驚擾應激狀態(tài)下大黃魚血清生化指標及肝臟抗氧化活力的變化

孫 鵬，唐保軍，姜亞洲

（中國水產(chǎn)科學研究院東海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部東海與遠洋漁業(yè)資源開發(fā)利用重點實驗室，上海 200090）

在水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中，魚類常受到諸多環(huán)境因素的影響。養(yǎng)殖生產(chǎn)實踐中所涉及的捕捉、排污、運輸?shù)炔僮鞫际遣豢杀苊獾模@些操作環(huán)節(jié)也會對魚類造成一定的脅迫作用，致使養(yǎng)殖魚類應激反應的發(fā)生［1］。應激（stress）是生物體遭受環(huán)境刺激時出現(xiàn)的非特異性生理反應，是機體的一種防御機制。適當?shù)膽ぴ创碳び兄跈C體快速適應環(huán)境變化，但若超出機體自身的適應范圍，則會造成機體內(nèi)環(huán)境紊亂，誘發(fā)疾病或致使疾病發(fā)展、惡化［2］。養(yǎng)殖生產(chǎn)中許多難以根治的頑固性疾病往往是魚類長期處于應激狀態(tài)的結果，必須引起高度重視。近年來，養(yǎng)殖應激相關研究逐漸開展起來［3-6］。

大黃魚（Larimichthys crocea）屬于鱸形目（Perciformes），石首魚科（Sciaenidae），黃魚屬，是我國近海重要的經(jīng)濟魚類，也是浙江、福建、廣東等東南沿海省份重要的海水網(wǎng)箱養(yǎng)殖魚類。由于其對多種外界環(huán)境因素敏感，養(yǎng)殖和管理過程中引起的應激反應影響已經(jīng)成為一個亟待解決的突出性問題，這也給養(yǎng)殖管理造成了一定的困難［1，7］。近年來，大黃魚環(huán)境脅迫相關研究已有報道，其主要涉及水體、溫度和養(yǎng)殖密度等［7-9］，而對于捕捉、排污、驚擾等生產(chǎn)過程中出現(xiàn)的容易被忽視的常見因素引起的脅迫應激研究相對較少［1］，關于其應激過程中魚體的生理變化規(guī)律也知之甚少。為此，本研究通過分析人工驚擾狀態(tài)下大黃魚體內(nèi)重要生理生化指標及抗氧化酶活力變化，探討了應激狀態(tài)下魚體對應激反應的適應性響應，研究結果可為大黃魚健康養(yǎng)殖生產(chǎn)提供信息支持，也可為魚類脅迫應答機制研究提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

試驗魚為福建省寧德市富發(fā)水產(chǎn)有限公司人工繁育的大黃魚成體，平均體質(zhì)量為（88.91±9.27）g，挑選體色正常、無傷無病、行動迅速、生命力強的個體用于脅迫實驗。實驗前于室內(nèi)水泥池（6.0 m×4.0 m×1.5 m）中養(yǎng)殖，實驗用海水經(jīng)過砂濾處理［鹽度25.7±0.5，水溫（25.6±0.5）℃］；采用連續(xù)充氣，每日換水1次，換水量2/3，每日投喂顆粒飼料2次（8∶00和14∶00）。

1.2 脅迫實驗和取樣

實驗時，將暫養(yǎng)的大黃魚放入10組1 t的PVE桶中，每桶加入海水700 L，并放入試驗魚30尾。隨機選擇其中1組作為對照組，其余的9組作為無差別的處理組，每組內(nèi)設置2個重復。并在隨后的取樣過程中，每次從未取過樣的一組中采集樣品，以避免因取樣造成的密度等因素對實驗測定的干擾。驚擾處理一共持續(xù)10 d，處理方法參照翁朝紅等［1］，并做了部分改進。每日定時采用1 m長的PVE管（直徑2 cm）快速繞桶壁驅(qū)趕試驗魚10 min，再將桶中的大黃魚用抄網(wǎng)捕捉并暴露于空氣中10 s。為盡量保證脅迫強度的定量，追趕速度設定為每3 s繞PVE桶旋轉(zhuǎn)驅(qū)趕2圈。

分別在處理后第0、3、6、24、48、72、96、120、240小時對試驗魚進行取樣。取樣過程中，每次從1組PVE桶隨機選取6尾大黃魚并用MS-222進行麻醉，經(jīng)靜脈取血后解剖取肝臟組織，準確稱重后按質(zhì)量（g）∶體積（mL）=1∶9的比例加入生理鹽水，經(jīng)勻漿（冰水?。┖碗x心（2 500 r·min-1，10 min）后取得上清液待測。對樣品魚肝臟中總蛋白含量、超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化氫酶（CAT）進行測定，每個樣品重復測定3次；血液樣品置于1.5 mL離心管中，4℃靜置8 h后離心（3 000 r·min-1，10 min），收集上層血清用于生化指標測定。皮質(zhì)醇含量采用ELISA方法測定，SOD和血糖含量采用比色法，CAT、溶菌酶和乳酸含量采用分光光度法測定，所需試劑盒均購自于南京建成生物工程研究所，并參照說明書進行操作。

