毒死蜱降解菌降解特性及其降解條件優(yōu)化

杜曉敏，王金花，朱魯生，王軍，楊莉莉，林琳

（山東農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，山東省高校農(nóng)業(yè)環(huán)境重點實驗室，山東 泰安271018）

毒死蜱作為廣譜性有機(jī)磷殺蟲劑具有高效、中等毒性等優(yōu)點，是目前全球范圍內(nèi)應(yīng)用最廣泛的5種殺蟲劑之一，廣泛應(yīng)用于蔬菜、棉花等作物[1-3]。毒死蜱在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上大量使用，其殘留問題也引起了人們的關(guān)注。隨著使用量的增加，毒死蜱有可能通過多種途徑進(jìn)入地表水、地下水，對水生生物存在高風(fēng)險，并最終影響環(huán)境生物和人體健康[4-5]。Smalling 等[6]發(fā)現(xiàn)在加利福尼亞州沿海中心河口處，魚類和無脊椎動物體內(nèi)頻繁檢測出毒死蜱的存在。Campillo 等[7]在地中海沿海的一個流入灣湖的永久性河道口中發(fā)現(xiàn)，毒死蜱含量在所監(jiān)測到殺蟲劑中最高。毒死蜱在全球范圍內(nèi)的廣泛使用，導(dǎo)致其在全球很多地區(qū)都可以被檢測到，雖然這種殘留量還不會導(dǎo)致水生生物養(yǎng)殖區(qū)和自然水體中水生生物的大量死亡或滅絕，但是會通過生物富集或者其他方式間接進(jìn)入人體，最終影響人類健康[8]。有研究表明，日常暴露在毒死蜱污染環(huán)境下的人群的呼吸系統(tǒng)患癌率要高于其他人群[9]。調(diào)查顯示，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中使用的毒死蜱大部分最終會進(jìn)入土壤環(huán)境，對土壤環(huán)境產(chǎn)生負(fù)面影響，毒死蜱施用到水稻土中，土壤中真菌數(shù)量明顯減少，土壤酶活性也受到一定影響[10]。因此，毒死蜱污染土壤修復(fù)需求越來越迫切。

微生物修復(fù)技術(shù)是目前應(yīng)用最廣的農(nóng)藥污染土壤生物修復(fù)技術(shù)。自20 世紀(jì)70 年代以來，已分離并鑒定出多株以毒死蜱為碳源和能源的真菌和細(xì)菌，其中黃桿菌（Flavobacterium sp.）[11]是最早發(fā)現(xiàn)并被報道的毒死蜱降解菌。另外，已報道的毒死蜱降解菌主要有青枯菌（Ralstonia sp.）[12]、鐮孢霉屬（Fusarium LK.ex Fx）[13]和糞產(chǎn)堿桿菌（Alcaligenes faecalis）[14]等。Yadav等[15]篩選獲得的一株假單胞菌（Pseudomonas sp.）可以有效降解高濃度毒死蜱，毒死蜱濃度為500 mg·L-1時的24 h 降解率為60%。張群等[16]篩選出一株寡養(yǎng)單胞菌（Stenotrophoomonas sp.），在100 mg·L-1毒死蜱溶液中，pH 7.0、溫度30 ℃培養(yǎng)條件下，4 d 內(nèi)毒死蜱降解率為59%。盡管目前對毒死蜱生物降解的研究已經(jīng)取得了明顯進(jìn)步，但仍需要分離更多降解菌以適應(yīng)不同環(huán)境的需要。為進(jìn)一步豐富毒死蜱降解菌菌種資源，優(yōu)化菌株降解條件，本研究從大田土壤中篩選分離出1 株毒死蜱高效降解菌，并對其進(jìn)行鑒定，采用響應(yīng)面分析法對菌株降解條件進(jìn)行優(yōu)化以提高降解效率，以期為毒死蜱污染土壤原位生物修復(fù)提供材料和方法基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

毒死蜱原藥（97%）由山東華陽集團(tuán)提供。氣相色譜分析所用試劑為分析純。

LB 液體培養(yǎng)基：NaCl 10.0 g，蛋白胨10.0 g，酵母粉5.0 g，蒸餾水1 000 mL，調(diào)節(jié)pH 到7.0 左右，在121 ℃下高壓滅菌20 min。

