*B2-0.82*A*C2-0.29*B2*C-0.41*B2*D-0.15*B*C2

R2=0.9889

式中，Y為總黃酮提取率，%；A為乙醇濃度；B為提取溫度；C為提取時(shí)間；D為料液比。分析結(jié)果見表3。

表3 回歸模型方差分析

續(xù)表3

該模型的相關(guān)系數(shù)為0.9889，說明該模型與實(shí)際實(shí)驗(yàn)的誤差小，模型的擬合度較好，采用改模型進(jìn)行半夏中總黃酮的提取工藝優(yōu)化是可行的。從一次項(xiàng)系數(shù)分析得出，各個(gè)因素對(duì)半夏中總黃酮的提取率的相對(duì)影響大小為：乙醇濃度>料液比>提取時(shí)間>提取溫度。由表3回歸模型方差分析可得：乙醇濃度與料液比(P<0.01)對(duì)半夏總黃酮的提取有極顯著的影響；提取溫度及提取時(shí)間(P>0.05)對(duì)提取率無顯著影響。信噪比Adeq Precision為16.924>4，說明該模型可用于預(yù)測(cè)；失擬項(xiàng)(P>0.05)不顯著，說明方程的擬合效果較好。

2.2.4 響應(yīng)曲面分析

實(shí)驗(yàn)各因素間交互作用如圖5～圖10所示。響應(yīng)面坡度平緩表明因素對(duì)總黃酮提取率影響較小，橢圓曲線排列密集說明該因素對(duì)總黃酮提取率影響大，等高線越接近橢圓形，表明兩因素交互作用越明顯[20]。綜合分析圖5～圖10可直觀地看出，乙醇濃度和料液比對(duì)總黃酮的提取率影響最明顯(圖7)，提取時(shí)間和乙醇濃度、料液比之間對(duì)總黃酮提取率的交互作用明顯(圖6、圖10)。

圖5 乙醇濃度與提取溫度對(duì)總黃酮提取率的交互作用

圖6 乙醇濃度與提取時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的交互作用

圖7 乙醇濃度與料液比對(duì)總黃酮提取率的交互作用

圖8 提取溫度與提取時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的交互作用

圖9 提取溫度與料液比對(duì)總黃酮提取率的交互作用

圖10 提取時(shí)間與料液比對(duì)總黃酮提取率的交互作用

2.2.5 半夏總黃酮最佳提取條件驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

由優(yōu)化后的模型可知，最佳提取工藝為：提取時(shí)間2.61 h、提取溫度62.7 ℃、料液比1:47 (g/mL)、乙醇濃度62.5%。在此條件下測(cè)得的實(shí)際總黃酮提取率為8.19%，與預(yù)測(cè)值8.22%基本吻合，說明回歸模型與實(shí)際提取情況擬合較好。

3 結(jié) 論

本次實(shí)驗(yàn)首先從乙醇提取濃度、提取的時(shí)間、提取的溫度和料液比等四個(gè)方面對(duì)半夏中總黃酮提取率的影響進(jìn)行了單因素實(shí)驗(yàn)測(cè)定，在此基礎(chǔ)上，使用Design-Expert 8.0.6軟件的Box-Behnken設(shè)計(jì)響應(yīng)曲面的實(shí)驗(yàn)，得到了較好的提取工藝條件，并對(duì)此進(jìn)行了驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。得到的最佳提取工藝條件為：提取時(shí)間2.61 h、提取溫度62.72 ℃、料液比1:47.10 (g/mL)、乙醇濃度62.54%，總黃酮的提取率達(dá)到了8.19%。利用乙醇浸提法對(duì)半夏中總黃酮進(jìn)行提取，提取方法簡單，不需使用復(fù)雜的儀器，優(yōu)化后的工藝條件溫和，提取率較高，對(duì)半夏的綜合開發(fā)與藥效成分利用提出了新的理論基礎(chǔ)與方向。