南瓜中游離葉黃素的制備及抗氧化活性

孟繁玲 ， 張 宇 *， 徐少博 ， 趙 宏 ， 王宇亮 ， 趙芷萌 ， 張 曼

（1. 佳木斯大學(xué) 黑龍江省新藥創(chuàng)制與藥效毒理評價重點實驗室，黑龍江 佳木斯 154007；2. 佳木斯大學(xué) 藥學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007；3. 黑龍江省第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150010）

南瓜Cucurbita moschata Duch.是雙子葉被子植物門葫蘆科南瓜族南瓜屬植物，俗稱金瓜、倭瓜等[1]，我國古代早就有關(guān)于南瓜食療保健作用的記載。 在中醫(yī)史書《本草綱目》中，李時珍將南瓜與上品藥材靈芝放在一起，稱其具有“補中益氣”之效[2]。南瓜營養(yǎng)豐富，富含粗纖維、維生素、β-胡蘿卜素，葉黃素等成分[3]，其中葉黃素成分與許多生物活性密切相關(guān)。 葉黃素又名“植物黃體素”，是一種天然類胡蘿卜素類色素[4]。 大量研究表明，葉黃素在保護(hù)視覺、預(yù)防老年性黃斑變性、防治動脈硬化、增強(qiáng)免疫力等方面起著重要作用[5-8]。 南瓜中的葉黃素主要以葉黃素酯的形式存在，不易被人體吸收，需要經(jīng)過皂化處理才能獲得人體所能吸收的游離態(tài)葉黃素[9-10]。 目前，葉黃素的研究主要集中在以萬壽菊為原料提取，且對游離葉黃素的制備和純化方面報道較少[11-13]，限制了葉黃素的開發(fā)應(yīng)用。 本研究以氫氧化鉀-甲醇溶液為皂化溶劑， 采用響應(yīng)面法優(yōu)化制備游離葉黃素的工藝參數(shù)， 并進(jìn)行進(jìn)一步的純化，以期為葉黃素的深入研究和南瓜的綜合利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗設(shè)備與材料

KQ-250DE 型數(shù)控超聲波清洗器： 購自昆山市超聲儀器有限公司；RE-2000A 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：購自上海亞榮生化儀器廠；FA2004 型電子天平：購自上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；DL-5-B 低速大容量離心機(jī)： 購自上海安亭科學(xué)儀器廠；LC-5510 型高效液相色譜儀： 購自北京東西分析儀器；Q Exactive質(zhì)譜儀：購自美國Thermo 公司。

紅栗南瓜：干燥后粉碎，過60 目篩，貯存于實驗室備用；無水乙醇、乙酸乙酯、正己烷、石油醚：均為分析純， 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；甲醇：色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；硅膠H：青島海洋化工有限公司產(chǎn)品；無水硫酸鈉：天津市凱通化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；氫氧化鉀：天津市凱通化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；葉黃素標(biāo)準(zhǔn)品（純度 90%）、LOT（F03N8M46350）：上海源葉生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.2 實驗方法

1.2.1 游離葉黃素的制備

1） 南瓜葉黃素酯的提取 準(zhǔn)確稱取南瓜粗粉60 g，加入乙酸乙酯-無水乙醇（體積比為 2∶1）混合溶劑，超聲提取。 提取結(jié)束后抽濾，濾液于4 000 r/min下離心10 min，收集上清液，減壓濃縮干燥，得葉黃素酯粗品。

2）南瓜葉黃素酯的皂化 參考胡建中的方法[14]，用2 mL 正己烷將上述步驟中得到的葉黃素酯復(fù)溶，用一定濃度的KOH-甲醇溶液與其混合，比例1∶1，避光皂化。 于皂化結(jié)束時向反應(yīng)體系注入一定體積雙蒸水，補充正己烷，萃取，取上層用無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮，揮干溶劑備用。