無機(jī)鹽基礎(chǔ)培養(yǎng)基：K2HPO45.8 g，KH2PO44.5 g，（NH4）2SO42.0 g，MgSO40.16 g，CaCl20.02 g，Na2MoO40.002 g，F(xiàn)eSO40.001 g，MnCl20.001 g，蒸餾水1 000 mL，調(diào)節(jié)pH 到7.0 左右，在121 ℃條件下高壓滅菌20 min。

LB 固體培養(yǎng)基：NaCl 10.0 g，蛋白胨10.0 g，酵母粉5.0 g，瓊脂粉15.0 g，蒸餾水1 000 mL，調(diào)節(jié)pH 到7.0左右，在121 ℃條件下高壓滅菌20 min。

毒死蜱母液：取1 g 毒死蜱，以丙酮為溶劑，定容到100 mL 容量瓶中，充分搖勻，配成10 000 mg·L-1母液。

毒死蜱溶液：取0.25 mL 毒死蜱母液放入100 mL無機(jī)鹽溶液中，使其濃度為25 mg·L-1。

1.2 毒死蜱降解菌的富集與分離

取5 g 土壤加入到50 mL 100 mg·L-1的毒死蜱無機(jī)鹽富集培養(yǎng)液中，置于30 ℃、150 r·min-1恒溫?fù)u床培養(yǎng)7 d，以后每隔7 d按10%接種量取培養(yǎng)液接入新鮮毒死蜱無機(jī)鹽基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，以一定濃度梯度提高毒死蜱用量，至培養(yǎng)液濃度達(dá)到1 000 mg·L-1，如此馴化約2 個月。采用平板劃線法，將最后一次培養(yǎng)液進(jìn)行分離，4 ℃冰箱保存。

1.3 高效毒死蜱降解菌的篩選

將保存的純化菌株接種至LB 固體培養(yǎng)基中，劃線分離單菌落。挑取單菌落至LB 液體培養(yǎng)基中，30 ℃、150 r·min-1恒溫振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期后期。連續(xù)活化2 代后，用生理鹽水將培養(yǎng)液離心洗滌兩次并使菌體重懸。以3% 接種量接種至毒死蜱無機(jī)鹽基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)24 h 后檢測毒死蜱含量，從中挑選降解毒死蜱能力最強(qiáng)的菌株。

1.4 形態(tài)特征鑒定

肉眼觀察降解菌的菌落形狀、顏色、透明度、隆起和邊緣特征，利用掃描電鏡觀察菌體大小和表面形態(tài)。

1.5 16S rDNA基因序列的測定

細(xì)菌基因組DNA 采用EasyPure Genomic DNA Kit試劑盒進(jìn)行DNA 提取和純化，對菌株的16S rDNA基因進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，細(xì)菌通用引物序列F：5′ -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；R：5′-GGCTACC TTGTTACGACT-3′[17]。PCR 反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，循環(huán)30 次；72 ℃終延伸10 min。待反應(yīng)結(jié)束后，取PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，于凝膠圖像成像儀中觀察凝膠電泳結(jié)果。由生工生物工程（上海）股份有限公司完成后續(xù)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測序。

1.6 毒死蜱降解菌降解率的測定

毒死蜱濃度采用安捷倫7890B 氣相色譜儀測定。檢測器為FID，檢測器溫度為300 ℃，進(jìn)樣口溫度為260 ℃；柱溫為程序升溫，初始溫度為140 ℃，以15 ℃·min-1升到200 ℃，保持1 min；載氣流量為7 mL·min-1；壓力為209 kPa，恒壓模式；空氣流量為300 mL·min-1，H2流量為40 mL·min-1；尾吹流量為10 mL·min-1；進(jìn)樣量為1 μL，保留時間4.6 min。本研究采用外標(biāo)法，方法檢出限為0.05 μg·L-1，定量限為1.7 μg·L-1。毒死蜱降解率計算公式：

式中：A0為未接菌對照培養(yǎng)液中毒死蜱的濃度，mg·L-1；A為接菌處理培養(yǎng)液中毒死蜱的濃度，mg·L-1。

1.7 毒死蜱降解菌降解特性

1.7.1 環(huán)境條件對菌株降解毒死蜱的影響

（1）時間對毒死蜱降解率的影響

以3% 接種量將菌懸液接種至50 mL 毒死蜱無機(jī)鹽培養(yǎng)液中，培養(yǎng)時間為12、24、48、72、96 h，pH 為7.0，恒溫培養(yǎng)箱25 ℃、150 r·min-1振蕩培養(yǎng)，底物濃度為25 mg·L-1條件下，取樣測定，計算毒死蜱降解率。

