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    hsa_circ_0006411慢病毒載體的構(gòu)建及驗(yàn)證

    2020-11-12 02:28:44董學(xué)君
    醫(yī)學(xué)研究雜志 2020年10期
    關(guān)鍵詞:環(huán)狀試劑盒位點(diǎn)

    盧 韜 董學(xué)君

    非編碼RNA是指一類(lèi)不能編碼蛋白質(zhì)的RNA類(lèi)型(近年來(lái)發(fā)現(xiàn)有些非編碼RNA也具有編碼肽功能),包括微小RNA、長(zhǎng)鏈非編碼RNA和環(huán)狀RNA等類(lèi)型[1,2]。環(huán)狀RNA是由mRNA前體反向剪接產(chǎn)生的閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu),雖然大多數(shù)不能編碼蛋白質(zhì),但卻可以通過(guò)一系列機(jī)制調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá),來(lái)發(fā)揮細(xì)胞學(xué)功能,在癌癥中也具有重要的調(diào)控作用[3]。PIK3R1基因可編碼p85a蛋白,作為磷脂酰肌醇3激酶(phosphoinositide 3-kinase,PI3K)通路中PI3K的調(diào)節(jié)亞基,在諸如乳腺癌,宮頸癌等實(shí)體瘤中顯著低表達(dá),其可與PTEN結(jié)合,從而增強(qiáng)PTEN的脂質(zhì)磷酸酶活性,發(fā)揮抑癌作用[4~6]。本研究發(fā)現(xiàn),來(lái)源于PIK3R1母基因的環(huán)狀RNA(hsa_circ_0006411)在多種實(shí)體瘤組織中低表達(dá),為了研究其功能,擬構(gòu)建其慢病毒載體,并驗(yàn)證實(shí)用性后,用于后續(xù)的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。

    對(duì)象與方法

    1.試劑與儀器:In-Fusion?HD 克隆試劑盒(日本TaKaRa公司),膠回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒(美國(guó)Omega公司),pLC5-ciR載體(廣州吉賽公司),RPMI1640培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司),胎牛血清(美國(guó)ExCell Bio公司),脂質(zhì)體2000(美國(guó)Invitrogen公司);儀器主要有PCR儀(德國(guó)羅氏公司),電泳儀(美國(guó)Bio-Rad公司)和冷凍離心機(jī)等。

    2.載體構(gòu)建及測(cè)序鑒定:(1)目的片段擴(kuò)增:設(shè)計(jì)帶有EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位點(diǎn)的引物,序列見(jiàn)表1,以人細(xì)胞混合樣本cDNA為模板擴(kuò)增環(huán)狀RNA hsa_circ_0006411,目的片段在1.5%的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳后,按照膠回收試劑盒操作說(shuō)明回收純化目的片段。(2) 目的片段與載體連接:分別向目的片段和載體pLC5-ciR中加入EcoRⅠ和BamHⅠ酶,得到的產(chǎn)物連接成攜帶circ_0006411的pLC5-ciR表達(dá)載體。該表達(dá)載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞,陽(yáng)性菌落擴(kuò)增后行PCR測(cè)序,與BLAST序列比對(duì),看是否為目的hsa_circ_0006411 RNA序列;并比對(duì)測(cè)序得到的環(huán)化接頭位點(diǎn)與circbase中的環(huán)化位點(diǎn)序列,看是否完全一致,測(cè)序引物列見(jiàn)表1。

    3.hsa_circ_0006411載體的驗(yàn)證:293T細(xì)胞接種于6孔板中,當(dāng)細(xì)胞80%匯合時(shí)轉(zhuǎn)染,分成hsa_circ_0006411載體、PLC5-ciR空載體及對(duì)照組分別轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,培養(yǎng)6h后換液,更換為完全培養(yǎng)基,40h以后觀察細(xì)胞GFP的表達(dá),并收集細(xì)胞,PCR擴(kuò)增檢測(cè)circ_0006411的表達(dá)情況,以GAPDH為管家基因,2-ΔΔCT表示irc_0006411的相對(duì)表達(dá)量,引物序列見(jiàn)表1。

    表1 各基因引物表

    結(jié) 果

    1.載體測(cè)序結(jié)果:構(gòu)建的PLC- hsa_circ_0006411載體經(jīng)轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞后,可在LA平板上檢測(cè)出陽(yáng)性菌落,該菌落PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果如圖1,經(jīng)BLAST序列比對(duì)后發(fā)現(xiàn),與GenBank上的人hsa_circ_0006411序列完全一致,測(cè)序后得到的環(huán)化接頭位點(diǎn)與circbase中的環(huán)化位點(diǎn)序列也完全一致(圖1),載體構(gòu)建成功。

