成年人血DDT含量與DNA氧化損傷及糖脂代謝的關(guān)聯(lián)研究

劉亞航，徐曉凡，趙慧

【摘要】目的：探究成年人血滴滴涕（DDT）水平與DNA氧化損傷及糖脂代謝的關(guān)聯(lián)，以及DDT是否通過氧化損傷DNA影響糖脂代謝。方法：本研究以武漢社區(qū)隊(duì)列漢口、漢陽2個(gè)社區(qū)的居民603名。通過問卷調(diào)查收集個(gè)人基本信息和生活習(xí)慣及職業(yè)史等信息，通過體檢檢測血糖血脂平，并收集空腹外周血和隨機(jī)尿樣。本研究采用GC-MS/MS測定研究對象的血清中DDT水平，以此評估人群DDT的內(nèi)暴露量;采用高效液相色譜法測定DNA氧化損傷標(biāo)志物：尿8-OHdG水平，采用線性回歸模型分析DDT與尿8-OHdG、血糖水平、血脂水平、糖尿病以及高脂血癥的關(guān)聯(lián);采用中介分析法分析8-OHdG在DDT與糖脂代謝關(guān)聯(lián)中的中介效應(yīng)，為機(jī)制探索提供一定依據(jù)。結(jié)果：血中pp’-DDT水平與血糖和血脂有明顯關(guān)聯(lián)，暫不能排除8-OHdG的中介作用。

【關(guān)鍵詞】DDT;8-OHdG;血糖;血脂;中介效應(yīng)分析

【中圖分類號】R363 【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A 【DOI】10.12332/j.issn.2095-6525.2020.13.253

DDT是一種持久性有機(jī)污染物（persistentorganicpollutants，POPs），具有高毒性、持久性、積累性和遷移性。近年來我們我國居民體內(nèi)DDT水平是否發(fā)生變化尚未可知。本研究通過檢測一般城市居民血中DDT含量來評估DDT的殘留情況。既往研究多關(guān)注DDT的致癌性和生殖毒性，而較少有研究關(guān)注DDT對代謝性疾病的影響。糖尿病和高脂血癥是環(huán)境相關(guān)性代謝性疾病。多項(xiàng)研究表明，發(fā)生與多種因素相關(guān)，另外，DDT暴露可誘導(dǎo)機(jī)體的氧化應(yīng)激和系統(tǒng)炎癥，而氧化損傷是糖尿病和高脂血癥等代謝性疾病的重要致病機(jī)制。

基此，本研究以中國城市成年居民為研究對象，探討DDT對血脂代謝的影響以及其部分機(jī)制，為綜合防控糖尿病和高脂血癥提供一定的科學(xué)依據(jù)。8-羥基脫氧鳥苷（8-hydroxy-2’-deoxyguanosine，8-OHdG）是由ROS介導(dǎo)的氧化性損傷的主要代表形式，故選取尿8-OHdG作為評價(jià)機(jī)體氧化性DNA損傷的標(biāo)志。肌酐是人體內(nèi)生代謝產(chǎn)物，其生成和排泄均較恒定，此為了排除因尿液稀釋和個(gè)體差異等因素的影響，用尿肌酐來校正尿8-OHdG。

1 資料與方法

1.1資料來源

研究對象來自武漢社區(qū)隊(duì)列。本部分?jǐn)?shù)據(jù)來自長期居住在武漢市漢陽江漢小區(qū)和湖濱小區(qū)的成年居民共603人。排除因血樣不足以檢測DDT數(shù)據(jù)的樣本（n=168）后，有435人有齊全的血DDT檢測數(shù)據(jù)。排除因尿樣不足以檢測8-OHdG和尿肌酐數(shù)據(jù)的樣本（n=30），并在此基礎(chǔ)上，排除自報(bào)有患有糖尿病、高血脂、腫瘤、中風(fēng)、心梗、慢阻肺、肺氣腫、關(guān)節(jié)炎、胸膜炎、肝炎或腎炎的部分，其余（n=351）納入本部分研究。

所有研究對象均簽署知情同意書。本研究獲得華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2試劑

標(biāo)準(zhǔn)農(nóng)藥混合試劑（PesticideMix17）、正己烷、二氯甲烷（DCM）、8-OHdG標(biāo)準(zhǔn)品購于美國Sigma公司;分析純尿素購于上海國藥控股化學(xué)試劑有限公司;HPLC級甲醇為德國Merck公司產(chǎn)品;磷酸二氫鉀、乙酸、檸檬酸和乙二胺四乙酸（EDTA）為北京國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品;氫氧化鈉試劑來自天津光復(fù)精細(xì)化工研究所;乙酸鈉來自天津科密歐試劑有限公司;肌酐（CREA）測定試劑購于深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司;雙蒸水（監(jiān)控室的純水）來自武漢市泓源企業(yè);高純度氦氣（N99.999%）;去離子水。所有試劑使用前均用0.22μm微孔濾膜過濾。

