藏紅花素通過PGC-1α/SIRT3信號通路抑制慢性阻塞性肺疾病模型大鼠的氣道炎癥

謝圓媛 楊丹芬 王莉

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是一種可預防、可治療的肺部疾病，其特征是持續(xù)氣流受限和不完全的可逆性[1]。COPD現(xiàn)已成為嚴重威脅人類健康的常見疾病，預計到2020年將成為全球第三大死亡原因[2]。成人COPD的患病率隨年齡增長而增加，目前，全世界40歲以上成年人的COPD患病率已達到9%～10%[3]。香煙煙霧被認為是造成COPD的主要原因，可直接損害支氣管上皮細胞的功能，而支氣管上皮細胞作為抵抗有害氣體的第一個解剖學氣道屏障，損害后將會產(chǎn)生過度炎癥反應，導致COPD出現(xiàn)許多異常的結構變化[4-5]。

藏紅花素是番紅花中的一種水溶性類胡蘿卜素，也是藏紅花的主要成分之一[6]。作為一種有效的抗氧化劑，藏紅花素具有多種藥理活性，主要包括抗凋亡、抗炎，保護神經(jīng)和心臟等[7-8]。有研究表明，口服藏紅花素可顯著降低細胞損傷以及組織壞死的生物標志物，如乳酸脫氫酶活性和腎臟中NO含量，并增加過氧化氫酶活性[9]。而藏紅花素在COPD中的作用卻幾乎未見報道，因此，探索其在COPD發(fā)生過程中的作用及探討其機制，對于尋找COPD治療新靶點及新型藥物有著重要意義。

資料與方法

一、儀器與試藥

藏紅花素(純度≥99.9%)、10%水合氯醛與脂多糖(美國 Sigma 公司)，過濾嘴香煙(焦油含量為19 mg，尼古丁含量為 1.2 mg，南寧卷煙廠生產(chǎn))，酶聯(lián)免疫吸附試劑盒、BCA蛋白測定試劑盒與ECL顯色液(中國碧云天生物技術研究所)，TUNEL檢測試劑盒(美國Maxim BIO公司)，Trizol 試劑盒(美國Santa Cruz公司)，Primescript RT reagent kit with gDNA Eraser試劑盒與SYBR Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒(日本Takara公司)，RIPA 裂解液(美國Invitrogen 公司)，HE染色試劑盒(北京索萊寶科技公司)，抗β-actin、抗PGC-1α、抗SIRT3以及HRP標記山羊抗兔 IgG抗體(英國Abcam公司)。

二、動物

60只健康雄性SPF級SD大鼠，體質量(200±20)g，由延安大學醫(yī)學院動物研究中心提供，許可證號為SCXK(陜)2019-0001。

三、方法

1 動物飼養(yǎng)與分組 將所有大鼠在溫度(22±3)℃，相對濕度在50%～70%的環(huán)境中分籠飼養(yǎng)，期間自由飲水與攝食，適應性飼養(yǎng)7d后開始實驗。將60只SD大鼠隨機分為4組，每組15只，分別為：(1)正常對照組，(2)COPD組，(3)COPD+藏紅花素低劑量組(10 mg/kg)，(4)COPD+藏紅花素高劑量組(50 mg/kg)。藏紅花素劑量參考以往研究[10]并結合實驗具體情況施用。(2)、(3)、(4)組大鼠通過香煙熏吸加氣道內注入脂多糖(LPS)的方法建立COPD 大鼠模型。

2 COPD大鼠模型制備與給藥 參考文獻方法[11]來構建COPD大鼠模型。將SD大鼠放于自制玻璃熏煙箱內，每次放10只，并點燃10根香煙，煙熏15 min 后打開箱子頂蓋，散去煙霧5 min，接著重復上述步驟兩次，每日進行一次，在實驗結束后將大鼠轉移至正常環(huán)境下飼養(yǎng)，實驗連續(xù)30 d。在實驗期間第1 d和第15 d，使用10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，固定于固定板上，暴露其氣管，在氣管內快速注入100 μL LPS(1 mg/mL)，旋轉固定板，使LPS盡可能均勻分布于大鼠兩肺。正常對照組大鼠于第1 d和第15 d氣管內注入生理鹽水(2 mL/kg)，其余時間均進行正常培養(yǎng)。使用生理鹽水將藏紅花素配制為5 g/L的溶液，藏紅花素低劑量組、高劑量組分別于連續(xù)熏煙3 d 后，于第4 天熏煙前1 h，分別腹腔注射藏紅花素溶液10 mg/kg、50 mg/kg,每日一次，直至造模結束。造模完成24 h后，對各組大鼠進行肺功能檢測，抽取動脈血并收集肺泡灌洗液，摘取肺組織，一部分固定在10%福爾馬林溶液中，一部分保存于-80 ℃冰箱中。

