• 
    

    
    

      99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

      基于流式細(xì)胞儀對(duì)杏屬植物基因組大小的測(cè)定

      2020-11-10 02:00:04張俊環(huán)姜鳳超張美玲孫浩元王玉柱
      華北農(nóng)學(xué)報(bào) 2020年5期
      關(guān)鍵詞:金絲小棗內(nèi)標(biāo)基因組

      張俊環(huán),楊 麗,姜鳳超,張美玲,孫浩元,王玉柱

      (1.北京市林業(yè)果樹科學(xué)研究院,北京 100093;2.國(guó)家林業(yè)和草原局杏工程技術(shù)研究中心,北京 100093)

      基因組大小(或稱C-值)是指單倍體細(xì)胞中全套染色體的DNA總量,以質(zhì)量pg(Picogram)或堿基對(duì)數(shù)目Mb(Million base pair)為單位[1],而1 pg相當(dāng)于978 Mb[2]。流式細(xì)胞儀法由于方法簡(jiǎn)便、快捷、靈敏度高、檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定可靠,已成為測(cè)量植物基因組大小的主要手段[3-5]。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞DNA含量,通常采用特異的熒光染料碘化丙啶(Propidium iodide,PI)對(duì)其進(jìn)行染色,PI通過均勻地插入雙鏈DNA的堿基對(duì)中,對(duì)細(xì)胞核DNA進(jìn)行特異性染色,熒光分子結(jié)合DNA的量與細(xì)胞內(nèi)DNA含量呈正比,通過檢測(cè)被激發(fā)的染色細(xì)胞發(fā)射的熒光強(qiáng)度,并與內(nèi)參比較可換算出被測(cè)樣品的DNA含量[1]。近年來,多種植物在進(jìn)行高通量測(cè)序之前,先通過流式細(xì)胞儀進(jìn)行基因組大小的測(cè)定,以期為高通量測(cè)序文庫(kù)的構(gòu)建和基因組組裝提供數(shù)據(jù)參考[6-8]。

      杏(Prunusarmeniaca)是原產(chǎn)我國(guó)的特色果樹,我國(guó)杏栽培面積和產(chǎn)量均居世界首位。杏屬于薔薇科(Rosaceae)李屬(PrunusL.)李亞屬(Prunophora)杏組/屬(Armeniaca)植物,杏屬植物共有6~12個(gè)種[9],其中普通杏(P.armeniaca)、西伯利亞杏(P.sibirica)、遼杏(P.mandshurica)和紫杏(P.dasycarpa)這4個(gè)種是杏生產(chǎn)中常見并得到公認(rèn)的種類。另外,仁用杏(又稱大扁杏)被認(rèn)為是由普通杏(P.armeniaca)和西伯利亞杏(P.sibirica)自然種間雜交形成的類型[10-11]。杏資源種類極其豐富,不同種類在生態(tài)適應(yīng)性、形態(tài)特征等方面表現(xiàn)出多樣性,即使同一個(gè)種內(nèi),不同品種在某些性狀上的變異也較顯著。近年來,對(duì)這些杏屬植物的研究主要集中在遺傳多樣性、親緣關(guān)系以及分類地位等方面[12-14],而針對(duì)它們基因組大小的分析鮮見報(bào)道?;蚪M反映了生物物種全部和特定的遺傳信息,基因組大小是植物最基本也是最重要的生物多樣性特征參數(shù)。因此,本研究用流式細(xì)胞儀,通過單獨(dú)進(jìn)樣和混合進(jìn)樣結(jié)果分析,篩選出理想的內(nèi)參基因組,并以此為內(nèi)參,測(cè)定分屬于普通杏、遼杏、西伯利亞杏、仁用杏和紫杏5個(gè)種的12個(gè)杏品種資源的基因組大小,并以引進(jìn)的歐洲品種Canino為參照,比較不同種、變種及品種之間基因組大小的差異,以期為相關(guān)杏屬植物的物種進(jìn)化和分類研究以及基因組研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