1.3方法

1.3.1 血DDT水平測定

取出冰凍分裝的血漿（0.5ml）融化至室溫，離心混勻。加入13C6標(biāo)記的HCB，再加入0.5mL去離子水，進(jìn)行渦流。用500mg尿素對血漿蛋白進(jìn)行變性處理，渦旋超聲處理25min。分離有機(jī)相至另一試管中，在40℃水浴下氮吹濃縮至0.5ml。將HLB固相萃取小柱裝在VacElutSPE24上，依次用3mLDCM、5mL甲醇和5mL去離子水進(jìn)行淋洗。在最大真空度下抽真空干燥10min。

采用無分流方式將1μL提取液注入到配備了AgilentDB-5ms（30m×0.25mm×0.25μm）毛細(xì)管柱的Agilent6890N-5975氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀中，注射入口溫度設(shè)定為250℃。以高純度氦氣（N99.999%）為載氣，控制恒定流速為1.0mL/min。烘箱溫度程序設(shè)置為：初始溫度60℃保持1min，后每分鐘升高30℃至180℃保持1min，然后每分鐘升高7℃至280℃保持2min。使用MassHuntersoftware軟件進(jìn)行儀器控制、數(shù)據(jù)采集與分析。

1.3.2 尿8-OhdG水平測定

取出冰凍分裝的2ml尿樣于38℃水浴融化，離心10min（4℃，5000rpm）。固相萃取（SPE）小柱的預(yù)處理：將BondElutLRCC18-OH固相萃取柱調(diào)為低真空密度。依次加入約10ml純甲醇、約5ml去離子水，約10ml0.1mol/LKH2PO4（pH6.0）沖洗。再用3ml去離子水淋洗，在最大真空度下抽真空干燥10min。尿液吸附、洗脫、收集，取1.5ml預(yù)處理尿樣過C18-OH固相萃取柱小柱。依次用3ml0.1mol/LKH2PO4（pH=6.0）、3ml5%甲醇淋洗，抽干5min。最后用1ml純甲醇洗脫SPE小柱吸附的尿樣，并收集洗脫液于1.5mlEp管，置于快速真空濃縮儀吹干甲醇（45℃，約3h，根據(jù)實(shí)際情況確定），4℃冰箱保存，進(jìn)樣前用0.1mol/L的KH2PO4（pH=6.0）1ml定容。臨分析前，將樣品用針頭式濾器過濾至自動進(jìn)樣小瓶;再從中取100：l與900：l過濾的0.1mol/LKH2PO4（pH=6.0）混勻，40℃保存。取20μl進(jìn)樣檢測。并制備8-OhdG標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3 尿肌酐測定

將冰凍分裝的尿樣于37℃水浴融化，混勻，再取10：l融化尿樣和490：l蒸餾水（比例可隨意，如1：19）置于1.5ml離心管中，用恒溫震蕩混勻器（1400R/37℃）混勻，剪去離心管蓋子，準(zhǔn)備進(jìn)樣檢測。

1.3.4 血生化水平測定

用全自動生化分析儀測定血糖濃度、TCHO和TG水平。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

樣本中血op’-DDT和pp’-DDT的濃度高于檢出限（99%），可納入研究。采用one-sampleKolmogorov-Smirnov檢驗(yàn)研究變量的正態(tài)性分布;將血pp’-DDT 經(jīng)box-cox轉(zhuǎn)換后、尿8OH-dG經(jīng)自然對數(shù)轉(zhuǎn)換后（pp’-DDT^（-0.8739））納入研究，用Wilcoxon檢驗(yàn)用于比較血DDT和尿8OH-dG在男女兩性中的差異;用logistics 回歸分析方法計(jì)算OR值和95%置信區(qū)間（95%CI），分析血 pp’-DDT水平與尿8-OHdG水平的相關(guān)性。用線性回歸分析方法分析血pp’-DDT 水平與尿8-OHdG水平的相關(guān)性;

2 結(jié)果

2.1 血DDT和尿 8-OHdG在不同性別中的差異分析

使用Wilcoxon檢驗(yàn)在不同性別中，血中DDT和尿8-OHdG的分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表1）。

2.2 城市居民血 DDT 與尿 8-OHdG的關(guān)聯(lián)性

根據(jù)尿8-OHdG水平的四分位數(shù)將研究人群分為 P25、P50、P75、P100四個(gè)組，以尿 8-OHdG最低濃度 P25 為對照組，用多元 logistics 回歸分析血 pp’-DDT 水平與尿 8-OHdG 水平的相關(guān)性，結(jié)果見表2。并用線性回歸模型進(jìn)行分析，結(jié)果見表3。

