2017-2018年廣州市乙型流感病毒血凝素和神經(jīng)氨酸酶基因特征分析

夏炫梓 宋文俊 楊春光 曾志奇 楊子峰 王新華

廣州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院 呼吸疾病國家重點實驗室臨床病毒室510182

流感病毒屬于正黏病毒科的分段單股負鏈RNA 病毒,分為甲、乙、丙、丁4 個類型[1]。臨床上常見的是甲型流感病毒和乙型流感病毒,甲型流感病毒在自然界中存在廣泛的中間宿主,可在人和動物之間快速傳播和交叉感染,乙型流感病毒具有較強的宿主特意性,一般只感染人類和海豹[2-4]。在每年的流感季節(jié),甲型流感病毒和乙型流感病毒都會在人群中共同傳播并引起不同嚴重程度的呼吸道疾病。季節(jié)性流感流行是由H3N2 和H1N1 亞型的甲型流感病毒以及包含2種譜系的乙型流感病毒引起的,其中乙型流感病毒每2～4年會成為主導季節(jié)性流行的主要毒株,且2個譜系的病毒會呈現(xiàn)共同傳播和交替流行的特點[5]。某一地區(qū)的季節(jié)性流感暴發(fā)經(jīng)常會對人類的健康和社會的經(jīng)濟產(chǎn)生重大的影響[1,6-7]。甲型流感病毒由于傳播速度快,感染性強,抗原容易發(fā)生變異,所以經(jīng)常引起局部的暴發(fā),甚至是世界性的大流行。而乙型流感病毒雖不及甲型流感病毒的傳播速度和范圍,通常引起局部地區(qū)的流行,但也增加了流感疾病負擔,特別是在兒童和老年人群體中引起嚴重的疾病后果[8-9]。乙型流感病毒根據(jù)抗原特性和血凝素基因特征的不同,可分為Yamagata和Victoria兩大譜系,分別以B/Yamagata/16/88 和B/Victoria/2/87 為 代 表株[10]。本文通過對2017-2018年廣州市內(nèi)流行的乙型流感病毒基因特征進行研究,明確乙型流感病毒的變異和流行特點,并與WHO 推薦的病毒疫苗株進行比對分析匹配度,為流感監(jiān)測防控提供科學數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 毒株來源 本實驗所采用的病毒株來源于2017年12月至2018年4月在廣州市流感監(jiān)測哨點醫(yī)院采集的經(jīng)膠體金篩查呈現(xiàn)流感陽性患者的咽拭子樣本,通過免疫熒光法檢測出的乙型流感病毒樣本保存于廣州呼吸疾病健康研究院進行后續(xù)實驗。

1.2 病毒分離培養(yǎng) 將咽拭子標本充分振蕩混勻,取400μl接種于對數(shù)生長的單層狗腎細胞中,置于35.5 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每日觀察細胞病變情況。當70%～90%細胞出現(xiàn)聚集、脫落、融合等細胞病變形態(tài)時,收集病毒培養(yǎng)上清液,用雞紅細胞懸液進行血凝試驗。將血凝滴度≥8的病毒上清液進行病毒核酸提取、PCR 擴增和病毒亞型鑒定,剩余上清液保存于-80 ℃冰箱。血凝滴度＜8的病毒上清液繼續(xù)進行培養(yǎng)。

1.3 病毒RNA 提取 將成功分離擴增的乙型流感病毒采用德國QIAGEN 公司QIAamp Viral RNA Mini Kit試劑盒提取病毒RNA,具體步驟參考試劑盒說明書。