      1 材料和方法

      1.1 試驗(yàn)材料

      供試的13份杏資源(表1)分別屬于5個(gè)種和變種,其中普通杏4份(包括1份歐洲品種)、普通杏變種5份、西伯利亞杏1份、遼杏1份、紫杏1份、仁用杏1份。13份供試材料的嫩葉均采自北京市林業(yè)果樹科學(xué)研究院的杏資源圃,試驗(yàn)作為內(nèi)標(biāo)的桃品種早艷、葡萄品種瑞都科美和棗品種金絲小棗的嫩葉均采自北京市林業(yè)果樹科學(xué)研究院的資源圃。

      表1 供試的杏資源信息Tab.1 Information of tested apricot materials

      1.2 試驗(yàn)方法

      1.2.1 細(xì)胞核懸液制備 按照試劑盒Cystain?PI Absolute (sysmex)的說明書進(jìn)行,取幼嫩、干凈的新鮮葉片,剪取小于0.5 cm2大小的新鮮嫩葉,放入培養(yǎng)皿中,加入500 μL提取緩沖液,用鋒利的刀片一次性快速切碎,材料整個(gè)過程浸沒在提取液里;完全切碎后再加入4 ℃下預(yù)冷的2 mL含有碘化丙啶(Propidium iodide, PI)12 μL和RNaseA 6 μL的染色液,之后立即用50 μmol/L濾膜過濾到5 mL收集管中,置4 ℃下避光染色1~2 h,獲得細(xì)胞核懸浮液,置于冰上備用。每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。以二倍體的桃品種早艷、葡萄品種瑞都科美和棗品種金絲小棗分別做內(nèi)標(biāo),篩選適宜的內(nèi)標(biāo)植物。

      1.2.2 流式細(xì)胞儀檢測(cè) 用德國(guó)Partec流式細(xì)胞儀(CyFlow-Space)進(jìn)行檢測(cè),每組樣品至少收集10 000個(gè)粒子,然后根據(jù)內(nèi)標(biāo)植物和待測(cè)植物的核濃度,調(diào)整比例進(jìn)行混合,使內(nèi)標(biāo)植物和代謝植物的核濃度盡量一致,再次共進(jìn)樣檢測(cè),流式細(xì)胞儀測(cè)定內(nèi)標(biāo)與待測(cè)植物的熒光峰圖,以FlowMax軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,CV值控制在5%以內(nèi)。

      1.2.3 樣品基因組大小的計(jì)算 熒光信號(hào)的強(qiáng)度代表了細(xì)胞核內(nèi)物質(zhì)的濃度,與細(xì)胞核DNA含量呈正比。樣品的基因組大小按照以下公式計(jì)算:待測(cè)樣品基因組大小=(待測(cè)樣品熒光強(qiáng)度/內(nèi)標(biāo)樣品熒光強(qiáng)度)×內(nèi)標(biāo)植物基因組大小。

      2 結(jié)果與分析

      2.1 內(nèi)標(biāo)植物基因組的確定

      以杏串枝紅、陜梅和大優(yōu)佳杏為例,分別以二倍體葡萄品種瑞都科美、二倍體桃早艷和二倍體棗金絲小棗的基因組做內(nèi)標(biāo),進(jìn)行內(nèi)標(biāo)基因組的篩選。杏、葡萄、桃和棗的基因組大小測(cè)定結(jié)果如圖1,可見,在優(yōu)化的試驗(yàn)條件和儀器參數(shù)設(shè)定下,4種植物基因組的流式直方圖中均出現(xiàn)了清晰的吸收峰,并且,杏和桃的流式直方圖中均出現(xiàn)了雙峰(圖1-A、C),且雙峰出峰位置比例保持較為穩(wěn)定,通過計(jì)算發(fā)現(xiàn),2個(gè)峰的道數(shù)值(出峰位置)呈2倍關(guān)系,由此可知,第1個(gè)峰代表的是G0/G1期的DNA含量,第2個(gè)峰代表的是G2/M期的DNA含量。流式細(xì)胞儀測(cè)定植物基因組大小,通常是通過比較G0/G1期的峰值來計(jì)算基因組大小。由圖1可知,杏、桃、葡萄和棗的G0/G1期峰的熒光強(qiáng)度值分別為119.93,103.54,190.86,176.99,根據(jù)基因組大小計(jì)算公式,在內(nèi)標(biāo)植物相同時(shí),基因組大小與熒光峰值呈正比,由此判斷4種植物的基因組大小順序?yàn)樘?杏<棗<葡萄,與已經(jīng)發(fā)表的這4種植物基因組大小順序相符(杏294 Mb、桃265 Mb、棗438 Mb、葡萄487 Mb)[1]。

