依沙佐米通過mTOR/p70S6K信號(hào)通路誘導(dǎo)食管鱗癌細(xì)胞凋亡

楊亮 石科 李敏霞 郭丹

河南醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校微生物與免疫學(xué)教研室（鄭州451191）

食管鱗癌是我國(guó)高發(fā)的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和病死率都很高［1］，預(yù)后差且易復(fù)發(fā)，75%的患者確診后1年內(nèi)死亡，5年生存率僅為5%～10%［2］。

最近研究表明蛋白酶體抑制劑是臨床上有效的抗癌治療方法，蛋白酶體抑制劑通過抑制26S蛋白酶體的活性，阻斷參與細(xì)胞凋亡調(diào)控及信號(hào)傳導(dǎo)的蛋白質(zhì)的降解，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，在靶向癌癥治療中變得越來越重要［3-5］。依沙佐米（Ixazomib）是一種可口服的蛋白酶體的可逆性抑制劑，通過結(jié)合并抑制20S 蛋白酶體的β5 亞基而發(fā)揮作用，目前用于治療多發(fā)性骨髓瘤［6-8］，研究表明依沙佐米也可以抑制多種實(shí)體瘤的生長(zhǎng)［9-12］，然而依沙佐米對(duì)食管鱗癌細(xì)胞的影響未見報(bào)道。

食管鱗癌細(xì)胞中存在異常激活的mTOR 信號(hào)通路，并且分化程度越低mTOR 信號(hào)通路的激活水平越高［13-14］。此外，在食管癌組織標(biāo)本中mTOR信號(hào)通路也處于激活狀態(tài)，mTOR 和p-mTOR 以及下游分子的表達(dá)升高，而磷酸酶和tensin 蛋白的表達(dá)降低［15］。依沙佐米對(duì)食管鱗癌細(xì)胞的作用是否與mTOR/p70S6K 信號(hào)通路有關(guān)仍不清楚，因此本研究將探討蛋白酶體抑制劑依沙佐米是否通過調(diào)控mTOR/p70S6K 信號(hào)通路參與食管鱗癌細(xì)胞的凋亡。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞人食管鱗癌細(xì)胞系KYSE-140和KYSE-150 用含10%胎牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)基，置37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

1.1.2 試劑依沙佐米（Selleck，美國(guó)），CCK-8細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒（Beyotime，中國(guó)），Cell-Light EdU細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒（RoboBio，中國(guó)），Annexin VAPC/7-AAD 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（KeyGEN Biotech，中國(guó)），細(xì)胞總蛋白提取試劑盒（Solarbio，中國(guó)），增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑盒（Thermo，美國(guó)），Caspase-3 熒光測(cè)定試劑盒（BioVision，美國(guó)），SYBR?Green RT-qPCR（Sigma，美國(guó)），mTOR 抗體、p70S6K抗體、p-mTOR 抗體、p-p70S6K 抗體、4E-BP1 抗體和GAPDH 抗體（Sant Cruze，美國(guó)）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞活力的檢測(cè)分別采用CCK-8 法和Edu 法檢測(cè)蛋白酶體抑制劑依沙佐米對(duì)食管鱗癌細(xì)胞KYSE-140 和KYSE-150 增殖的影響。將細(xì)胞接種在6 孔板中過夜培養(yǎng)，用不同濃度的依沙佐米（0、10、20、30、40 nmol/L）處理細(xì)胞24 h，CCK-8試劑盒檢測(cè)細(xì)胞增殖能力。同時(shí)用Cell-Light EdU細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞增殖，即向細(xì)胞培養(yǎng)基中加入EdU（50 μmol/L）繼續(xù)培養(yǎng)2 h，用4%多聚甲醛固定細(xì)胞30 min，加入100 μL Apollo 染色液，避光室溫孵育30 min，用含0.5%Triton X-100的PBS 清洗，加入Hoechst 33342 避光孵育30 min使DNA 染色。