1.2.2 葉黃素的純化 采用硅膠柱色譜法對葉黃素進(jìn)行純化。 以石油醚為溶劑進(jìn)行濕法裝柱，將適量1.1.2 得到的產(chǎn)品用少量溶劑溶解， 用膠頭滴管沿柱壁緩緩加入。 上樣完成后，用適量的石油醚和乙酸乙酯混合溶劑進(jìn)行梯度洗脫， 收集目標(biāo)組分，減壓濃縮，揮干溶劑，得純化產(chǎn)品。

1.2.3 葉黃素的高效液相色譜和質(zhì)譜分析

1）高效液相色譜條件 HPLC 分析條件：ODSC18 色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相為甲醇（體積分?jǐn)?shù) 100%）， 流量 0.5 mg/mL， 檢測波長450 nm，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量 10 μL。

2）質(zhì)譜條件 MS 條件：采集方式為單離子檢測掃描（Single ion monitoring，SIM）與平行反應(yīng)監(jiān)測掃描（Parallel reaction monitoring，PRM）；離子極性為正離子；離子化方式為電噴霧離子化；檢測對象葉黃素 m/z=568；毛細(xì)管電壓 3.0 kV；鞘氣壓力3×106Pa，輔助氣壓力 1×106Pa；離子傳輸管溫度320 ℃，加熱（蒸發(fā)）溫度 350 ℃。

1.2.4 葉黃素標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 準(zhǔn)確稱取葉黃素標(biāo)準(zhǔn)品5.00 mg，用甲醇定容于25 mL 棕色容量瓶中，制備成 0.2 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液。 分別取 1、2、3、4、5 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液用甲醇定容于10 mL 容量瓶中，配制成質(zhì)量濃度分別為 0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mg/mL 的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照HPLC 色譜條件，每個系列質(zhì)量濃度進(jìn)樣3 次，取平均值，以葉黃素系列標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)， 相應(yīng)吸收峰面積為縱坐標(biāo)，繪制葉黃素標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1 所示，得到回歸方程y=97.47x+0.15，R2=0.999 8。

圖1 葉黃素標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig. 1 Lutein standard curve

1.2.5 樣品中游離葉黃素的測定 取皂化后產(chǎn)品，溶劑復(fù)溶， 按1.2.4 葉黃素標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定方法測定峰面積，根據(jù)標(biāo)回歸方程求得游離葉黃素質(zhì)量濃度。 南瓜提取物中游離葉黃素得率按公式（1）計算：

式中：c 為樣品溶液的濃度（mol/L）；V 為復(fù)溶溶劑體積(mL)；m 為南瓜粗粉質(zhì)量（g）。

1.2.6 單因素實驗設(shè)計 將葉黃素酯提取液減壓濃縮干燥，在其他條件不變的情況下，以游離葉黃素得率為指標(biāo)， 考察質(zhì)量濃度分別為 5、10、20、30、40 g/dL；皂化溫度為 25、35、45、55、65 ℃；皂化時間為 2、5、8、11、14 h 條件下各因素對南瓜中游離葉黃素得率的影響，以確定最優(yōu)皂化條件。

1.2.7 響應(yīng)面法實驗設(shè)計 為優(yōu)化南瓜中游離葉黃素的制備工藝條件，根據(jù)Box-Behnken 試驗設(shè)計原理，在單因素試驗基礎(chǔ)上，共設(shè)計17 個試驗點，12 個分析點，5 個零點以估計誤差， 選取皂化液質(zhì)量濃度A、皂化溫度B、皂化時間C 為自變量，以游離葉黃素得率Y 為響應(yīng)值，設(shè)計三因素三水平的優(yōu)化試驗，試驗因素與水平設(shè)計見表1。

