超聲波輔助閃式提取美人松松針中皂苷的研究

王露瑤，遲雨昇，劉怡辰，霍云博，楊 萍

（吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院食品工程學(xué)院，吉林吉林132101）

美人松別名吉林長(zhǎng)白松，長(zhǎng)白山稀有的松科植物之一，其松針提取物可廣泛應(yīng)用于醫(yī)療、美容、保健和食品等多種應(yīng)用途徑，可提高機(jī)體免疫力及用于增強(qiáng)體內(nèi)荷爾蒙和腎上腺激素的平衡分泌，快速改善心肌缺血和缺氧，并且用于治療和有效預(yù)防了冠心病，增強(qiáng)預(yù)防心臟病的功能[1]，保護(hù)和改善機(jī)體自身的免疫系統(tǒng)，用于預(yù)防和治療各種疾病以及原因不明的慢性心肌功能衰竭等[2]，具有用于鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、解熱和抗癌、促進(jìn)體內(nèi)血清氧化酶和蛋白質(zhì)正常合成的重要作用[3]。美人松松針和松針提取物的成分中含有豐富的皂苷元，是一種三萜或螺旋甾烷類化合物的一類糖苷，即皂苷(saponin)，是美人松松針提取物成分中的重要活性化學(xué)成分。美人松具有鎮(zhèn)痛抗菌、解熱、鎮(zhèn)靜、抗癌和抵抗惡性腫瘤[4]等有價(jià)值的多種生物活性化學(xué)功效，具有良好的臨床應(yīng)用和前景[3,5]。

目前國(guó)內(nèi)外對(duì)于三萜皂苷的生物提取技術(shù)有水煮浸提法、有機(jī)溶劑浸提法、超聲波提取法、閃式超聲波提取法、回流超聲波提取法、微聲波回流提取法。而相對(duì)于有機(jī)溶劑浸提法、水煮浸提法、超聲波提取法提取的時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，閃式提取時(shí)間短，但是提取率不高[3]。然而閃式提取的方法在技術(shù)上具有天然植物活性成分最大保留、無(wú)熱敏性損傷、提取的時(shí)間短、組織快速、活性成分平衡等特點(diǎn)[1，3，6]。超聲波閃式提取法作為一種新型的提取技術(shù),在天然植物熱敏性成分的提取中所能夠顯示獨(dú)特技術(shù)優(yōu)勢(shì)，可以廣泛用來(lái)快速提取天然熱敏性植物中的活性成分,具有高效、快速、節(jié)能等技術(shù)優(yōu)點(diǎn),最重要的技術(shù)特點(diǎn)是不易直接破壞熱敏性提取物的組織結(jié)構(gòu)[6，7]。本文的實(shí)驗(yàn)將閃式活性成分提取與天然植物超聲波活性成分提取的技術(shù)進(jìn)行緊密結(jié)合，極有可能使其達(dá)到高效、節(jié)能、快速和高提取率的效果。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

美人松松針采摘于吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院校園內(nèi)，置于電熱恒溫干燥箱80℃常壓干燥至恒重，粉碎至80目篩，裝入磨口玻璃瓶備用。

實(shí)驗(yàn)室的分析純品試劑：選用人參皂苷rb1標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)品(多為實(shí)驗(yàn)室制或自制)；硫酸、香草酸甲醛、丙酮、高氯酸、石油二甲醚、無(wú)水乙醇、乙醚、氯仿等各類生物化學(xué)分析試劑以及各類藥品均可作為臨床實(shí)驗(yàn)室的分析純品。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器與器材

yre-2000a旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器或re-52a（中國(guó)上海亞龍盛華儀器廠）、紫外可見(jiàn)分光光度測(cè)量計(jì)uv-2800ah（uniko上海儀器有限公司）或v-1100d可見(jiàn)分光光度計(jì)（中國(guó)上海米波達(dá)儀器有限公司）、恒溫水浴鍋（中國(guó)天津市恒溫水浴檢測(cè)儀器有限公司）等、數(shù)控超聲波清洗機(jī)unikq3200db（江蘇省昆山市超聲儀器有限公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 準(zhǔn)確地稱取人參皂苷rh1標(biāo)準(zhǔn)品5 mg，用甲醇溶液稀釋至 10 ml，濃度為0.5 mg/ml的人參皂苷rh1標(biāo)準(zhǔn)品空白甲醇溶液，分別 稱 取 120 μl、280 μl、440 μl、600 μl、760 μl、920 μl，分別搖勻置于具塞試管中。在水浴中加熱蒸發(fā)甲醇，分別加入0.4 ml 5%的香草醛冰醋酸空白甲醇溶液和1.6 ml的高氯酸，搖勻，塞緊，置60℃水浴中繼續(xù)加熱15 min，取出冷卻至室溫，分別加入10 ml的冰醋酸[8]。以空白甲醇溶液的吸光度作為對(duì)照。在560 nm的可見(jiàn)光波長(zhǎng)處進(jìn)一步測(cè)定皂苷吸收光度A[9]。以皂苷rh1的皂苷質(zhì)量x(mg)與吸收光y(A)為例進(jìn)行非線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程。根據(jù)回歸標(biāo)準(zhǔn)曲線得到回歸方程，y（oa吸光度數(shù)值）=ax（皂苷的質(zhì)量）+b。最后進(jìn)一步計(jì)算皂苷提取率。