（2）溫度對毒死蜱降解率的影響

以3% 接種量將菌懸液接種至50 mL 毒死蜱無機(jī)鹽培養(yǎng)液中，底物濃度為25 mg·L-1，pH 為7.0，調(diào)整培養(yǎng)溫度分別為15、20、25、30、35 ℃，150 r·min-1條件下振蕩培養(yǎng)，48 h后分別取樣測定并計算毒死蜱降解率。

（3）pH對毒死蜱降解率的影響

將毒死蜱濃度為25 mg·L-1的無機(jī)鹽培養(yǎng)液調(diào)整pH 為4.0、6.0、7.0、8.0、10.0，高溫滅菌后接種降解菌，接種量為3%，在25 ℃、150 r·min-1條件下振蕩培養(yǎng)，48 h后取樣測定并計算毒死蜱降解率。

1.7.2 響應(yīng)面實驗

在單因素試驗基礎(chǔ)上，利用Design-Expert 8.0.6軟件中Box-Behnken design（BBD）模型進(jìn)行3 因素3水平實驗設(shè)計，以培養(yǎng)時間（A）、pH（B）、溫度（C）為自變量，以降解率為唯一響應(yīng)值，實驗設(shè)計因素水平見表1。

1.7.3 降解酶定位實驗

（1）降解酶提取方法

培養(yǎng)24 h 的菌H27 培養(yǎng)液于4 ℃、8 000 r·min-1條件下離心6 min，將下層菌體冷凍保存，加入適量的（NH4）2SO4于上清液中，混勻后使飽和度達(dá)到90% 以上，4 ℃鹽析過夜，離心后收集下層沉淀，加入0.05 mol·L-1、pH 為7.5 的PBS 緩沖液重懸，用相同緩沖液透析至無，收集透析液即為胞外酶[18]。

表1 實驗設(shè)計因素水平表Table 1 Factors and levels of experiment design

將上一步保存的菌體溶于10 mL 0.005 mol·L-1、pH 為7.5 的Tris-HCl 緩沖液中，25 ℃振蕩20 min，再次4 ℃、8 000 r·min-1離心6 min，下層菌體重懸于冷超純水中，冰浴振蕩6 min后離心，上清液即為細(xì)胞周質(zhì)酶。

用現(xiàn)配的0.05 mol·L-1、pH為7.5的PBS緩沖液將保存收集的菌體洗滌3 次，收集的菌體按3 mL·g-1緩沖液重懸，超聲破碎480 s（功率300 W，工作時間4 s，間隔2 s），將破碎細(xì)胞液于4 ℃、8 000 r·min-1條件下離心10 min，上清液即為胞內(nèi)酶[18]。

（2）降解酶定位

將試驗提取的3 種粗酶液各取1 mL 加入到50 mL 毒死蜱降解培養(yǎng)液中，30 ℃、150 r·min-1培養(yǎng)6 h，并設(shè)不加酶液的對照組，測定體系中毒死蜱濃度，并計算降解率及酶活力，進(jìn)而確定酶在細(xì)胞中的分布情況。定義毒死蜱活力單位（U）為30 ℃條件下，1 mL酶液1 h轉(zhuǎn)化1 mol毒死蜱所需酶量。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的分離及鑒定

經(jīng)分離和純化獲得一株毒死蜱高效降解菌，降解率在80% 以上，命名為H27。菌株H27菌落培養(yǎng)特征和掃描電鏡圖如圖1 所示。其形態(tài)學(xué)特征如下：細(xì)胞呈桿狀，能產(chǎn)生芽孢；無鞭毛，不能運動。在LB 平板上的菌落形態(tài)：圓形，乳白色半透明，邊緣整齊，中間隆起，較黏稠。

通過將菌株16S rDNA 序列與GenBank 上其他16S rDNA 序列進(jìn)行Blast 分析（圖2），發(fā)現(xiàn)菌株H27與枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）的相似性為100%。綜合菌株形態(tài)特征以及16S rDNA 序列分析結(jié)果，初步鑒定菌株H27為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。

2.2 環(huán)境因素對菌株H27降解毒死蜱效果的影響

圖1 菌株H27菌落形態(tài)及掃描電鏡圖Figure 1 Colony of strain H27 and scanning electron microscopic