表1 響應(yīng)面試驗因素與水平Table 1 Response surface test factors and levels

1.2.8 游離葉黃素的抗氧化能力測試

1) 南瓜中游離葉黃素清除DPPH·的能力 取不同質(zhì)量濃度南瓜葉黃素乙醇溶液1 mL 于試管中， 分別加入 2×10-4mol/L DPPH·乙醇溶液 1 mL，搖勻，暗處靜置30 min，乙醇為空白對照，517 nm 處測吸光度A，按公式（2）計算南瓜葉黃素對DPPH·的清除率：

式中：Ax為樣品溶液的吸光度；Ao為對照溶液的吸光度。

2）南瓜中游離葉黃素清除·OH 的能力 取6 mmol/L FeSO4溶液 1 mL、6 mmol/L 水楊酸乙醇溶液1 mL，依次加入試管中，不同質(zhì)量濃度南瓜葉黃素乙醇溶液1 mL 充分混勻， 隨后加入5 mmol/L H2O2溶液 1 mL 以啟動反應(yīng)， 并于 37 ℃下水浴30 min，測定其510 nm 波長處吸光度A，另設(shè)乙醇為空白對照，按公式（3）計算南瓜葉黃素對·OH 的清除率：

式中：Ax為樣品溶液的吸光度；Axo為不加H2O2時樣品溶液的吸光度；Ao為對照溶液的吸光度。

1.2.9 統(tǒng)計學(xué)處理 數(shù)據(jù)運用 Microsoft Excel、Design Expert 8.0.6、SPSS 13.0 統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析和顯著性分析。 統(tǒng)計描述：計量資料數(shù)據(jù)用x ± s 表示，P＜0.05 表示具有顯著性差異，P＜0.000 1 表示具有極顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品測定

2.1.1 南瓜葉黃素的色譜測定 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的保留時間對南瓜中游離葉黃素的色譜峰初步定性，將樣品測定色譜圖與標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖進(jìn)行比較，以確定樣品的相應(yīng)峰位。 按1.2.3 色譜條件測定標(biāo)準(zhǔn)品溶液和樣品溶液，色譜圖見圖2。標(biāo)準(zhǔn)品保留時間與樣品保留時間相同，初步確定樣品與標(biāo)準(zhǔn)品為同一物質(zhì)。

圖2 樣品溶液和標(biāo)準(zhǔn)品溶液高效液相色譜圖Fig. 2 High performance liquid chromatogram of sample solution and standard solution

2.1.2 南瓜葉黃素的質(zhì)譜鑒別 葉黃素標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的MS 檢測結(jié)果見圖3。 樣品溶液中含有與標(biāo)準(zhǔn)品一致的質(zhì)譜碎片及其特征離子峰度，從而進(jìn)一步證明南瓜中含有葉黃素。 葉黃素的相對分子質(zhì)量為568， 一級質(zhì)譜分析特征離子為m/z 569.4、430，其中m/z 569.4 峰為基峰，m/z 430 峰為碎片峰。

圖3 樣品溶液和標(biāo)準(zhǔn)品溶液一級質(zhì)譜圖Fig. 3 Sample solution and standard solution primary mass spectrum

為了進(jìn)一步驗證m/z 430 離子峰的來源， 并探明葉黃素的質(zhì)譜分析裂解規(guī)律， 以m/z 569.4 離子峰為母離子，對葉黃素標(biāo)準(zhǔn)品溶液和樣品溶液中的葉黃素峰進(jìn)行了二級質(zhì)譜分析，樣品和標(biāo)準(zhǔn)品的二級質(zhì)譜圖見圖4。 樣品的二級質(zhì)譜特征離子與標(biāo)準(zhǔn)品一致，確定m/z 430 峰為m/z 569.4 離子峰的碎片峰，更進(jìn)一步確定樣品與標(biāo)準(zhǔn)品為同一物質(zhì)。 根據(jù)葉黃素一級和二級質(zhì)譜特征，推斷葉黃素可能的質(zhì)譜裂解方式，見圖5。