1.4 一步法RT-PCR 和產(chǎn)物純化 一步法RTPCR 試劑盒Prime Script One Step RT-PCR Kit由日本TAKARA 公司生產(chǎn)。測序所用引物自行設(shè)計(表1),由生工生物工程 (上海)有限公司合成。反應體系:Prime Script one Step Enzyme Mix 2μl,2×one Step Buffer 25 μl,RNase Free d H2O 20μl,上下游引物 (10μmol/L)各1μl,模板RNA 1μl。反應條件:第一階段50 ℃30 min,94 ℃2 min,1個循環(huán);第二階段94 ℃30 s,55 ℃30 s,72 ℃115 s,35 個 循 環(huán);第 三階段72 ℃10 min,1 個循環(huán)。隨后冷藏 (4～8 ℃)保存。PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳切割回收后用德國QIAGEN 公司QIAquick Gel Extraction Kit試劑盒進行純化,具體步驟參考試劑盒說明書。

1.5 序列測定和分析 PCR 純化產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)有限公司進行測序。測序結(jié)果采用Vector NTI軟件進行核苷酸序列拼接,拼接結(jié)果采用Bioedit軟件進行序列比對,分析HA 和NA蛋白的關(guān)鍵氨基酸位點和變異位點。WHO 推薦的2017-2018年度的三價疫苗組分中包含的Victoria系毒株為B/Brisbane/60/2008,四價疫苗組分中包含的Yamagata系毒株為B/Phuket/3073/2013[11]。使用MEGA 7.0軟件中Clustal W 法做序列比對分析,Neighbor-joining法做遺傳進化分析。HA 和NA 進化分析參考株選用歐洲疾病預防控制中心2017-2018 年流感季的概況報告 (http://ecdc.Europa.eu),Yamagata系1～3分支參考株是B/Florida/4/2006、B/Brisbane/3/2007及B/Wisconsin/01/2010;Victoria 系1B 與1A 分 支 參 考 株 是B/Hong Kong/514/2009 及B/Brisbane/60/2008[12]。從NCBI的Genbank 和全球共享禽流感數(shù)據(jù)倡議組織平臺下載其余參考序列:B/Hong Kong/330/2001 (2002 - 2004 年 疫 苗 株,V 系)、B/Shanghai/361/2002 (2004-2006 年 疫 苗 株,Y系)、B/Malaysia/2506/2004 (2006-2007年疫苗株,V 系)、B/Yamagata/16/88 (Yamagata 系 代表株)、B/Victoria/2/87 (Victoria系代表株)和部分不同來源地的參考毒株。為避免偏差,所有序列截取相同長度的區(qū)段。

表1 乙型流感病毒HA 和NA 基因的引物序列

2 結(jié)果

2.1 乙型流感病毒的分離擴增和鑒定 分離擴增2017-2018年乙型流感病例咽拭子標本共40份,成功分離出38 株,初步鑒定出Yamagata 系28株,Victoria系10株,Yamagata系毒株占乙型流感毒株的73.68%。

2.2 乙型流感病毒HA、NA 基因遺傳進化分析 對38株乙型流感病毒進行HA、NA 測序并構(gòu)建分子進化樹(圖1)。

2.2.1 HA 進 化 分 析 28 株 乙 型 流 感 病 毒Yamagata系毒株的HA 基因均屬于Yamagata Clade 3分支,并且與疫苗株B/Phuket/3073/2013屬于同一亞支,還有一個亞支為B/Wisconsin/01/2010類似株;10株乙型流感病毒Victoria系毒株均屬于Victoria Clade 1A 分支,其中以B/Hong Kong/286/2017 和B/Norway/2409/2017 為 代 表的進化亞支Clade 1A (▲1、▲2)[13]中未出現(xiàn)廣州市病毒株。

2.2.2 NA 進化分析 28株Yamagata系乙型流感病毒中有27株的NA 基因?qū)儆赮amagata Clade 3分支,并且與疫苗株B/Phuket/3073/2013 屬于同一亞支;10株乙型流感病毒Victoria系毒株均屬于Victoria Clade 1A 分支,以B/Norway/2409/2017為代表的進化亞支Clade 1A (▲2)中未出現(xiàn)廣州市病毒株,以B/Hong Kong/286/2017 為代表的進化亞支Clade 1A (▲1)中出現(xiàn)廣州市病毒株。另 外, 發(fā) 現(xiàn)1 株 Yamagata 系 病 毒 B/Guangdong/GZ20/2018 的NA 基因?qū)儆赩ictoria系,而 HA 基因?qū)儆赮amagata 系,因此B/Guangdong/GZ20/2018毒株是BY-HA/BY-NA 系間重配病毒。

