鹽酸法舒地爾聯(lián)合甲潑尼龍琥珀酸鈉干預百草枯中毒致大鼠肺纖維化的效果

劉豐進 孫斌 馬士鵬 孫凡婷 李瑞 張瓊震 王曦 邱建清

濱州醫(yī)學院附屬醫(yī)院（山東濱州256600）

百草枯（paraquat，PQ）中毒可致多器官損害，以肺損害更為突出，早期表現(xiàn)為急性肺損傷，晚期形成肺纖維化。臨床中給予PQ 中毒患者有效的救治及時減輕毒性反應，是治療的關(guān)鍵。轉(zhuǎn)化生長因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）具有廣泛的細胞學作用，參與肺纖維化的形成，有研究表明減少該因子含量可減輕肺纖維化的程度［1-2］。鹽酸法舒地爾（fasudil，F(xiàn)AS）是一種新型Rho/Rock 激酶抑制劑，近年來許多研究用其干預器官纖維化，已小有成效［3-5］。甲潑尼龍琥珀酸鈉（methylprednisolone sodium，MSS）具有多種治療用途，對于PQ中毒患者或動物的救治有一定效果［6-7］。

1 資料與方法

1.1 實驗動物選取75 只健康Wistar 雄性大鼠（SPF 級），周齡7～8 周，體質(zhì)量（200 ± 10）g，來源動物公司：山東省濟南市朋悅實驗動物繁育有限公司，飼養(yǎng)條件：濱州醫(yī)學院附屬醫(yī)院SPF 級動物飼養(yǎng)房，實驗已通過濱州醫(yī)學院附屬醫(yī)院動物倫理委員會審批。

1.2 相關(guān)實驗試劑20%百草枯試劑（山東天?？萍加邢薰荆}酸法舒地爾注射液（天津紅日藥業(yè)股份），注射用甲潑尼龍琥珀酸鈉（Pfizer Manufacturing Belgium NV），蘇木精-伊紅染色液（北京索萊寶公司），MASSON 染色試劑盒（北京索萊寶公司），兔抗大鼠TGF-β1 抗體（北京中衫金橋公司），TGF-β1 酶聯(lián)免疫分析ELISA 試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 分組與造模將75 只Wistar 雄性大鼠按照隨機數(shù)表法分為5 組，每組15 只，即正常對照組（Cont 組）、百草枯中毒組（PQ 組）、甲潑尼龍琥珀酸鈉干預組（MSS 組）、鹽酸法舒地爾干預組（FAS組）、甲潑尼龍琥珀酸鈉+鹽酸法舒地爾干預組（MSS+FAS組）。預適養(yǎng)1周，造模前禁食禁水12 h。Cont 組采用一次性腹腔注射生理鹽水1 mL 造模，其余4 組按PQ 20 mg/kg 用生理鹽水將其稀釋到1 mL一次性腹腔注射造模。在造模后1 h，給予Cont組、PQ 組腹腔注射1 mL 生理鹽水，MSS 組、FAS 組、MSS+FAS 組分別給予腹腔注射0.5 mg/1 mL MSS、0.5 mg/1 mL FAS、MSS+FAS 各0.5 mg/1 mL，每日選取統(tǒng)一時間注射各組干預試劑，共計21 d。觀察并記錄各組大鼠的日常行為，在造模后于第7、14、21 天三個時間點每次處死5 只，給予水合氯醛麻醉后開胸取肺，將左肺組織固定于4%多聚甲醛用于制備石蠟切片，用于第21 天蘇木精-伊紅染色（HE 染色）、MASSON 染色、免疫組化，余下肺組織儲存于-80 ℃冰柜中，用于制備3 個時間點肺組織勻漿完善酶聯(lián)免疫分析（ELISA）。

1.3.2 HE、MASSON 染色取出已固定于4%多聚甲醛24 h的肺組織，流水沖洗，酒精梯度脫水，透明，浸蠟，包埋，修塊和切片，展片、撈片、烘片，之后脫蠟進行HE、MASSON 染色。在400×光鏡下觀察各組肺組織病理學改變及肺組織纖維化程度。