圖4 樣品溶液和標(biāo)準(zhǔn)品溶液二級質(zhì)譜圖Fig. 4 Sample solution and standard solution secondary mass spectrum

圖5 葉黃素裂解規(guī)律圖Fig. 5 Lutein pyrolysis rule

2.2 單因素實驗結(jié)果分析

2.2.1 氫氧化鉀-甲醇溶液質(zhì)量濃度對葉黃素酯皂化效果的影響 由于葉黃素在強(qiáng)堿環(huán)境下易發(fā)生氧化和異構(gòu)化，易轉(zhuǎn)化為玉米黃素，使游離葉黃素得率降低[15]，見圖6。 在固定皂化溫度 35 ℃、皂化時間5 h 的條件下， 考察KOH-甲醇溶液質(zhì)量濃度分別為 5、10、20、30、40 g/dL 時對游離葉黃素得率的影響，結(jié)果見圖 7（a）。 由圖 7（a）可知，氫氧化鉀-甲醇溶液質(zhì)量濃度在5～40 g/dL 范圍內(nèi)， 隨著氫氧化鉀質(zhì)量濃度的增加， 游離葉黃素得率逐漸升高，高于30%則有下降趨勢。 因此選用30 g/dL 的氫氧化鉀-甲醇溶液為皂化液。

圖6 葉黃素轉(zhuǎn)化玉米黃素示意圖Fig. 6 Schematic diagram of lutein conversion to zeaxanthin

2.2.2 皂化溫度對葉黃素酯皂化效果的影響 在固定KOH-甲醇溶液質(zhì)量濃度為30 g/dL，皂化時間5 h 的條件下， 考察皂化溫度分別為 25、35、45、55、65 ℃時對游離葉黃素得率的影響，結(jié)果見圖7（b）。由圖 7（b）可知，皂化溫度在 25～65 ℃范圍內(nèi)，游離葉黃素得率呈先上升后下降的趨勢。 由于溫度過低不利于葉黃素酯在皂化體系中分散，導(dǎo)致皂化不完全，而溫度過高則會導(dǎo)致游離葉黃素的降解和異構(gòu)化，使游離葉黃素得率下降，因此皂化溫度控制在35 ℃為宜。

2.2.3 皂化時間對葉黃素酯皂化效果的影響 在固定KOH-甲醇溶液質(zhì)量濃度為30%、皂化溫度35℃的條件下， 考察皂化時間分別為 2、5、8、11、14 h時對游離葉黃素得率的影響，結(jié)果見圖7（c）。 由圖7（c）可知，皂化時間在 2～14 h 范圍內(nèi)，當(dāng)皂化時間小于5 h 時，隨著皂化時間的延長，游離葉黃素得率呈逐漸增大的趨勢。當(dāng)皂化時間超過5 h 時，游離葉黃素得率逐漸下降。 可能由于5 h 時幾乎所有的葉黃素均以游離狀態(tài)存在，延長皂化時間只能使葉黃素在堿性條件下發(fā)生氧化和異構(gòu)化，游離葉黃素得率反而減少。 因此，選擇皂化時間為5 h。

圖7 單因素試驗結(jié)果Fig. 7 Single factor test results

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化葉黃素酯皂化條件

2.3.1 葉黃素酯皂化條件的工藝優(yōu)化 在單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken 中心組合實驗設(shè)計原理對南瓜葉黃素酯皂化條件進(jìn)行優(yōu)化，選擇皂化液質(zhì)量濃度A、皂化溫度B、皂化時間C 為自變量，以葉黃素得率Y 為響應(yīng)值，設(shè)計三因素三水平的優(yōu)化試驗， 采用Design Expert 8.0.6 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面優(yōu)化實驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Response surface optimization experiment design and results

通過回歸分析得到游離葉黃素得率與皂化液質(zhì)量濃度A、皂化溫度B、皂化時間C 的回歸方程為Y=0.44+0.029A-0.020B+0.018C-7.150×10-3AB-1.200×10-3AC+4.050×10-3BC-0.054A2-0.062B2-0.055C2