2.3 乙型流感病毒HA、NA 基因分子特性分析

2.3.1 HA 分子特性分析 28株Yamagata系病毒株同本年度WHO 推薦的疫苗株B/Phuket/3073/2013相比較,HA1共有11個氨基酸位點發(fā)生變異(表2),27株均攜帶L187Q 和M266V 突變,重配株B/Guangdong/GZ20/2018也攜帶同樣的突變;另外還發(fā)現(xiàn)S93P、R151K、N179K、P342S、V421A、N436S、T547I 的氨基酸突變,但僅涉及個別毒株,且V421A、N436S 和T547I突變位點位于 HA2 基因結(jié)構(gòu)域上,B/Guangdong/GZ14/2018毒株缺失第540位氨基酸,B/Guangdong/GZ40/2018毒株發(fā)現(xiàn)T136I位點突變,位于120 環(huán)抗原表位上。10 株Victoria系病毒株同本年度WHO 推薦的疫苗株B/Brisbane/60/2008相比較,HA1 共有7 個氨基酸位點發(fā)生變 異 (表3),10 株 均 攜 帶I132V、N144D 和A214T 突變,其中I132V 位于抗原表位120環(huán)上,N144D位于抗原表位150環(huán)上;另外還有A169T、K227R、N248D 和P343S的變化。

圖1 2017-2018年廣州市乙型流感病毒HA 和NA 基因進化樹

2.3.2 NA 分子特性分析 27株Yamagata系病毒株同本年度WHO 推薦的疫苗株B/Phuket/3073/2013相比較 (表4),26 株 (96.3%)攜帶I49M 突變,19株 (70.4%)攜帶R65H 突變,24株(88.9%)攜 帶I171M 突 變,25 株 (92.6%)攜帶D342K 突變,同一位點的另外2株病毒株B/Guangdong/GZ16/2018 和 B/Guangdong/GZ34/2018攜帶D342N突變,27株(100.0%)均攜帶K373Q 突 變,17 株 (63.0%)攜 帶S402P 突 變;另 外 發(fā) 現(xiàn)I6T、F12L、V45I、P48S、A67V、A67T、G70E、P76L、N144S、R186I、F266L、E308G、R315K、T372N、T389I、K419E、T437I等位點的變化,但僅發(fā)生于個別毒株。11 株Victoria系病毒株同本年度WHO 推薦的疫苗株B/Brisbane/60/2008 相比較 (表5),均攜帶I120V、K220N、S295R、N340D、E358K 突變,重配株B/Guangdong/GZ20/2018同樣攜帶以上突變;8 株 (80.0%)攜 帶 D384G 突 變;3 株(30.0%) 攜 帶 V401I 突 變, 重 配 株 B/Guangdong/GZ20/2018同樣攜帶此位點突變;另外發(fā)現(xiàn)了P48T、T106I、I262M、M369V、V422I等位點突變,但僅發(fā)生于個別毒株。

3 討論

乙型流感病毒具有交叉流行和幾乎不可預測的特征,因而時常導致WHO 推薦的流感疫苗與當?shù)亓餍械囊倚土鞲胁《咀V系無法完全匹配[14]。根據(jù)流感監(jiān)測數(shù)據(jù)顯示,2017 年12 月至2018 年4月廣東省廣州市乙型流感病毒為流感優(yōu)勢株,Yamagata 和Victoria 2 種譜系共同流行且以Yamagata系為主要優(yōu)勢株,而2017-2018 年度WHO 推薦的是包含Victoria系毒株B/Brisbane/60/2008的三價疫苗株,可見該疫苗株與廣州市流行的乙型流感病毒的匹配度不高,降低了疫苗的保護效果。因此,三價疫苗未能產(chǎn)生交叉保護作用有可能是造成廣州市該年度Yamagata乙型流感病毒暴發(fā)的一個重要原因;另外,疫苗接種率低也是潛在原因之一。四價流感疫苗已于2018年4月在我國大陸批準上市,因此國家應該加速推動四價流感疫苗的普及,提高流行株與疫苗株的匹配度,為人群的身體健康提供有效保護,尤其是老人和小孩等免疫力較為低下的人群,減少國家的經(jīng)濟損失,減輕疾病負擔[15]。