1.2.2 細(xì)胞凋亡檢測(cè)將細(xì)胞接種于6 孔板過夜培養(yǎng)，用不含EDTA 的胰酶消化細(xì)胞，并用含2%BSA 的PBS 清洗三遍，Annexin V-APC/7-AAD 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞凋亡，F(xiàn)ACSCalibur 流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡，Annexin V-APC 陽性細(xì)胞判定為凋亡細(xì)胞。用Cell Quest 3.0 軟件進(jìn)行參數(shù)獲取和數(shù)據(jù)分析，計(jì)算凋亡細(xì)胞的百分比。

1.2.3 Caspase-3 激酶活性檢測(cè)用caspase-3 熒光測(cè)定試劑盒檢測(cè)細(xì)胞caspas-3 活性，將細(xì)胞和DEVD-AFC 底物于37 ℃孵育1 h 對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色，DEVD 多肽斷裂后產(chǎn)生熒光，用FACSCalibur 流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.4 RT-qPCR檢測(cè)基因mRNA表達(dá)水平用Trizol法提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄后用SYBR?Green RTqPCR 試劑盒檢測(cè)mTOR、p70S6K 及4E-BP1 基因的表達(dá)，引物如表1 所示，反應(yīng)體系：SYBR Master Mix溶液15 μL，cDNA模板1 μL，上下游引物各1 μL，雙蒸水7 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃30 s，58 ℃30 s，72 ℃5 min，共30 個(gè)循環(huán)；4 ℃終止反應(yīng)。

表1 RT-qPCR 基因引物序列Tab.1 Gene primer sequences of RT-qPCR

1.2.5 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)水平用細(xì)胞總蛋白提取試劑盒提取食管鱗癌細(xì)胞總蛋白，SDSPAGE 分離樣品蛋白質(zhì)并轉(zhuǎn)移至PVDF 膜，與一抗4 ℃過夜孵育，再與HRP 標(biāo)記的二抗室溫孵育2 h，然后用增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑盒進(jìn)行顯色。Image J軟件對(duì)各條帶進(jìn)行灰度分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所有實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)三次，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。兩組之間的差異進(jìn)行t檢驗(yàn)分析，P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 依沙佐米對(duì)食管鱗癌細(xì)胞增殖能力的影響分別用不同濃度（0、10、20、30、40 nmol/L）的依沙佐米處理食管鱗癌細(xì)胞（KYSE-140 和KYSE-150）24 h，CCK-8 法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力。結(jié)果顯示低濃度的依沙佐米（10 nmol/L）即可抑制KYSE-140 和KYSE-150 細(xì)胞的增殖，與對(duì)照組（0 nmol/L）相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。細(xì)胞的增殖能力隨著依沙佐米濃度的增加而下降，說明依沙佐米對(duì)食管鱗癌細(xì)胞增殖的抑制存在劑量依賴性。當(dāng)依沙佐米的濃度達(dá)40 nmol/L 時(shí)，KYSE-140 和KYSE-150 細(xì)胞活力僅有31.3%和20.3%（圖1A）。用20 nmol/L 的依沙佐米處理細(xì)胞12 h 即可顯著抑制細(xì)胞的增殖（P＜0.05），且抑制程度隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而升高（圖1B）。Edu 結(jié)果顯示依沙佐米可以抑制食管鱗癌細(xì)胞的增殖，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖2），與CCK-8 結(jié)果一致。