圖3 為不同時間、不同溫度和不同pH 對菌株H27 降解毒死蜱效果的影響。降解菌H27 對毒死蜱的降解隨培養(yǎng)時間的變化如圖3A所示。從圖中可以看出，隨著培養(yǎng)時間的延長，降解菌對毒死蜱的降解率不斷增大，在第24 h 時降解已經(jīng)趨于穩(wěn)定狀態(tài)，平均降解率在80% 以上，說明H27 對毒死蜱具有高效降解效果。

降解菌H27 對毒死蜱的降解隨溫度的變化如圖3B 所示。從圖中可以看出，隨著培養(yǎng)溫度的升高，降解菌對毒死蜱的降解率不斷增大，在25 ℃時達(dá)到最大值，隨著溫度繼續(xù)升高，毒死蜱的降解速率受到明顯抑制。

降解菌H27 對毒死蜱的降解隨pH 的變化如圖3C 所示。從圖中可以看出，降解菌對毒死蜱的降解率隨pH 增大先增大后減小，在pH 為7.0 時達(dá)到最大值，為87.2%。

2.3 菌株H27降解毒死蜱條件的優(yōu)化

綜合考慮各因素對菌H27毒死蜱降解率的影響，在單因素降解試驗基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面分析法對降解時間、溫度、pH 3 個因素分析得到菌H27 的最佳降解條件。菌H27 響應(yīng)面分析實驗設(shè)計及結(jié)果如表2 所示，對表2 中的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，獲得菌H27對自變量溫度、時間、pH 的二元多次回歸方程為：降解率=88.46+0.90A+3.06B-0.80C-1.40AB+0.18AC-0.43BC-1.03A2-5.99B2-5.60C2。由表2 可以看出零點實驗點的降解率較穩(wěn)定，均在88%左右。

圖3 時間、溫度、pH對菌株H27降解毒死蜱的影響Figure 3 Effects of time，temperature and pH on chlorpyrifos degradation by H27

圖2 菌株H27的16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹Figure 2 Phylogenetic tree of strain H27 on the 16S rDNA sequence

實驗結(jié)果的回歸分析見表3。對菌H27 降解率的回歸方程進(jìn)行檢驗，建立的模型是否有意義取決于P值大小，P值遠(yuǎn)小于0.01，說明建立的模型有意義；失擬誤差P 值為0.254 6，不顯著，說明方程對實驗擬合情況較好，誤差??；模型校正決定系數(shù)R2為0.998 5，說明此模型能解釋99.85% 的響應(yīng)值變化，即此模型與數(shù)據(jù)擬合度很高，實驗誤差??；標(biāo)準(zhǔn)偏差（Std）為0.29，平均數(shù)為82.52，變異系數(shù)（CV）為0.35%，表明該模型具有較高的置信度，能夠有效反映真實值的情況。因此，該模型對菌H27降解毒死蜱條件的優(yōu)化合理而有效。

根據(jù)回歸方程繪制響應(yīng)面和等高線圖，結(jié)果如圖4 所示。由圖4 和表3 可知，降解時間（A）和pH（B）的交互作用顯著，B 影響顯著性大于A，AB 的交互作用顯著。A 和C、B 和C 對降解菌的降解率影響顯著，但AC、BC的交互作用不顯著。

通過Box-Behnken 響應(yīng)面優(yōu)化得到枯草芽孢桿菌H27 降解毒死蜱的最佳降解條件為：降解時間54 h，pH 為7.2、溫度為24 ℃時，毒死蜱降解率理論最優(yōu)值為88.96%。在此條件下進(jìn)行實際毒死蜱降解實驗，得到實際毒死蜱降解率為88.16%（3 次重復(fù)平均值），與理論最優(yōu)值擬合度達(dá)到99.20%，表明通過響應(yīng)面法對菌H27降解毒死蜱條件的優(yōu)化合理有效，并具有實際意義。

2.4 毒死蜱降解酶的定位

提取毒死蜱降解酶，分別測定胞外酶、胞內(nèi)酶和細(xì)胞周質(zhì)酶對毒死蜱降解效果的影響，實驗結(jié)果如表4所示。結(jié)果表明，胞外粗酶液與毒死蜱反應(yīng)，30 min內(nèi)毒死蜱降解率為23.9%；胞內(nèi)粗酶液的酶活性較強(qiáng)，降解率為49.6%；細(xì)胞周質(zhì)酶活性略有減小，降解率為35.2%。由此推斷出降解菌產(chǎn)生降解毒死蜱的關(guān)鍵酶是胞內(nèi)酶。