3 肺功能評估 使用10%水合氯醛腹膜內麻醉大鼠。固定四肢及頭部，頸部消毒，鈍性逐層分離頸部皮下組織至暴露氣管，將氣管插管并連接到動物肺功能檢測儀(FGC-A+型全自動肺功能測試儀)，記錄大鼠相關肺功能指標，包括呼氣峰流量(peak expiratory flow，PEF)、吸氣峰流量(peak inspiratory flow，PIF)及0.3秒用力呼氣容積與用力肺活量比值(FEV0.3/FVC)。

4 肺泡灌洗液收集 使用10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，將大鼠四肢及頭部固定，消毒后打開胸腔暴露大鼠氣管，在氣管下端橫縱切一小“T”形切口，將插管沿著此切口插入，成功插入后立刻結扎固定。采用注射器吸取2 mL預熱的生理鹽水，通過導管緩慢注入大鼠肺部進行灌洗，輕柔按摩大鼠胸前區(qū)，30 s后緩慢抽回灌洗液，再將抽回的灌洗液緩慢注入肺內，如此重復此步驟，直到可見乳白色泡沫狀液體表示灌洗成功，收集灌洗液。

5 ELISA檢測 將抽取的大鼠動脈血于室溫下靜置1 h，2000 r/min離心20 min，分離出血清。將肺支氣管肺泡灌洗液(BALF)置于離心管，2000 r/min 離心5 min，取上清液。用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測血清和BALF中IL-1β、IL-6與TNF-α的含量，所有操作步驟均嚴格按照ELISA試劑盒說明書進行。

6 HE染色 將固定好的大鼠肺組織，經(jīng)脫水、常規(guī)石蠟包埋后，切成5 μm厚度的石蠟切片，進行蘇木精-伊紅(HE)染色。依次滴加蘇木精，染色5 min后流水沖洗，接著滴加伊紅染色3 min，再次流水沖洗，使用乙醇進行脫水，自然晾干后，置于二甲苯中透明10 min，中性樹膠封片，于顯微鏡下觀察肺組織病理形態(tài)改變并拍照。

7 TUNEL 大鼠肺組織的石蠟切片常規(guī)脫蠟后，滴加20 μg/mL不含DNase 的蛋白酶K，室溫孵育30 min，PBS洗滌3次，3%H2O2溶液處理10 min，PBS 洗滌3次，滴加50 μL TUNEL檢測液于樣品上，在濕盒中37℃孵育1 h，PBS洗滌3次后，加100 μL streptavidin標記HRP(1 ∶500)30 min，用PBS浸洗3 次。接著滴加100 μL DAB顯色溶液，室溫孵育10 min，PBS再次洗滌3次，蘇木素復染細胞核后立即用自來水沖洗。采用梯度酒精脫水，二甲苯透明2 次，每次1 min，中性樹膠封片。于光鏡觀察并分析結果，陽性凋亡細胞表現(xiàn)為細胞質凝集，分布于細胞核周邊，胞核固縮且呈深褐色。計算肺組織中凋亡細胞的表達情況。

8 實時定量PCR 將大鼠肺組織研磨勻漿，使用Trizol試劑提取肺組織總RNA，分光光度計檢測RNA的純度及濃度。Primescript RT reagent kit with gDNA Eraser試劑盒說明書進行逆轉錄合成cDNA，qRT-PCR按照SYBR Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒說明書檢測PGC-1α、SIRT3 mRNA表達水平，GAPDH作為內參基因。反應條件為：95 ℃預變性3 min，95 ℃變性20 s，60 ℃退火15 s，72 ℃ 延45 s，循環(huán)40 次，實驗重復3次。引物由上海生工生物有限公司合成，具體序列為：PGC-1α上游引物：5′-GTGCAGCCAAGACTCTGTATGG-3′，下游引物：5′-GTCCAGGTCATTCACATCAAGCAAGTT-3′，SIRT3上游引物：5′-CCCAATGTCGCTCACTACTTCC-3′，下游引物：5′-CGTCAGCCCGTATGTCTTCC-3′，GAPDH上游引物：5′-TTCCTACCCCCAATGTATCCG-3′下游引物：5′-CATGAGGTCCACCACCCTGTT-3′。采用2-ΔΔCt 法計算各基因mRNA相對表達量。