      圖1 杏、葡萄、桃和棗分別單獨(dú)進(jìn)樣的流式細(xì)胞儀測(cè)試結(jié)果Fig.1 Flow cytometric fluorescent detection image of apricot, grape, peach and jujube

      為了準(zhǔn)確測(cè)定杏屬植物基因組的大小,避免流式細(xì)胞儀在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)PI核染色靈敏度的差異,一般采取測(cè)試植物樣品與內(nèi)參樣品共進(jìn)樣,在相同條件下同時(shí)測(cè)定待測(cè)植物與內(nèi)標(biāo)植物的熒光峰值,通過比值估測(cè)待測(cè)植物基因組的大小。杏與不同內(nèi)參共進(jìn)樣得到的混合峰如圖2所示。在優(yōu)化的試驗(yàn)條件下,混合樣品的吸收峰均可同時(shí)被檢測(cè)到,但是杏的細(xì)胞核和桃的細(xì)胞核卻不易分開,2C值吸收峰幾乎重疊(圖2-B),因?yàn)槎叩幕蚪M大小比較接近。葡萄瑞都科美的2C熒光峰(G0/G1)位于杏的G0/G1期峰與G2/M期峰之間(圖2-A),并且與杏細(xì)胞分裂的G2/M期幾乎重疊,互相干擾。由圖2-C可以看出,金絲小棗的2C值峰也位于杏的G0/G1期峰與G2/M期峰之間,但金絲小棗的基因組比葡萄小,它的G0/G1期峰的熒光強(qiáng)度值小于葡萄,故距離杏G2/M期峰相對(duì)稍遠(yuǎn),杏與金絲小棗混合樣品的檢測(cè)直方圖中無重疊峰,且區(qū)分度良好,可獲得較少雜峰的峰型圖。因此,選用基因組大小已知的金絲小棗作為內(nèi)標(biāo),可保證測(cè)定杏屬植物基因組大小的合理性和準(zhǔn)確性。通過比較單獨(dú)進(jìn)樣和共進(jìn)樣,確認(rèn)杏和棗熒光峰的相對(duì)位置,從而估算杏基因組的大小。其他杏屬植物基因組的大小測(cè)定均以棗基因組做內(nèi)參。

      圖2 杏與葡萄、杏與桃、杏與棗合樣品流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果Fig.2 The result of mixed samples of apricot with grape, peach or jujube, respectively

      2.2 不同杏屬植物基因組大小的比較

      以二倍體棗品種金絲小棗(C值0.44 pg,基因組大小為424 Mb)[2]為內(nèi)標(biāo),通過比較待測(cè)樣品和內(nèi)參G0/G1期峰,計(jì)算得出杏屬植物不同種和品種的基因組大小,發(fā)現(xiàn)杏屬植物的基因組大小在(245.07±0.842)~(300.60±1.181)Mb。杏屬植物不同種和品種間基因組大小均有一定的差異,其中所測(cè)試的5個(gè)種間的差異均達(dá)到了顯著水平。由表2可知,基因組相對(duì)較大的是普通杏變種陜梅,為(300.60±1.181)Mb,其次為串枝紅,基因組大小為(291.59±1.642)Mb,二者差異顯著且均顯著高于其他品種;然后依次是Ⅲ組(遼杏及普通杏變種賽買提和皮乃孜),Ⅳ組(西伯利亞杏的綠萼山杏及普通杏品種駱駝黃和青蜜沙),Ⅴ組(普通杏變種垂枝山杏和仁用杏品種龍王帽),Ⅳ組(普通杏變種李光杏類型大優(yōu)佳和普通杏歐洲品種類型卡尼諾),組間差異均顯著但組內(nèi)差異均不顯著;基因組相對(duì)較小的是紫杏(245.07±0.842)Mb ,顯著低于其他品種。在普通杏的3個(gè)品種中,駱駝黃與青蜜沙杏的基因組大小無顯著差異,但均顯著小于串枝紅杏。另外,同屬于李光杏類型的3個(gè)品種間也有一定的差異,賽買提和皮乃孜的基因組大小分別是(279.45±4.619)Mb和(278.36±0.859)Mb,二者無顯著差異,但均顯著大于大優(yōu)佳杏。