圖1 CCK-8 檢測(cè)細(xì)胞增殖結(jié)果Fig.1 Results of cell proliferation by CCK-8

圖2 Edu 檢測(cè)細(xì)胞增殖結(jié)果Fig.2 Cell proliferation results by Edu assay

2.2 依沙佐米對(duì)食管鱗癌細(xì)胞凋亡的影響用流式細(xì)胞儀檢測(cè)依沙佐米（20 nmol/L）對(duì)食管鱗癌細(xì)胞凋亡的影響結(jié)果見圖3A 和3B，依沙佐米處理KYSE-140 和KYSE-150 細(xì)胞24 h 后，細(xì)胞凋亡率分別為30.67%和34.33%，與對(duì)照組相比細(xì)胞凋亡率顯著升高（P＜0.05，圖3C）。此外，依沙佐米可以增強(qiáng)食管鱗癌細(xì)胞的caspase-3 活性（P＜0.05，圖3D）。Western blot結(jié)果顯示與對(duì)照組相比，依沙佐米處理組的cleaved caspase-3 的表達(dá)顯著增高（P＜0.05），其中KYSE-140 細(xì)胞增加了2.16 倍，KYSE-150 細(xì)胞增加了3.07 倍（圖3E、F），并且處理組出現(xiàn)了PARP的裂解產(chǎn)物cleaved PARP，而對(duì)照組未見PARP 的裂解（圖3E）。磷酸化的p38 被鑒定為凋亡激活標(biāo)志物［7］，依沙佐米處理后p-p38 的表達(dá)顯著升高（P＜0.05），其中在KYSE-140細(xì)胞中升高了1.74倍，在KYSE-150 細(xì)胞中升高了2.17 倍（圖3G），說明依沙佐米可以誘導(dǎo)食管鱗癌細(xì)胞的凋亡。

2.3 依沙佐米對(duì)mTOR/p70S6K信號(hào)通路的影響與對(duì)照組相比依沙佐米處理后KYSE-140 和KYSE-150 細(xì)胞mTOR 基因的mRNA 表達(dá)水平均顯著下降（P＜0.05），且mTOR 兩個(gè)下游靶基因p70S6K 和4E-BP1 的mRNA 表達(dá)也受到了抑制（P＜0.05）。見表2。Western blot 結(jié)果顯示，依沙佐米處理后KYSE-140和KYSE-150細(xì)胞中mTOR蛋白的表達(dá)顯著下降，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖4A、B），p70S6K 和4E-BP1 蛋白的表達(dá)沒有明顯變化（P＞0.05），而p-p70S6KThr421/Ser424 和p-4EBP1Thr36蛋白的表達(dá)顯著下降（P＜0.05，圖4C-F），說明依沙佐米可以抑制食管鱗癌細(xì)胞的mTOR/p70S6K 信號(hào)通路。

3 討論

圖3 依沙佐米對(duì)食管鱗癌細(xì)胞凋亡的影響Fig.3 Effect of Ixazomib on the apoptosis of esophageal squamous cell carcinoma cells

圖4 mTOR 信號(hào)通路相關(guān)蛋白的Western blot 結(jié)果Fig.4 Western blot results of mTOR signaling pathway protein

表2 mTOR、p70S6K 和4E-BP1 的RT-qPCR 結(jié)果Tab.2 RT-qPCR results of mTOR，p70S6K and 4E-BP1 genes ±s

表2 mTOR、p70S6K 和4E-BP1 的RT-qPCR 結(jié)果Tab.2 RT-qPCR results of mTOR，p70S6K and 4E-BP1 genes ±s

注：與對(duì)照組相比*P ＜0.05

基因mTOR p70S6K 4E-BP1 KYSE-140對(duì)照組1.67±0.29 1.37±0.14 0.79±0.09+Ixazomib 0.79±0.13*0.68±0.10*0.40±0.07*KYSE-150對(duì)照組2.88±0.21 1.54±0.13 0.66±0.08+Ixazomib 0.56±0.17*0.45±0.06*0.29±0.05*