1.3.3 免疫組化法測定TGF-β1已脫蠟好的石蠟切片采用高壓鍋熱修復法進行抗原修復，抑制過氧化物酶活性，封閉，滴加一抗后過夜，按照（1∶200）滴加TGF-β1 抗體，DAB 顯色，復染，脫水，透明，封片。在400×光鏡下觀察TGF-β1 的表達情況，采用Image Pro Plus 6.0計算TGF-β1的平均光密度值（OD值），進行半定量分析。

1.3.4 ELISA 測定TGF-β1 含量取出各時間點儲存于-80 ℃的肺組織，制備勻漿，采用雙抗體夾心法測定TGF-β1 的ELISA 試劑盒，嚴格按照試劑盒步驟操作，最后測定各反應孔吸光度值，根據(jù)吸光度值折算出肺組織勻漿中TGF-β1 實際含量。

1.4 統(tǒng)計學方法所得TGF-β1 的免疫組化OD值和ELISA 測定TGF-β1 含量的數(shù)據(jù)應用SPSS 24.0軟件進行統(tǒng)計分析，用均值±標準差表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用LSD-t檢驗。若方差不齊用秩和檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。同時應用GraphPad Prism 5.0 繪制統(tǒng)計圖。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠日常表現(xiàn)PQ 造模前，所有大鼠在預養(yǎng)適應期內(nèi)均正常飲食飲水、行動活躍、精神狀態(tài)飽滿。用PQ 染毒造模后，大鼠中毒最典型的表現(xiàn)是早期鼻翼煽動加快及呼吸急促，精神狀態(tài)不佳，人為刺激后躲避性差，行動極為遲緩，活動平衡性差，毛發(fā)黯淡無光且蓬松，PQ 組大鼠中毒表現(xiàn)最為嚴重，甚至PQ 組中有些大鼠出現(xiàn)了肉眼血尿。PQ 組大鼠進食量在中毒后明顯減少，隨著時間進展PQ 組大鼠體重較前明顯下降。而FAS 組、MSS 組、FAS+MSS 組相對于PQ 組來說中毒癥狀較輕，精神狀態(tài)尚可，對于刺激反應相對敏感。

2.2 解剖后大鼠肺臟外觀解剖后可見各時間點Cont 組大鼠肺臟顏色紅潤，表面光滑，觸碰后質(zhì)地柔軟、彈性極佳。PQ 組第7 天大鼠肺臟較Cont 組略有增大，稱重后重量比Cont 組肺臟重，提示有肺水腫的可能，彈性尚可。第14 天可見肺臟表面有紅白交替的團塊，彈性與Cont 組比較明顯變差。第21 天肺臟顏色暗淡，表面粗糙且凹凸不平，彈性差。FAS 組、MSS 組、FAS+MSS 組各時間點肺臟較Cont 組均有不同程度的改變，但不如PQ 組明顯。

2.3 HE 染色、MASSON 染色、TGF-β1 免疫組化結(jié)果見圖1-3，Cont 組肺組織結(jié)構(gòu)清楚，未見炎性細胞、成纖維細胞的聚集，TGF-β1 無明顯陽性表達。PQ 組肺組織結(jié)構(gòu)紊亂，有大量炎性細胞的浸潤和成纖維細胞增生，形成彌漫性纖維化，同時TGF-β1 有明顯的強陽性表達。FAS 組、MSS 組、FAS+MSS 組與Cont 組相比，仍有彌漫性纖維化，但與PQ 組相比，病變區(qū)域多呈局灶性分布，炎性細胞及成纖維細胞的數(shù)量少于PQ 組，肺纖維化程度不如PQ 組，TGF-β1 的陽性表達弱于PQ 組。

2.4 TGF-β1 免疫組化OD值、ELISA 測定TGFβ1 含量與PQ 組比較，F(xiàn)AS 組、MSS 組、FAS+MSS組OD值明顯降低（P＜0.05）。FAS+MSS 組分別與FAS 組、MSS 組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），而FAS 組與MSS 組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表1。