表2 Yamagata系毒株HA 氨基酸發(fā)生替代的位點

表3 Victoria系毒株HA 氨基酸發(fā)生替代的位點

本次實驗所測的廣州市流行的乙型流感病毒株的HA 基因均處于Yamagata 系的Clade 1 和Victoria系的Clade 1A 分支中,但未出現(xiàn) “階梯樣”進化特征,可能是因為所測樣本之間的時間間隔較短。而且,本研究中發(fā)現(xiàn)系間重配病毒,Yamagata系毒株的NA 基因?qū)儆赩ictoria系。研究發(fā)現(xiàn),系間重配和系內(nèi)重配是乙型流感病毒變異進化的主要機制之一,而且容易造成大流行,可能是因為重配導致病毒的抗原發(fā)生變化,而人群的免疫系統(tǒng)缺乏相應的保護功能,從而導致大流行[16]。

研究表明,乙型流感病毒的HA1基因結(jié)構(gòu)域上有4個主要的抗原表位,即120環(huán)(HA1 116～137)、150 環(huán) (HA1 141～150)、160 環(huán) (HA1 162～167)和190螺旋(HA1 194～202)?？乖砦粎^(qū)域內(nèi)的氨基酸位點發(fā)生變異往往會影響病毒的抗原性和病毒株的進化方向[17]。10株Victoria系病毒株均發(fā)生I132V 和N144D 的變化,涉及120環(huán)和150環(huán)2個抗原表位,28株Yamagata系病毒株僅有B/Guangdong/GZ40/2018毒株發(fā)生T136I的突變,涉及120環(huán)抗原表位。這些突變是否引起抗原性改變?nèi)孕柽M一步深入研究。

表4 Yamagata 系毒株NA 氨基酸發(fā)生替代的位點

表5 Victoria系毒株NA 氨基酸發(fā)生替代的位點

NA 蛋白的酶活性位點對維持神經(jīng)氨酸酶活性穩(wěn)定起著非常重要的作用[18]。據(jù)文獻報道,乙型流感病毒NA 蛋白上存在E117、D149、R223、E275、R374、Y409 等11 個酶活性位點[19-20]。酶活性位點突變可以降低病毒對神經(jīng)氨酸酶抑制劑類抗流感藥物的敏感性,而不同的突變位點會導致對不同抗流感藥物產(chǎn)生耐藥性,比如E117位點的突變會降低病毒對奧司他韋、扎那米韋的敏感性,R150位點的變異會使病毒對奧司他韋、扎那米韋和帕拉米韋都產(chǎn)生耐藥性[21-24]。本研究中的38株乙型流感病毒均未發(fā)現(xiàn)上述位點的突變,表示對神經(jīng)氨酸酶抑制劑敏感,表明廣州地區(qū)使用的常規(guī)抗流感藥物可以發(fā)揮抗流感作用。10 株Victoria系病毒株和重配株B/Guangdong/GZ20 在第220 位氨基酸均發(fā)生K220N 的變化。2006-2007年中國臺灣暴發(fā)乙型流感正是由于220、320和404位氨基酸發(fā)生變化而引起[25]。

綜上所述,2017-2018年度WHO 推薦的三價流感疫苗株未能對廣州市人群形成良好的保護作用,因此需密切關(guān)注乙型流感病毒的變異情況以及和疫苗株的匹配度,以便及時制定合理的疫苗更新和接種方案,對流感進行科學有效的防控。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突