      表2 13個(gè)杏品種的基因組大小Tab.2 The genome size of 13 cultivars of P. armeniaca

      3 結(jié)論與討論

      基因組大小的測(cè)定一般采用內(nèi)標(biāo)法[5],使用內(nèi)標(biāo)的分析能夠降低樣品制備以及儀器自身引起的誤差,因此更適用于精確的分析[15]。有研究表明,同一個(gè)植物類型材料,選擇的內(nèi)標(biāo)植物不同、測(cè)定方法不同(包括內(nèi)標(biāo)法和外標(biāo)法、染色方法等)而得到大小不同的基因組測(cè)定值[2, 16-17]。內(nèi)標(biāo)植物的選擇對(duì)準(zhǔn)確測(cè)定待測(cè)植物的基因組很重要[18],本研究?jī)?nèi)標(biāo)基因組的選擇標(biāo)準(zhǔn),主要考慮了以下幾方面:已經(jīng)發(fā)表基因組大小的二倍體果樹植物,基因組大小與杏基因組大小相差不是太大,但要保證2種材料的熒光峰(G0/G1期峰)不能重疊。在實(shí)際檢測(cè)時(shí)發(fā)現(xiàn),可能是因?yàn)樾舆@一物種細(xì)胞分裂間期較短,杏材料同時(shí)出現(xiàn)了細(xì)胞分裂的G0/G1期(二倍體DNA)熒光峰和G2/M期(DNA加倍)熒光峰;因此,內(nèi)參植物的熒光峰需要滿足與杏基因組的2個(gè)熒光峰均不重疊的條件。本研究中待測(cè)植物的2個(gè)熒光峰與金絲小棗測(cè)定的直方圖中熒光峰均無重疊,區(qū)分度良好,試驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確可靠,故金絲小棗在本研究中是一種較為理想的內(nèi)標(biāo)植物。以金絲小棗為內(nèi)參測(cè)定普通杏基因組大小為272.65~291.59 Mb,與以雞血紅細(xì)胞為內(nèi)參測(cè)定杏基因組大小為294 Mb相接近[1],這也表明本研究?jī)?nèi)標(biāo)植物的選擇是準(zhǔn)確可信的。

      基因組大小是指真核生物單倍體基因組所含DNA的總量,可反映植物種間和品種間的差異[19-21],本研究也得到了類似的結(jié)果。測(cè)試的杏5個(gè)種間基因組大小差異較大,達(dá)到了顯著水平,普通杏基因組相對(duì)較大,尤其是串枝紅杏(291.59 Mb),紫杏基因組最小(245.07 Mb);西伯利亞杏品種綠萼山杏與普通杏品種駱駝黃和青蜜沙差異不顯著,遼杏與普通杏變種賽買提和皮乃孜差異不顯著,兩組間差異小于其與紫杏之間的差異,說明普通杏與西伯利亞杏和遼杏的親緣關(guān)系較近,而與紫杏的親緣關(guān)系較遠(yuǎn),這與馮晨靜等[22]采用ISSR分析的結(jié)果相一致。另外,目前研究支撐杏屬植物的演化趨勢(shì)為:普通杏→遼杏→山杏[9],從普通杏這一最原始的植物學(xué)種到山杏的進(jìn)化過程中,基因組大小沒有明顯的變化,與沈慧等[23]在棗屬植物上的研究結(jié)果不一致,酸棗到棗的進(jìn)化中則可能伴隨著基因組的縮減。“C值悖論”認(rèn)為基因組的大小和物種的進(jìn)化復(fù)雜度之間沒有嚴(yán)格的對(duì)應(yīng)關(guān)系[24],因此,杏基因組大小與杏屬植物種類進(jìn)化間的關(guān)系有待進(jìn)一步的研究揭示。