依沙佐米是第二代蛋白酶體抑制劑，相對(duì)于硼替佐米（PS-341）改善了藥代動(dòng)力學(xué)和藥效學(xué)特征。多項(xiàng)研究表明依沙佐米不僅可用于血液系統(tǒng)惡性腫瘤的治療［16-17］，而且對(duì)多種類型的實(shí)體瘤的生長(zhǎng)具有抑制作用［18-21］。有報(bào)道顯示依沙佐米對(duì)人結(jié)腸腺癌Caco2 細(xì)胞具有抗增殖作用，可以下調(diào)NF-κB 和c-myc 的mRNA 表達(dá)，通過使線粒體的去極化和激活caspase-3 的活性誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［22］。體外結(jié)果表明依沙佐米對(duì)乳腺癌細(xì)胞具有抗腫瘤作用，可以誘導(dǎo)細(xì)胞的自噬和MKP-1 表達(dá)，促進(jìn)JNK 和p38 的磷酸化，抑制IκBα的降解，增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)阿霉素的敏感性［23］。體內(nèi)研究也顯示依沙佐米可以抑制腫瘤的生長(zhǎng)，研究顯示在成神經(jīng)細(xì)胞瘤的小鼠移植瘤模型中，依沙佐米具有抗腫瘤的功效［24］。

本研究結(jié)果表明依沙佐米可以抑制食管鱗癌細(xì)胞KYSE-140 和KYSE-150 的增殖，并且存在劑量依賴性，低劑量的依沙佐米（10 nmol/L）即可對(duì)食管鱗癌細(xì)胞的生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制作用。依沙佐米通過增強(qiáng)caspase-3 活性，誘導(dǎo)PARP 發(fā)生裂解生成cleaved PARP，并促進(jìn)凋亡激活標(biāo)志物p-p38的表達(dá)來誘導(dǎo)食管鱗癌細(xì)胞的凋亡，說明依沙佐米可以抑制食管鱗癌細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡。

研究表明食管鱗癌細(xì)胞中mTOR/p70S6K 信號(hào)通路處于異常激活狀態(tài)，mTOR 的高表達(dá)促使兩個(gè)下游靶蛋白p70S6K 和4E-BP1 發(fā)生磷酸化，從而激活mTOR/p70S6K 信號(hào)通路［25-27］。對(duì)食管鱗癌臨床組織標(biāo)本的研究也表明mTOR 信號(hào)通路處于激活狀態(tài)，其中磷酸肌醇-3 激酶、AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR、4E-BP1 等蛋白在腫瘤組織中顯著上調(diào)，相反地磷酸酶和tensin 蛋白同源物的表達(dá)顯著下調(diào)，特別是在pT3-T4 腫瘤中下調(diào)更為顯著［15］。此外食管鱗癌組織中mTOR 信號(hào)通路蛋白的高表達(dá)和磷酸酶和tensin 蛋白同源物的低表達(dá)，與有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和晚期TNM 分期存在相關(guān)性。mTOR靶蛋白和p70S6K1 的高表達(dá)與總體生存率相關(guān)，mTOR 信號(hào)通路的過表達(dá)被證明是食管鱗癌不良預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素［15］。本研究結(jié)果顯示mTOR基因的mRNA 和蛋白表達(dá)水平均受到抑制，兩個(gè)下游靶基因p70S6K 和4E-BP1 的mRNA 表達(dá)也受到了抑制。依沙佐米處理前和處理后p70S6K和4E-BP1蛋白的表達(dá)沒有明顯變化，但p-p70S6KThr421/Ser424 和p-4E-BP1Thr36 蛋白的表達(dá)顯著下降，說明依沙佐米可能通過下調(diào)mTOR 的表達(dá)使下游靶點(diǎn)p70S6K 和4E-BP1 的磷酸化受到抑制，從而抑制食管鱗癌細(xì)胞中的mTOR/p70S6K 信號(hào)通路。

綜上所述，依沙佐米可以抑制食管鱗癌細(xì)胞的增殖，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，可能通過抑制mTOR/p70S6K 信號(hào)通路參與細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)，為開發(fā)蛋白酶體抑制劑作為食管鱗癌治療藥物提供依據(jù)。