表2 菌H27的響應(yīng)面分析試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Experimental design for response surface analysis and corresponding experimental data

3 討論

本研究成功分離出一株能降解毒死蜱的菌株，經(jīng)鑒定為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。目前從不同地方分離出屬于芽孢桿菌屬的毒死蜱降解菌已有很多，如側(cè)芽孢桿菌DSP[19]、Dsp-1和Dsp-3[20]，蠟狀芽孢桿菌HY-1[21]、HY-4[22]和FO-36bT[23]等。有報道指出，該屬細(xì)菌能降解許多污染物，如石油烴、苯酚、有機(jī)磷農(nóng)藥等[24-25]。已有研究顯示芽孢桿菌屬菌株在污染物微生物修復(fù)方面具有巨大潛力。但報道也指出，多數(shù)毒死蜱降解菌環(huán)境適應(yīng)性較差，例如側(cè)芽孢桿菌DSP 在其降解最適pH 為7.0 時，降解率在60% 以上，而pH為5.0和9.0時，毒死蜱降解率僅為20%和30%，說明該毒死蜱降解菌受pH 影響較大，環(huán)境適應(yīng)性較差。本研究中降解菌H27為枯草芽孢桿菌，屬于典型的有益細(xì)菌，具有控制不同類型細(xì)胞發(fā)育的能力。因此其對外界有害因子抵抗力強(qiáng)，分布于土壤環(huán)境、水環(huán)境、大氣環(huán)境及動物腸道等處。降解菌H27在中性或弱堿性的條件下都具有較高的活性，在pH為4.0以及pH 為10.0 的條件下依然具有明顯的降解效果，即使最低的降解率也達(dá)到了54.81%，所以該菌對pH 具有較高的耐受性，可以適應(yīng)比較寬范圍的pH變化。

表3 菌H27響應(yīng)分析試驗回歸分析結(jié)果Table 3 Results of the regression analysis of response analysis

圖4 時間、溫度和pH及其交互作用對毒死蜱降解率影響的曲面圖和等高線圖Figure 4 Response surface and contour plot of time，temperature，pH and their interactions on degradation of chlorpyrifos

表4 菌H27不同組分對毒死蜱的降解Table 4 Biodegradation of chlorpyrifos in the different component of strain H27

響應(yīng)面分析法是結(jié)合實驗設(shè)計和數(shù)學(xué)建模的一種方法，目的是尋找多因素系統(tǒng)中的最佳條件，已被廣泛應(yīng)用到微生物培養(yǎng)基優(yōu)化中，但利用響應(yīng)面分析法優(yōu)化降解條件的研究較少。已報道的降解菌降解特性研究大部分都以單因素實驗為主，例如范瑞娟等[26]研究了不同鹽度和pH 條件下菌株對多環(huán)芳烴（PAHs）的降解特性；錢娜等[27]研究了不同pH、溫度和NaCl濃度對降解菌株生長的影響；賀強(qiáng)禮等[28]運用單因素實驗初步確定苯酚降解的最適條件，在此基礎(chǔ)上利用響應(yīng)面分析法確定其最優(yōu)降解條件，優(yōu)化后的最佳降解條件可使菌株對苯酚降解率提高7% 左右；王博等[29]在響應(yīng)面法優(yōu)化氨氮降解菌凈化高原地區(qū)污水研究中發(fā)現(xiàn)，降解時間、pH 和接種量對降解率有顯著影響，且3 因素交互作用對響應(yīng)值有一定影響，響應(yīng)面分析法所得最佳降解條件比單因素實驗降解條件下提高8.12%。由此可以看出，與單因素實驗相比，在響應(yīng)面分析優(yōu)化后的降解條件下菌株降解率會有一定提高。本研究利用響應(yīng)面法優(yōu)化設(shè)計，研究了時間、pH 和溫度3 個因素對菌株降解毒死蜱效果的影響，得到最佳降解條件下降解率有一定提高，且實際降解率與預(yù)測值接近，說明此方法能有效預(yù)測并優(yōu)化菌株對污染物的降解。在后續(xù)研究中可利用研究所得模型與實際農(nóng)藥降解相結(jié)合，最大程度地去除環(huán)境中的農(nóng)藥污染。在研究中發(fā)現(xiàn)，通過響應(yīng)面實驗優(yōu)化降解條件，一定程度上提高了降解菌降解率，但仍不能達(dá)到100%，推測可能是毒死蜱降解產(chǎn)物對毒死蜱降解過程產(chǎn)生了影響。有研究表明毒死蜱初級代謝產(chǎn)物為3，5，6-三氯-2-吡啶酚（TCP），累積的TCP會對環(huán)境中細(xì)菌、真菌和放線菌產(chǎn)生一定抑制作用，不僅影響微生物自身生長繁殖，還會抑制毒死蜱降解[30-31]。