      同一種內(nèi)不同變種類型的基因組大小差異也較大,普通杏的變種陜梅與垂枝山杏及李光杏類型(賽買提、大優(yōu)佳和皮乃孜)的基因組大小差異均顯著,且李光杏類型中的賽買提和皮乃孜與大優(yōu)佳的基因組大小差異亦達(dá)顯著水平,其中陜梅的基因組是所測(cè)13份杏材料中基因組最大的,達(dá)到了300.60 Mb。以李光杏類型中的大優(yōu)佳品種為例,與普通杏變種陜梅進(jìn)行比較,二者植物形態(tài)也差異較大,花、果實(shí)和葉片都明顯不同。陜梅杏在杏屬中花朵最大、花瓣最多、開花期最遲,適宜觀賞,很少結(jié)果實(shí);屬于李光杏變種的大優(yōu)佳的最大特點(diǎn)是果實(shí)表面光滑無毛,果實(shí)小,含糖量高,葉片小而厚,抗旱性強(qiáng)[25]。基因組大小與其表型性狀有著復(fù)雜的關(guān)系。關(guān)于基因組大小與植物表型之間的相關(guān)性研究較少,目前比較確定的觀點(diǎn)認(rèn)為,基因組大小和細(xì)胞大小呈正相關(guān)關(guān)系[24,26]。DNA含量通過影響細(xì)胞大小和有絲分裂周期時(shí)間而影響表型,特別是在植物進(jìn)化和適應(yīng)性方面起著關(guān)鍵作用[17]。Knight等[27]研究得出相似的結(jié)果,基因組大小與細(xì)胞體積的大小、保衛(wèi)細(xì)胞的長(zhǎng)度以及表皮細(xì)胞面積等表型性狀相關(guān)性較強(qiáng),而與單位面積葉質(zhì)量、光合作用效率等表型相關(guān)性較弱。本研究基因組相對(duì)較小的大優(yōu)佳杏原產(chǎn)我國(guó)新疆地區(qū),新疆光照強(qiáng)、干旱少雨,為了適應(yīng)這種自然環(huán)境,葉片變小、變厚,可能是由于葉片細(xì)胞體積的大小、保衛(wèi)細(xì)胞的長(zhǎng)度以及表皮細(xì)胞面積變小的結(jié)果。而細(xì)胞的大小是為了適應(yīng)于基因組大小的改變而形成的被動(dòng)改變[24]?;蚪M相對(duì)較大的陜梅杏花朵較大,其細(xì)胞大小是否大于同屬的其他種類和品種,仍有待進(jìn)一步的研究。本研究對(duì)杏5個(gè)種或類型的13個(gè)變種或品種基因組大小的測(cè)定研究,可為杏屬植物基因組、轉(zhuǎn)錄組和資源的鑒定及分類等方面的深入研究提供參考。

      猜你喜歡
      金絲小棗內(nèi)標(biāo)基因組
      金絲小棗富路寬
      氣相色譜內(nèi)標(biāo)法測(cè)洗滌劑中的甲醇
      牛參考基因組中發(fā)現(xiàn)被忽視基因
      有機(jī)熱載體熱穩(wěn)定性測(cè)定內(nèi)標(biāo)法的研究
      金絲小棗枝腐病的發(fā)生規(guī)律及防治方法
      河北果樹(2020年4期)2020-11-26 06:05:40
      滄州金絲小棗冬春時(shí)節(jié)的管理
      河北果樹(2020年1期)2020-02-09 12:31:30
      GC內(nèi)標(biāo)法同時(shí)測(cè)定青刺果油中4種脂肪酸
      中成藥(2018年6期)2018-07-11 03:01:32
      樂陵金絲小棗
      核磁共振磷譜內(nèi)標(biāo)法測(cè)定磷脂酰膽堿的含量
      基因組DNA甲基化及組蛋白甲基化
      遺傳(2014年3期)2014-02-28 20:58:49
      通城县| 台江县| 康平县| 乐平市| 揭东县| 兴安县| 曲靖市| 石柱| 吉隆县| 阜新| 明星| 伊吾县| 绥中县| 北安市| 肥西县| 分宜县| 洞口县| 重庆市| 嘉善县| 榆中县| 大新县| 当阳市| 武陟县| 大冶市| 盘山县| 福清市| 堆龙德庆县| 辽阳市| 新和县| 霍林郭勒市| 莎车县| 长治市| 自治县| 西充县| 都昌县| 元谋县| 浦东新区| 海原县| 赤峰市| 宁远县| 汽车|