    圖1 hsa_circ_0006411部分測(cè)序圖及環(huán)狀位點(diǎn)測(cè)序圖A.hsa_circ_0006411測(cè)序結(jié)果部分顯示的圖譜;B.hsa_circ_0006411環(huán)化位點(diǎn)處的顯示圖

    2.轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后hsa_circ_0006411表達(dá)量及測(cè)序結(jié)果:轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后hsa_circ_0006411載體組、PLC5-ciR空載體及對(duì)照組相對(duì)表達(dá)量分別為9947.08±514.42、3.71±0.71和1.00±0.10,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2),其擴(kuò)增曲線見(jiàn)圖3;顯微鏡下可見(jiàn)在293T細(xì)胞中的綠色熒光蛋白的表達(dá),表明hsa_circ_0006411載體可在293T細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)circ_0006411環(huán)狀基因。

    圖2 轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后基因表達(dá)情況

    圖3 hsa_circ_0006411 PCR擴(kuò)增曲線黃色為GAPDH基因,其他為circ_0006411基因

    討 論

    環(huán)狀RNA在1976年首次在病毒中被發(fā)現(xiàn)[7]。作為非編碼RNA群體的一個(gè)重要組成部分,其形成機(jī)制為線狀mRNA前體物質(zhì)反向剪接形成的環(huán)狀結(jié)構(gòu),其5′和3′末端通過(guò)磷酸二酯鍵連接,而不形成懸空的自由末端,相對(duì)于線性結(jié)構(gòu)而言,其環(huán)狀結(jié)構(gòu)使得其能夠更加穩(wěn)定的表達(dá)存在于組織、血液及其他體液中[8,9]。由于其非編碼特性,在生物體生命活動(dòng),疾病發(fā)展過(guò)程中的作用一直以來(lái)都被忽視。直到近年來(lái)發(fā)現(xiàn)很多非編碼RNA的重要調(diào)控基因表達(dá)的功能被提出,才對(duì)circRNA的研究重新引起重視。加上現(xiàn)代生物技術(shù)和研究工具的發(fā)展,越來(lái)越多的研究表明,circRNA在人類(lèi)生命活動(dòng)過(guò)程中的重要作用,目前而言主要體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面:①作為競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA(ceRNA機(jī)制,即競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miRNA,從而解除對(duì)與其結(jié)合的靶基因的抑制作用,來(lái)提高miRNA靶基因表達(dá))來(lái)調(diào)控特異性基因的表達(dá)[10,11];②與RNA結(jié)合蛋白相互作用來(lái)抑制或調(diào)控該蛋白的活性[12,13];③通過(guò)順式/反式作用與RNA直接結(jié)合來(lái)調(diào)控RNA的水平[14,15];④可以作為模板翻譯成多肽[16~18]。上述circRNA的穩(wěn)定性特征及諸多功能,賦予其作為腫瘤發(fā)生、發(fā)展、診斷和治療等多種路徑分子的可能性,科學(xué)家的確發(fā)現(xiàn)其與肺癌、乳腺癌、泌尿生殖系統(tǒng)和消化系統(tǒng)等幾乎所有癌種的密切關(guān)系。

    本研究主要為肺癌相關(guān)的環(huán)狀RNA的研究。前期研究發(fā)現(xiàn),在肺癌組織中相對(duì)于癌旁組織低表達(dá)的circ_0006411,其母基因?yàn)榫幋aPI3K信號(hào)通道中調(diào)節(jié)亞基P85a的基因PIK3R1,該基因在不同腫瘤中的表達(dá)高低具有明顯的組織特異性,在乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌、結(jié)腸癌和非小細(xì)胞肺癌中明顯低表達(dá),其可能主要是發(fā)揮抑制PI3K/AKT下游的動(dòng)物雷帕素靶蛋白(mTOR)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路來(lái)抑制腫瘤的增殖,促進(jìn)凋亡的作用[19,20]。今后擬進(jìn)一步研究circ_0006411在非小細(xì)胞肺癌中的作用機(jī)制,需先構(gòu)建該環(huán)狀RNA的載體。本研究以慢病毒載體PLC5-ciR為工具,通過(guò)基因工程的手段,成功構(gòu)建了攜帶該環(huán)狀基因的慢病毒載體,并在293T細(xì)胞中能顯著高表達(dá),可以用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

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