2.3 血DDT、尿8-OHdG與糖脂代謝的關(guān)聯(lián)性

TG經(jīng)k-s檢驗(yàn)符合正態(tài)分布（D=0.066，P 值=0.07912）;血 TCHO經(jīng)k-s檢驗(yàn)符合正態(tài)分布（D=0.065，P 值=0.08227）;血糖經(jīng)過 box-cox 轉(zhuǎn)換（GLU^（-2.4））后符合正態(tài)分布（D=0.068，P 值=0.06275）;用中介效應(yīng)模型來分析血pp’-DDT、尿8-OHdG與糖脂代謝之間的相關(guān)性（表4）。

四分法logistics回歸分析血pp’-DDT水平與尿8-OHdG水平的相關(guān)性結(jié)果第六列是瓦爾德檢驗(yàn)顯著性值（P值），此值大于0.05說明對應(yīng)自變量（血pp’-DDT）的系數(shù)沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，沒有依據(jù)證明自變量（血pp’-DDT）對因變量（尿8-OHdG）不同分類水平的變化有顯著影響。

線性回歸分析血pp’-DDT水平與尿8-OHdG水平的相關(guān)性回歸系數(shù)檢驗(yàn)表第六列的顯著性系數(shù)（P值）均大于0.05，故沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

線性回歸分析血pp’-DDT水平與尿8-OHdG水平的相關(guān)性系數(shù)表第六列的顯著性系數(shù)（P值）均大于0.05，故沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

本研究是以武漢市社區(qū)成年人為研究對象，通過問卷調(diào)查、健康體檢和實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)，檢測其血DDT檢出水平可反映普通市民暴露背景DDT的水平。血中DDT的含量集中在一個(gè)很小的范圍內(nèi)，整體值偏小。這與我國 1983年后禁用 DDT有很大的關(guān)系，但由于DDT 在土壤中的半衰期從幾年到十幾年不等，故仍可在土壤和農(nóng)產(chǎn)品中檢測到 DDT 的殘留[1]。本次用到的數(shù)據(jù)是基線數(shù)據(jù)，有理由相信后續(xù)隨訪中血 DDT 的含量會更低。本次數(shù)據(jù)的研究對象都居住在武漢的同一個(gè)小區(qū)，居民飲食的來源地比較局限，這也是DDT 含量集中在一個(gè)很小范圍的原因之一。而尿中 8-OHdG 的分布呈右正偏態(tài)，這與機(jī)體的氧化反應(yīng)與抗氧化反應(yīng)水平的相關(guān)，符合先前報(bào)道中的分布情況[2]。本研究表明，在不同性別中，血中 DDT 和尿8-OHdG 的分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。當(dāng)然，影響尿中 8-OHdG 的因素有很多，諸如飲食習(xí)慣、吸煙、飲酒、年齡等，在后續(xù)的研究中可以將多種影響因素引入，分類變量以百分比表示，以 Chi-square 檢驗(yàn)比較各組間的差異;連續(xù)型變量以平均值（標(biāo)準(zhǔn)偏差）表示，用t檢驗(yàn)比較各組之間的差異。分析比較了不同性別血中DDT殘留量的差異，結(jié)果無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。發(fā)現(xiàn)血中pp’-DDT與糖脂代謝水平有顯著性關(guān)聯(lián)。由于建模的失敗，導(dǎo)致中介效應(yīng)分析的探究失敗。已有文章闡釋了8-OHdG與糖尿病的關(guān)聯(lián)[3]，暫不能排除氧化性損傷在DDT對糖脂代謝影響中的中介作用。后續(xù)研究中可以在自變量（DDT）與中介變量（8-OHdG）建模成功后再分析氧化性損傷在其中發(fā)揮的作用。DDT對多種器官和系統(tǒng)有明顯的毒性作用，有報(bào)道顯示，DDT可引起明顯的肝臟損傷[4]，而肝臟是進(jìn)行氧化與抗氧化反應(yīng)和物質(zhì)代謝的重要場所，與糖脂代謝關(guān)系密切。故值得進(jìn)一步探討氧化損傷在其中發(fā)揮的作用。

下一步的研究思路：加入混雜因素進(jìn)行分析，如：年齡、性別、飲食習(xí)慣、飲酒、鍛煉等，分析這些混雜因素在男女性別中的分布差異，并進(jìn)行卡方檢驗(yàn);探究血DDT和尿8-OHdG是否符合二元logistic回歸，并將混雜因素加入回歸模型進(jìn)行校正;探究氧化損傷在血pp’-DDT與尿8-OHdG的關(guān)聯(lián)關(guān)系中的作用。

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作者簡介：

劉亞航（1998.9—），女，黑龍江省齊齊哈爾市人，湖北省武漢市華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院，預(yù)防醫(yī)學(xué)專業(yè)，本科生。

徐曉凡（1999.11—），安徽省合肥市人，湖北省武漢市華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院，預(yù)防醫(yī)學(xué)專業(yè)，本科生。

趙慧（1999.12—），河北省邯鄲人，湖北省武漢市華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院。預(yù)防醫(yī)學(xué)專業(yè)。本科生。