9 Western blot 在大鼠肺組織加入預冷的RIPA裂解液研磨裂解肺組織，以12000 r/min離心5 min，獲得上清液。按照BCA試劑盒說明測定總蛋白濃度。取25 μg總蛋白上樣，通過10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，并將分離蛋白轉移至聚偏二氟乙烯膜上。TBST洗滌3次，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，然后加入一抗PGC-1α(1 ∶1000)，SIRT3(1 ∶500)和β-actin(1 ∶1000)抗體，在4 ℃下孵育過夜。次日TBST洗膜3次，加入辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG(1 ∶1000)為二抗，在室溫下孵育2 h。再次TBST洗滌3次，滴加ECL發(fā)光液進行顯影，采用Image J圖像分析軟件統(tǒng)計各條帶灰度值并計算各蛋白表達水平。

四、統(tǒng)計學處理

結 果

一、藏紅花素改善 COPD 大鼠肺功能指標

大鼠肺功能檢測結果顯示，與空白對照組比較，COPD組、COPD+低劑量藏紅花素組及COPD+高劑量藏紅花素組的肺功能指標PEF、PIF、FEV 0.3/FVC均顯著下降(P<0.01)；與COPD組比較，COPD+低劑量藏紅花素組與COPD+高劑量藏紅花素組PEF、PIF及FEV 0.3/FVC均顯著升高(P<0.01)，且COPD+高劑量藏紅花素組PEF、PIF、FEV 0.3/FVC顯著高于COPD+低劑量藏紅花素組(P<0.01)(見表1)。

表1 各組大鼠相關肺功能指標檢測結果

二、藏紅花素抑制 COPD 大鼠肺組織病理損傷

各組大鼠肺組織HE染色結果(見圖1)所示，空白對照組大鼠肺組織的肺泡結構清晰，間隔正常，肺泡壁完整，無明顯炎細胞浸潤、充血、滲出等現(xiàn)象。COPD組肺組織中可見肺泡結構破壞，斷裂，相鄰肺泡腔相互融合成肺大皰，出現(xiàn)大量炎性細胞浸潤。COPD+低劑量藏紅花素組與COPD+高劑量藏紅花素組大鼠肺組織肺泡破裂融合以及炎性細胞浸潤等情況較COPD組大鼠有所改善，且COPD+高劑量藏紅花素組大鼠病理損傷改善更為明顯。

圖1 HE染色觀察各組大鼠肺組織病理損傷情況(×400)

三、藏紅花素降低COPD 大鼠血清和BALF中炎癥因子表達

各組大鼠血清和BALF中炎癥細胞因子檢測結果顯示，與空白對照組比較，COPD組、COPD+低劑量藏紅花素組、COPD+高劑量藏紅花素組，大鼠血清和BALF中IL-1β、IL-6、TNF-α含量顯著增加(P<0.01)；與COPD組比較，COPD+低劑量藏紅花素組與COPD+高劑量藏紅花素組，血清和BALF中IL-1β、IL-6、TNF-α含量顯著下降(P<0.01)；而COPD+高劑量藏紅花素組血清及BALF中IL-1β、IL-6、TNF-α含量較COPD+低劑量藏紅花素組顯著下降(P<0.01)(見表2、3)。

表2 各組大鼠血清中炎癥細胞因子表達情況

表3 各組大鼠BALF中炎癥細胞因子表達情況

四、藏紅花素抑制大鼠肺組織肺泡上皮細胞凋亡

各組大鼠肺組織TUNEL染色結果顯示，COPD組、COPD+低劑量藏紅花素組、COPD+高劑量藏紅花素組肺組織肺泡上皮細胞中出現(xiàn)較多棕黃色著色的細胞，細胞凋亡率較空白對照組均顯著上升(P<0.01)；與COPD組比較，COPD+低劑量藏紅花素組與COPD+高劑量藏紅花素組肺泡上皮細胞凋亡率顯著下降(P<0.01)；且COPD+高劑量藏紅花素凋亡細胞率較COPD+低劑量藏紅花素組下降更為明顯(P<0.01)(見圖2，表4)。

圖2 TUNEL染色檢測各組大鼠肺組織肺泡上皮細胞凋亡情況(×400)

表4 各組大鼠肺組織肺泡上皮細胞凋亡情況

五、藏紅花素激活PGC-1α/SIRT3信號通路

qRT-PCR和Western blot分別檢測大鼠肺組織中PGC-1α、SIRT3 mRNA與蛋白的表達水平，結果顯示，與空白對照組比較，COPD組、COPD+低劑量藏紅花素組、COPD+高劑量藏紅花素組肺組織中PGC-1α、SIRT3 mRNA與蛋白表達量均顯著下調(P<0.01)；與COPD組比較，COPD+低劑量藏紅花素組中PGC-1α mRNA和蛋白表達量均顯著上調(P<0.01)，而SIRT3在mRNA水平中表達上調(P<0.01)，其蛋白水平無統(tǒng)計學差異，COPD+高劑量藏紅花素組肺組織中PGC-1α、SIRT3 mRNA與蛋白表達量均顯著上調(P<0.01)；且COPD+高劑量藏紅花素肺組織中PGC-1α、SIRT3 mRNA與蛋白表達量較COPD+低劑量藏紅花素組顯著上調(P<0.01)，(見表5、6，圖3)。