1.3.2 皂苷提取工藝及精制工藝 提取工藝：美人松松針→干燥→粉碎→稱取美人松針?lè)勰?0 g→適量加入有機(jī)溶劑提取劑→閃式提取→再次收集有機(jī)溶劑提取液→超聲波處理→收集上層清液→抽氣過(guò)濾→減壓→干燥→得粗皂苷→然后用水將粗皂苷溶解→適量加入正丁醇萃取→反復(fù)萃取3次→除去水層→再次回收正丁醇→干燥→皂苷提取物。

精制工藝：得粗皂苷→用水溶解→適量正丁醇萃取→萃取3次→除去水層→回收正丁醇→干燥至恒重→測(cè)定含量。

美人松松針皂苷得率的測(cè)定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算松樹(shù)松針皂苷含量。

式中，m為樣品的平均質(zhì)量（g）；v為提取液的平均分子體積（ml）；x為提取液中樣品所含的三萜皂苷的平均濃度（mg/ml）。

1.3.3 皂苷的成分檢驗(yàn)檢測(cè) 氯仿-濃硫酸清液反應(yīng)聯(lián)合試驗(yàn)(salkowski聯(lián)合反應(yīng))：試管取上層清液2 ml→清液用高溫?zé)崴≡俅握舭l(fā)后蒸干→蒸干后的試管加入新的氯仿溶解層或者濃硫酸清液溶解1 ml→后轉(zhuǎn)入干燥小管的試管→濃硫酸1 ml→氯仿層或者濃硫酸溶解層顯示粉紅色或蘭花綠色或有淡黃綠色的酸性熒光[10]。

1.3.4 有機(jī)提取溶劑的選擇 準(zhǔn)確稱量松枝粉末4份，每份4 g，將4份樣品分別放入三角瓶中，分別加入20 ml的乙醇、丙酮、石油醚和蒸餾水進(jìn)行閃式提取后進(jìn)行合并有機(jī)提取液,再依次進(jìn)行超聲波提取，合并上清液。將有機(jī)提取液進(jìn)行抽濾干燥。根據(jù)提取皂苷得率的公式進(jìn)行有機(jī)提取美人松松針皂苷的含量，最終的方法是選擇與提取美人松松針皂苷得率含量最高相對(duì)應(yīng)的有機(jī)提取皂苷溶劑作為最佳提取工藝的有機(jī)提取皂苷溶劑。

1.4 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.4.1 單因素實(shí)驗(yàn) 本次的研究主要是在單因素的實(shí)驗(yàn)中采用了5個(gè)關(guān)鍵因素，即閃式提取的溫度、閃式提取的時(shí)間、超聲波提取的功率、超聲提取的時(shí)間、液料比,閃式提取的溫度（℃）從低到高分別為50℃、60℃、70℃、80℃、90℃。閃式提取的時(shí)間（min）分別從高到低為 2 min、3 min、4 min、5 min、6 min。超聲波提取的超聲功率（w）分別為：40 w、50 w、60 w、70 w、80 w。超聲波提取的超聲時(shí)間（min）分別為10 min、20 min、30 min、40 min、50 min。液料的處理質(zhì)量分配比（m∶v）分別為 1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40；處理的液料一次處理重復(fù)3次。

1.4.2 響應(yīng)面法優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)數(shù)據(jù) 在單因素中心組合實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)上，采用了box-behnken（中心單因素組合設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)）方法分析設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)中的因素與中心組合水平，利用box-designexpert8.0.6軟件進(jìn)行了設(shè)計(jì)。最終根據(jù)響應(yīng)式的曲面設(shè)計(jì)方法來(lái)分析確定各相關(guān)影響因素之間的直接交互作用及直接影響美人松松針總皂苷含量和提取率的程度，篩選得出了優(yōu)化美人松松針工藝的關(guān)鍵條件[11，12]。