回歸方程方差分析結(jié)果見表3。 可知該模型P＜0.000 1，極顯著；失擬項 P 值為 0.676 6，不顯著。 這說明得到的多項回歸方程模型能準(zhǔn)確反映皂化液質(zhì)量濃度、 溫度和時間對南瓜葉黃素酯皂化的影響；模型決定系數(shù)R2=0.974 0，調(diào)整決定系數(shù)R2Adj=0.940 6， 表明本方程可以解釋94%以上的數(shù)據(jù)，該模型擬合度較好，誤差較小，該模型可用于分析與預(yù)測南瓜中游離葉黃素的制備工藝試驗。

通過表3 回歸方程系數(shù)顯著性檢驗，一次項皂化液質(zhì)量濃度 A、溫度B 以及平方項 A2、B2和 C2游離葉黃素得率有極顯著影響，一次項中時間C 可顯著影響游離葉黃素得率，二次項中皂化液質(zhì)量濃度與溫度AB，皂化液質(zhì)量濃度與時間AC 和溫度與時間BC 對游離葉黃素得率影響不顯著。 從F 值可以看出，在所選的各因素水平范圍內(nèi)，皂化液質(zhì)量濃度對葉黃素得率的影響最大， 溫度的影響次之，時間的影響最小，即 A＞B＞C。

2.3.2 響應(yīng)面圖分析 響應(yīng)面圖是由特定的響應(yīng)值對應(yīng)自變量構(gòu)成的三維曲線圖[16]，為了更直觀地反映出各自變量對響應(yīng)值的影響。 本研究根據(jù)回歸方程繪制出各影響因素對南瓜葉黃素得率的響應(yīng)面圖見圖8。 根據(jù)響應(yīng)曲面的傾斜度和等高線密集程度，可確定兩兩因素對響應(yīng)值的影響程度，傾斜度越高，等高線越密集，說明兩者交互作用越顯著[17]。 由圖 8 可知，因素 A、B、C 的曲面傾斜程度皆較高，等高線較緊密，說明因素A、B、C 對響應(yīng)值影響極顯著；因素A 和因素B、因素A 和因素C、因素B 和因素C 的響應(yīng)面的曲面較平緩，其交互作用對游離葉黃素得率的影響不顯著，與方差分析結(jié)果一致。 對回歸方程一階求導(dǎo)，在游離葉黃素得率得最大值時，其皂化液質(zhì)量濃度32.71 g/dL、溫度33.31 ℃、時間5.46 h， 此時南瓜提取物中游離葉黃素得率為0.443 9%。

表3 回歸方程顯著性檢驗Table 3 Regression equation significance test

圖8 交互作用對南瓜葉黃素酯皂化效果的影響Fig. 8 Effect of interaction on the saponification effect of pumpkin lutein ester

2.3.3 驗證試驗 為檢驗方法預(yù)測的結(jié)果，用實驗中得到的最佳工藝條件重復(fù)試驗。 為便于實際操作，將試驗條件確定為，皂化液質(zhì)量濃度33 g/dL，溫度33 ℃，時間5.5 h，修正后的條件制備游離葉黃素3 次，得率分別為 0.412 7%、0.436 5%、0.403 3%，平均得率為0.4175%，與理論值較為吻合，表明優(yōu)選工藝效果較為理想。

2.4 游離葉黃素的純化

通過課題組前期預(yù)試驗比較，最終確定以硅膠為固定相， 石油醚-乙酸乙酯為流動相對游離葉黃素進(jìn)行柱色譜純化。 先用石油醚-乙酸乙酯（3∶1）對雜質(zhì)進(jìn)行分離洗脫，再用石油醚-乙酸乙酯（3∶2）將目標(biāo)產(chǎn)物洗脫下來。 減壓濃縮得游離葉黃素產(chǎn)品，純度達(dá)91.39%，結(jié)果見表4。 游離葉黃素HPLC 色譜圖見圖2（a），與葉黃素標(biāo)準(zhǔn)品出峰時間一致。 結(jié)果表明，利用硅膠柱色譜純化可以快速將目標(biāo)葉黃素分離純化。