圖3 Western blot檢測各組大鼠肺組織中PGC-1α、SIRT3蛋白表達

表5 各組大鼠肺組織中PGC-1α、SIRT3 mRNA表達水平比較

討 論

COPD通常是由于接觸有害氣體或顆粒引起的，伴有咳嗽、咯痰、氣喘、胸悶以及呼吸困難等癥狀，COPD現(xiàn)已成為呼吸道疾病較高死亡率和發(fā)病率的主要病因[3,5]。長期向COPD患者使用固定藥物治療劑(例如抗生素)可能會喪失此類藥物的功效，并產(chǎn)生不良的副作用[12]，因此，在現(xiàn)有的各種治療策略中，仍需不斷探索新的藥物來治療COPD。

表6 各組大鼠肺組織中PGC-1α、SIRT3 蛋白表達水平比較

COPD的發(fā)病機理復雜，主要包括氧化應激，蛋白酶和抗蛋白酶失衡，組織纖維化以及炎癥、上皮等結構性細胞在COPD發(fā)病過程中共同釋放炎性介質等，而異常炎癥反應與COPD病情進展密切相關[13]。越來越多的研究表明，炎癥因子在COPD的氣道炎癥反應中起著重要作用[14]。本實驗采用煙熏聯(lián)合氣道內注射脂多糖的方法建立COPD大鼠模型，經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)大鼠肺組織出現(xiàn)肺泡結構破壞、大量炎性細胞浸潤等明顯病理改變，說明COPD大鼠模型構建成功。進一步研究結果顯示，COPD大鼠血清和BALF中IL-1β、IL-6、TNF-α含量明顯增加。而在不同劑量藏紅花素干預的大鼠中，肺組織中肺泡破裂、炎性細胞浸潤等情況較COPD大鼠有所改善，并抑制了血清和BALF中IL-1β、IL-6、TNF-α含量的增加，且高劑量藏紅花素的作用效果更優(yōu)。這一結果提示藏紅花素可以降低COPD的炎癥反應，并改善肺組織的病理損害。

正常的肺泡上皮細胞參與宿主防御，并具有修復損傷肺泡細胞的功能，在許多肺部疾病的肺泡重塑中起著至關重要的作用，肺泡上皮細胞的大量凋亡會導致肺泡-上皮屏障的破壞，并導致富含肺泡蛋白的肺水腫形成[15-16]。因此，改善或抑制肺泡上皮細胞凋亡也是治療COPD的有效措施。在本研究中，COPD組大鼠肺組織中細胞核內含有大量棕褐色顆粒，表明肺泡上皮細胞凋亡數(shù)目較多，而使用不同劑量藏紅花素干預后可明顯降低肺泡上皮細胞的凋亡，同樣，高劑量藏紅花素抑制作用更為明顯。這表明藏紅花素可抑制肺泡上皮細胞凋亡，延緩COPD的進展。

常見的細胞凋亡途徑分內源性途徑與外源性途徑，內源性途徑又稱線粒體途徑[17]。過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔助激活物1-α(PGC-1α)是一小類轉錄調節(jié)因子的成員，可調控與線粒體代謝、氧化應激等相關基因的表達[18]。去乙?；?(SIRT3)作為PGC-1α的下游靶基因，主要位于線粒體基質中，并通過可逆酶脫乙酰作用調節(jié)線粒體脂肪酸的氧化，研究表明，PGC-1α可通過上調SIRT3表達，來增加去乙?；富钚?，從而參與線粒體氧化代謝、細胞凋亡和信號調節(jié)等過程[19-20]。在本研究中，高劑量的藏紅花素明顯抑制了COPD大鼠肺組織中PGC-1α、SIRT3 mRNA與蛋白表達水平的下調，由此推測藏紅花素可能通過PGC-1α/SIRT3通路參與COPD保護機制，這為藏紅花素的臨床應用提供了實驗依據(jù)。但是，藏紅花素在體內發(fā)揮功能的信號通路比較復雜，仍需進一步明確其相關信號轉導機制并選擇關鍵靶點。本課題后續(xù)將繼續(xù)探討藏紅花素是否通過其它途徑參與到COPD的病理改變中，此外，藏紅花素與其他藥物的聯(lián)合應用對于COPD的作用尚缺乏研究，有待后續(xù)進行深入的探索，以期為精準治療COPD提供指導。

綜上所述，藏紅花素對COPD大鼠具有一定的保護作用，可抑制炎癥反應及降低肺泡上皮細胞的凋亡率，其機制可能與激活PGC-1α進而上調SIRT3表達有關。