圖1 第21 天各組大鼠肺組織HE 染色Fig.1 HE staining of the lung tissues of rats in each group on day 21

表2 各時間點每組大鼠肺勻漿中TGF-β1 的含量Tab.2 The contents of TGF-β1 in lung homogenate in each group at each time point ±s，pg/g

表2 各時間點每組大鼠肺勻漿中TGF-β1 的含量Tab.2 The contents of TGF-β1 in lung homogenate in each group at each time point ±s，pg/g

注：與Cont 組比較aP ＜0.05；與PQ 組比較bP ＜0.05；與FAS+MSS 組比較cP ＜0.05

分組Cont組PQ組FAS組MSS組FAS+MSS組例數(shù)15 15 15 15 15第7天159.898±11.835 291.425±9.595a 254.176±8.724abc 246.269±7.627abc 216.187±7.657ab第14天162.691±8.959 388.598±11.519a 341.471±12.204abc 337.793±13.446abc 303.169±10.887ab第21天163.329±10.544 571.377±17.427a 494.359±20.809abc 486.849±20.525abc 446.644±20.751ab

圖2 第21 天各組大鼠肺組織MASSON 染色Fig.2 MASSON staining of the lung tissues of rats in each group on day 21

圖3 第21 天各組大鼠肺組織TGF-β1 免疫組化Fig.3 TGF-β1 immunohistochemicaling of the lung tissues of rats in each group on day 21

表1 第21 天各組大鼠肺組織TGF-β1 的表達Tab.1 Expression of TGF-β1 in lung tissues of rats in each group on day 21 ±s

表1 第21 天各組大鼠肺組織TGF-β1 的表達Tab.1 Expression of TGF-β1 in lung tissues of rats in each group on day 21 ±s

注：與Cont 組比較aP ＜0.05；與PQ 組比較bP ＜0.05；與FAS+MSS 組比較cP ＜0.05

分組情況Cont 組PQ 組FAS 組MSS 組FAS+MSS 組例數(shù)5 5 5 5 5 TGF-β1 0.116±0.071 0.234±0.019a 0.188±0.089abc 0.190±0.078abc 0.152±0.073ab

除Cont 組外，各時間點PQ 組TGF-β1 含量最多，F(xiàn)AS+MSS 組含量最少。藥物干預組在各時間點TGF-β1 含量與PQ 組相比差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），以FAS+MSS組最為顯著。FAS組與MSS組相比差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），F(xiàn)AS+MSS 組效果優(yōu)于FAS 組、MSS 組（P＜0.05）。見表2、圖4。

3 討論

PQ 中毒患者的生存及預后取決于PQ 中毒時間及服毒量，盡早給予洗胃、導瀉、透析、血液灌注等治療是減少PQ 吸收的有效途徑，PQ 隨著血液循環(huán)蓄積在體內(nèi)各個臟器，造成多器官損傷，以肺損害最為突出，而肺纖維化是PQ 中毒死亡的主要原因［8］。PQ 所致肺纖維化與多種因素有關(guān)，如氧化應激、線粒體損傷、細胞因子的激活等［9-10］。TGF-β1 表達上調(diào)是PQ 致肺纖維化過程中的重要因素，正常情況下僅有少量表達，受到PQ 刺激后，TGF-β1 加速在肺組織表達使細胞外基質(zhì)過度蓄積［11-12］，不僅自身加速肺纖維化的進程，又與多種促纖維化因子相互聯(lián)系，如：α-SMA、CTGF 等均起到協(xié)同作用，共同促進纖維化［13-14］。

圖4 各時間點每組大鼠肺勻漿中TGF-β1 的含量Fig.4 The contents of TGF- β1 in lung homogenate in each group at each time point