生物降解是通過生物作用，將大分子物質(zhì)轉(zhuǎn)化成小分子化合物的過程。生物降解農(nóng)藥主要通過微生物及有關(guān)酶來進(jìn)行。目前研究普遍認(rèn)為毒死蜱主要通過共代謝和礦化作用進(jìn)行微生物降解[32]。微生物降解化學(xué)農(nóng)藥的作用方式有兩大類：一類是通過酶促反應(yīng)。首先微生物細(xì)胞表面吸附農(nóng)藥，此過程是動態(tài)平衡，降解初期出現(xiàn)“遲緩期”；然后農(nóng)藥進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)；最后農(nóng)藥在細(xì)胞膜內(nèi)發(fā)生酶促反應(yīng)，此過程較快。微生物通過酶促反應(yīng)降解農(nóng)藥的方式主要有氧化、脫氫、還原和水解等類型[33]。另一類是通過微生物活動改變環(huán)境的理化特性，間接作用于農(nóng)藥[34]。大多數(shù)微生物降解農(nóng)藥反應(yīng)屬于酶促反應(yīng)。降解物種類不同，降解酶在微生物細(xì)胞中分布位置也不同。已有報道指出，一些降解酶屬于胞內(nèi)酶和胞外酶，還有一些分布在細(xì)胞周質(zhì)中。劉亞光等[35]研究發(fā)現(xiàn)降解菌W2 降解異噁草松關(guān)鍵酶是胞內(nèi)酶；王卓婭等[36]研究發(fā)現(xiàn)克雷伯氏菌ZD112 降解氯氰菊酯的關(guān)鍵酶位于細(xì)胞內(nèi)；湯鳴強(qiáng)等[37]發(fā)現(xiàn)一株降解三唑磷農(nóng)藥的降解菌，其降解關(guān)鍵酶為胞內(nèi)酶；任明[38]分離出一株高效降解毒死蜱的不動桿菌（Acinetobacter sp.），通過降解酶定位研究發(fā)現(xiàn)其降解關(guān)鍵酶是胞內(nèi)酶；徐蓮等[39]發(fā)現(xiàn)降解功夫菊酯的芽孢桿菌GF-3 的降解酶是胞外酶。由此可見，微生物不同位置的降解酶可能與污染物降解過程有關(guān)[40]。由于微生物對毒死蜱降解過程的復(fù)雜性，且芽孢桿菌屬降解毒死蜱的微生物酶定位還不明確。因此，本研究以毒死蜱為研究對象，通過室內(nèi)實驗研究毒死蜱微生物芽孢桿菌降解酶定域，為降解酶的進(jìn)一步研究提供了理論基礎(chǔ)。后續(xù)研究中應(yīng)加強(qiáng)對降解機(jī)理的研究，開發(fā)出更高效的降解酶資源。同時，毒死蜱降解酶基因工程將是今后研究方向之一，通過基因工程技術(shù)將毒死蜱降解酶基因克隆到宿主菌中使其高效表達(dá)，構(gòu)建高效農(nóng)藥降解菌，對于生態(tài)農(nóng)業(yè)發(fā)展、保護(hù)生態(tài)環(huán)境有著重要的意義。

4 結(jié)論

（1）本研究篩選出一株毒死蜱高效降解菌，將其命名為H27。經(jīng)菌落形態(tài)分析和16S rDNA 基因序列鑒定，確定菌株H27 為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。

（2）通過單因素實驗確定毒死蜱降解的最適時間為48 h，最適溫度為25 ℃，最適pH 為7.0。采用中心組合實驗設(shè)計，結(jié)合Box-Behnken 及響應(yīng)面分析，優(yōu)化菌株H27 降解條件為：降解時間54 h、pH 7.2、溫度24 ℃，在此條件下該毒死蜱高效降解菌對毒死蜱的降解率可達(dá)88.96%。

（3）菌株H27降解毒死蜱的關(guān)鍵酶是胞內(nèi)酶。