2 結(jié)果與分析

2.1 美人松松針中總皂苷標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

從計(jì)算結(jié)果來(lái)看，美人松松針中總皂苷與560nm處測(cè)定的吸光度線性關(guān)系良好，線性關(guān)系R2為0.999 8，回歸方程為 y=2.849 1 x-0.022 7（見(jiàn)圖 1）。

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1 閃式提取溫度對(duì)美人松松針中總皂苷提取率的影響 使用閃式乙醇提取法時(shí),溫度從50℃逐漸增加到70℃，隨著提取液溫度的增加，皂苷的活性成分在提取液含量明顯上升，溫度增加，皂苷的活性成分在提取液中的含量也呈上升的趨勢(shì)，最大提取溫度為70℃，70℃后乙醇提取液中皂苷含量連續(xù)明顯下降。一方面可能是由于溫度過(guò)高造成皂苷的熱敏感性損耗；另一方面可能是由于提取液的高溫、有機(jī)溶劑的揮發(fā)、乙醇含量明顯降低所致。隨著提取液溫度的進(jìn)一步升高，提取液的活性成分顏色逐漸變深，溫度過(guò)高，部分活性成分被有機(jī)溶劑破壞，曲線也呈明顯下降的趨勢(shì)，即提取液的總皂苷乙醇含量明顯下降（見(jiàn)圖2）。

2.2.2 閃式提取時(shí)間對(duì)美人松松針皂苷提取率的影響 隨著提取皂苷時(shí)間的縮短和延長(zhǎng),溶液中皂苷的含量逐漸流失和增加，5 min左右溶液中皂苷達(dá)到最大提取值，即達(dá)到最大提取率，并且溶液中皂苷含量多少會(huì)隨時(shí)間的縮短和延長(zhǎng)而逐漸降低。其中的原因可能主要是溶液中的皂苷提取和溶解一般不會(huì)隨提取時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，相反有機(jī)溶劑會(huì)在較長(zhǎng)的皂苷提取時(shí)間內(nèi)快速揮發(fā)，皂苷含量一般也會(huì)隨時(shí)間增加而損失。皂苷提取部分受到光、氧、熱的相互作用影響，穩(wěn)定性會(huì)大大降低，部分結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，從而直接影響皂苷提取率。因此，從各種提取方向的角度上來(lái)考慮，使用閃式超聲進(jìn)行提取時(shí)，浸提皂苷的時(shí)間一般不宜過(guò)長(zhǎng)（見(jiàn)圖3）。

2.2.3 超聲波功率對(duì)美人松松針皂苷藥物提取率的直接影響 超聲波提取功率在50～70 w，隨著溶液中超聲波提取功率的大幅度增加，皂苷的最大提取率開(kāi)始有明顯的增加，在70 w時(shí)達(dá)到最大提取值，隨后稍有小幅度的下降,可能主要是由于溶液中的皂苷在空氣中發(fā)生了分解，隨著溶液溫度的升高，90 w又開(kāi)始有一個(gè)小幅度的提高，之后溫度即開(kāi)始呈現(xiàn)大幅度下降的趨勢(shì)（見(jiàn)圖4）。

2.2.4 料液比對(duì)美人松松針皂苷提取率的影響 從圖5可以清楚地看出,隨著料液比的進(jìn)一步增加，皂苷的提取率逐漸得到增加，當(dāng)料液比達(dá)到1∶30時(shí)，皂苷的含量達(dá)到最高水平。其原因可能主要是因?yàn)楫?dāng)物料與其他液體的比例達(dá)到1∶30時(shí)，大部分有效成分已被液體溶解。因此，考慮到可以節(jié)省物料的溶劑用量和降低物料后續(xù)的加工成本等多種綜合利用因素，以1∶30為最佳的料液比。具體參見(jiàn)圖5（物料的橫坐標(biāo)轉(zhuǎn)換為小數(shù)點(diǎn)表示）。

2.2.5 超聲波提取時(shí)間對(duì)皂苷提取率的重要影響如圖6所示，提取時(shí)間在10～30 min時(shí)，提取率明顯增加；當(dāng)提取時(shí)間為30 min時(shí)，總皂苷總量最大，之后提取率隨時(shí)間逐漸降低。

2.3 響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)

2.3.1 響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)結(jié)果 在單因素的因素水平實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)基礎(chǔ)上，進(jìn)行4因素3水平實(shí)驗(yàn)的響應(yīng)面方差分析的實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表1所示，數(shù)據(jù)的方差分析的結(jié)果如表2所示。