Rho/Rock 通路能夠參與多種生物學效應［15］，在某些刺激因素作用下，通過激酶連鎖反應，使炎性細胞激活促進氧化應激，也使致肺纖維化因子異常增多，進而產(chǎn)生過多的細胞外基質(zhì)造成肺纖維化［16］。作為Rho/Rock 通路激酶抑制劑的鹽酸法舒地爾，在治療缺血性腦疾病方面已卓有成效。隨著Rho/Rock 通路研究的開展，在方建江等［17］研究中可知，PQ 組大鼠隨著中毒時間的進展，CTGF、ROCK1 mRNA 及蛋白的表達逐漸增多，證實Rho/Rock 通路參與肺纖維化的形成，鹽酸法舒地爾通過抑制CTGF、ROCK1 mRNA 及蛋白的表達減輕PQ 中毒所致的大鼠肺纖維化程度。何旭娟等［18］研究，PQ 組大鼠較法舒地爾干預組有典型的病理學改變，法舒地爾干預組通過下調(diào)α-SMA mRNA及蛋白的表達來減弱肺纖維化的程度，證實Rho/Rock 通路可以通過調(diào)控α-SMA 來參與PQ 所致肺纖維化的進程。也有研究［19-20］發(fā)現(xiàn)，鹽酸法舒地爾可以通過調(diào)控致肺纖維化因子的表達、減輕炎性細胞的浸潤和氧化應激反應、抑制成纖維細胞的分化，降低肺組織中羥脯氨酸的含量，表明鹽酸法舒地爾可以有效的抑制肺纖維化。

甲潑尼龍琥珀酸鈉作為經(jīng)典的糖皮質(zhì)激素，具有廣泛的非特異性，能迅速地在抗炎、抑制免疫功能等方面發(fā)揮重要作用。它能夠穩(wěn)定溶酶體、線粒體膜，防止細胞因中毒而溶解，又抑制如白介素、腫瘤壞死因子等炎性因子的激活，干預氧化應激反應，從而減輕中毒導致的肺損傷［21］。可是，長期應用激素干預PQ 中毒患者，很容易誘發(fā)二次感染、骨壞死等并發(fā)癥，對于激素劑量的選擇和干預時間，目前仍有爭議。FENG 等［22］通過構(gòu)建PQ 中毒大鼠模型，給予甲強龍沖擊干預后延續(xù)治療，可以明顯改善大鼠存活率及肺纖維化程度，取得較好收益。結(jié)合PQ 中毒患者的臨床表現(xiàn)、檢查指標等，確定激素的干預時間，采取合理的劑量和療程，盡可能減少并發(fā)癥，甲潑尼龍琥珀酸鈉可以大大提高PQ 中毒患者的生存率并改善PQ 中毒所致的肺纖維化［7，23］。

本研究通過構(gòu)建PQ 中毒致大鼠肺纖維化模型，通過觀察各組大鼠中毒后表現(xiàn)，采用HE 染色、MASSON 染色、免疫組化等方式發(fā)現(xiàn)除Cont 組外各組大鼠均有不同程度的中毒表現(xiàn)和肺纖維化的形成，ELISA 測定各組各時間點TGF-β1 的含量表明，鹽酸法舒地爾和甲潑尼龍琥珀均可減輕肺纖維化的程度，二者聯(lián)合效果更佳。綜上所述，很多動物研究表明Rho/Rock 通路與肺纖維化的形成有密切聯(lián)系，鹽酸法舒地爾可以有效抑制肺纖維化的程度，在此基礎(chǔ)上聯(lián)合應用甲潑尼龍琥珀酸鈉可取得更好的治療效果。目前，PQ 所致肺纖維化仍是不可逆轉(zhuǎn)，甚至在采用體外膜肺（ECMO）技術(shù)下［24］，患者治療花費較大且結(jié)局也不樂觀，同樣地各種因素導致的肺纖維化疾病也是臨床救治的重點和難點，鹽酸法舒地爾作為臨床上目前唯一的Rho/Rock 通路抑制劑，在原有治療的基礎(chǔ)上，可能為肺纖維化的治療提供一個新的思路，也為其自身研究提供了新的方向。由于條件所限，本實驗未完善Rho/Rock 通路參與PQ 所致的肺纖維化的相關(guān)機制的研究，后續(xù)可進一步擴大樣本量，深化相關(guān)機制的研究，為其能夠應用于臨床治療肺纖維化提供更為充足的理論基礎(chǔ)。