表4 游離葉黃素純化結(jié)果Table 4 Free lutein purification results

2.5 南瓜葉黃素的抗氧化活性

2.5.1 南瓜中游離葉黃素對DPPH·清除作用 南瓜葉黃素對DPPH·清除效果隨著游離葉黃素質(zhì)量濃度的提高而逐漸增強(qiáng)，在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈量效關(guān)系，結(jié)果見圖9。南瓜葉黃素質(zhì)量濃度與其對DPPH·清除效果線性回歸分析方程為y=-3.57x2+37.41x-13.8， 相關(guān)系數(shù) R2=0.986 9， 半抑制濃度IC50=0.021 4 mg/mL，擬合程度良好，說明南瓜葉黃素對DPPH·具有明顯的清除作用。

2.5.2 南瓜中游離葉黃素對·OH 清除作用 南瓜葉黃素對·OH 清除效果隨著游離葉黃素質(zhì)量濃度的提高而逐漸增強(qiáng)，在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈量效關(guān)系，結(jié)果見圖9。 南瓜葉黃素質(zhì)量濃度與其對·OH清除效果線性回歸方程為y=-2x2+23.8x-11.8，相關(guān)系數(shù)R2=0.975 2， 半抑制質(zhì)量濃度IC50=0.038 3 mg/mL，擬合程度良好，說明南瓜葉黃素對·OH 具有明顯的清除作用。

圖9 南瓜葉黃素對DPPH·和·OH 的清除作用Fig. 9 Scavenging effects of pumpkin lutein on DPPH·and·OH

3 結(jié)語

采用Box-Behnken 中心組合實驗原理對南瓜中游離葉黃素皂化工藝參數(shù)進(jìn)行響應(yīng)曲面優(yōu)化，得到最佳工藝條件為：皂化液質(zhì)量濃度33 g/dL，溫度33 ℃，時間5.5 h，此時南瓜提取物中游離葉黃素得率為0.417 5%。 在硅膠柱色譜純化后，游離葉黃素的純度可提高到91.39%。 目前，工業(yè)生產(chǎn)葉黃素主要是通過在萬壽菊花亞臨界低溫浸出獲得，其設(shè)備復(fù)雜、 原料昂貴。 本研究得到的優(yōu)化工藝高效、可靠、成本低，可為南瓜葉黃素的進(jìn)一步商業(yè)生產(chǎn)提供技術(shù)參考。

作者采用紫外分光光度法考察了南瓜葉黃素對DPPH·和·OH 自由基清除能力，這是兩種被廣泛認(rèn)可的抗氧化活性評價方法，具有易操作、準(zhǔn)確度高等特點。 南瓜葉黃素清除DPPH·、·OH 的半抑制質(zhì)量濃度IC50分別為 0.021 4 mg/mL 和 0.038 3 mg/mL，結(jié)果顯示南瓜葉黃素具有較好的抗氧化活性。 科學(xué)研究表明，炎癥、癌癥、衰老等大量疾病大都與過量自由基的產(chǎn)生有關(guān)聯(lián)，而抗氧化劑抵消自由基對人體細(xì)胞的氧化攻擊，這也是已知葉黃素其具有保護(hù)視覺、預(yù)防老年性黃斑變性等功效的物質(zhì)基礎(chǔ)。 本實驗結(jié)果證明， 南瓜葉黃素是良好的天然抗氧化劑，具有廣闊的藥品、食品等產(chǎn)業(yè)開發(fā)的前景，為其抗氧化活性相關(guān)研究提供了科學(xué)依據(jù)。