2.3.2 響應(yīng)面數(shù)學(xué)模型建立及其顯著性檢驗(yàn) 利用designexpert8.0.6軟件進(jìn)行驗(yàn)證提取率計(jì)算結(jié)果如表2所示，回歸方程：提取率=7.67-0.058 A+0.11B-0.32 C+0.12 D-0.044 AB-0.33 AC-0.41 AD-0.13 BC+0.14 BD-0.05 CD-1.11 A2-0.56 B2-0.60 C2-0.82 D2回歸模型提取率p＜0.000 1，結(jié)果極其顯著；失擬誤差項(xiàng)p=0.993 2＞0.05，表明回歸失擬相對(duì)于純誤差項(xiàng)的影響程度是不顯著的，說(shuō)明回歸模型的擬合度和提取率較好，該模型和回歸方程的提取率可以廣泛地用于分析和預(yù)測(cè)美人松松針皂苷的擬合度和提取率；根據(jù)其f值大小可以準(zhǔn)確判斷，在所有的自變量對(duì)因變量的提取時(shí)間影響程度來(lái)說(shuō)，閃失因素的提取時(shí)間溫度分別為p=0.000 1、微波功率提取溫度p=0.007 9＜0.01，極顯著，影響的程度最高，影響提取效果一般的為液料對(duì)比和超聲時(shí)間，超聲提取時(shí)間液料比p值通常＞0.01，液料比p＞0.05；并且它們的二次項(xiàng)分別為 A2、B2、C2、D2、影響之間的對(duì)比，p＜0.01，差異極顯著；在交互項(xiàng)中的影響之間對(duì)比，根據(jù)其f值的大小，其交互影響的二次項(xiàng)大小分別為AD＞AC＞BD＞BC＞CD＞AB，各影響因素對(duì)美人松松針皂苷提取率的交互影響不是簡(jiǎn)單線性的關(guān)系，圖7—圖12分別顯示了每個(gè)因素的影響之間交互作用等高曲線和交互作用響應(yīng)圖。

表1 響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)結(jié)果情況

采用designexpert8.0.6軟件，設(shè)計(jì)分析得出美人松松針皂苷的最佳閃式超聲預(yù)測(cè)提取條件：最佳閃式條件提取的溫度70℃，液料比1∶30，閃式條件提取的時(shí)間5 min，超聲波提取的閃式條件：最佳超聲預(yù)測(cè)提取時(shí)間30 min，超聲預(yù)測(cè)提取功率70 w,利用軟件對(duì)松針皂苷的預(yù)測(cè)提取率為7.9%,在此預(yù)測(cè)提取條件下的實(shí)際模型中所測(cè)定提取值為7.85%，相差0.05%，實(shí)際模型中所測(cè)定的松針皂苷閃式提取率與之前模型中計(jì)算的閃式條件預(yù)測(cè)值間的相對(duì)偏差較為微小，可以充分證明實(shí)際模型的預(yù)測(cè)值與實(shí)際的結(jié)果基本符合。

表2 回歸方程的方差分析

3 結(jié)論與討論

本研究先進(jìn)行單因素影響試驗(yàn)，在此基礎(chǔ)上利用響應(yīng)面法進(jìn)一步優(yōu)化了提取工藝的參數(shù)，以提取率作為響應(yīng)值，考察閃式提取的溫度、閃式提取的時(shí)間、超聲波提取功率、液料比、超聲輔助提取的時(shí)間對(duì)于美人松松針皂苷閃式提取率的影響，利用軟件對(duì)閃式提取數(shù)據(jù)的擬合分析得出了美人松松針皂苷的提取回歸方程，并對(duì)其進(jìn)行方差分析，得出影響美人松松針總溫度和皂苷閃式提取率的因素依次為皂苷閃失提取的溫度＞皂苷超聲輔助提取功率＞皂苷超聲輔助提取時(shí)間＞液料比＞閃失提取的時(shí)間。最佳的提取條件和工藝參數(shù)為超聲波閃式提取最佳溫度70℃，液料比1∶30，閃式提取時(shí)間5 min，超聲波提取時(shí)間30 min，閃式超聲波提取功率70 w，利用軟件對(duì)美人松松針皂苷的有效預(yù)測(cè)提取率為7.9%，在此有效提取條件下的實(shí)際測(cè)定提取值為7.85%，相差0.05%，實(shí)際提取中所測(cè)定的松針皂苷的提取率與之前模型計(jì)算的松針皂苷預(yù)測(cè)值間的相對(duì)偏差也是較為微小的，充分證明模型的預(yù)測(cè)值與實(shí)際的結(jié)果基本符合。