1.3 數(shù)據(jù)分析

所得的全部數(shù)據(jù)均表示為平均值±標準誤差（Mean±SD）的形式。利用SPSS 25.0軟件中的方差分析和Duncan氏檢驗進行多重比較，P＜0.05時被認為具有顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 應激狀態(tài)下大黃魚血清皮質(zhì)醇的變化

應激狀態(tài)下大黃魚血清中的皮質(zhì)醇含量變化如圖1所示。在驚擾處理后，大黃魚血清中皮質(zhì)醇含量快速升高，在處理3 h后其含量開始顯著高于對照組（P＜0.05），在處理6 h后達到最高峰；之后，皮質(zhì)醇含量逐漸降低，雖然期間含量也高于對照水平，但與對照組并無顯著性差異（P＞0.05）。

圖1 應激狀態(tài)下大黃魚的皮質(zhì)醇含量變化Fig.1 Changes of cortisol concentration in Larim ichthys crocea under stress

2.2 應激狀態(tài)下大黃魚血糖和乳酸含量的變化

應激狀態(tài)下大黃魚血清中的血糖含量也隨著處理時間的延長出現(xiàn)顯著變化。如圖2所示，驚擾處理3 h時大黃魚血清中血糖含量快速升高，其含量在處理后的72 h一直處于較高水平并顯著高于對照組（P＜0.05）；在處理72 h后，血糖含量開始降低并恢復至驚擾處理前水平。

應激狀態(tài)下大黃魚血清中的乳酸含量也出現(xiàn)與血糖含量相近的變化（圖3）。自處理后3 h開始，大黃魚血清中乳酸含量快速升高，并在處理后6 h處于最高水平（P＜0.05）；高乳酸狀態(tài)一直持續(xù)到驚擾處理后48 h，之后也逐漸降低并恢復至脅迫處理前水平。

圖2 應激狀態(tài)下大黃魚的血糖含量變化Fig.2 Changes of glucose concentration in Larim ichthys crocea under stress

圖3 應激狀態(tài)下大黃魚的乳酸含量變化Fig.3 Canges of lactic acid concentration in Larim ichthys crocea under stress

2.3 應激狀態(tài)下大黃魚肝臟抗氧化酶活力的變化

驚擾處理后，大黃魚在應激狀態(tài)下的肝臟超氧化物歧化酶（SOD）活性也呈現(xiàn)升高的趨勢（圖4）。在脅迫處理的第1天，肝臟中SOD酶活力隨處理時間的推移而逐漸升高，并在處理后6 h達到最高峰值，這種顯著性增高的趨勢一直持續(xù)到處理后24 h；隨后，SOD活力開始下降，最終的酶活力水平稍高于對照組，但差異并不顯著（P＞0.05）。

與肝臟中SOD酶活力變化趨勢不同，應激狀態(tài)下大黃魚過氧化氫酶（CAT）活力（圖5）在驚擾處理后第1天并未出現(xiàn)顯著性變化；在處理后第2天，酶活力開始逐漸升高，在處理后第3天開始顯著高于對照組酶活力（P＜0.05），并在處理后第5天（120 h）達到最高值；之后，CAT活力一直保持較高的水平，且在脅迫處理的第10天仍顯著高于對照組水平（P＜0.05）。

圖4 應激狀態(tài)下大黃魚的超氧化物歧化酶含量變化Fig.4 Changes of SOD activity in Larim ichthys crocea under stress

圖5 應激狀態(tài)下大黃魚的過氧化氫酶活力變化Fig.5 Changes of CAT activity in Larim ichthys crocea under stress

2.4 應激狀態(tài)下大黃魚溶菌酶的變化

驚擾脅迫處理后，大黃魚溶菌酶活力變化趨勢如圖6所示。在驚擾處理后第1天大黃魚血清中溶菌酶活力逐漸升高，在處理后第6小時達到最高值，并顯著高于對照組水平（P＜0.05）；隨后，溶菌酶活力又開始下降至對照組水平；然后，溶菌酶活力在應激反應第3天和第4天又開始升高并維持較高的水平狀態(tài)（P＜0.05）；在驚擾處理的第10天，溶菌酶活力仍高于對照組水平，但差異并不顯著（P＞0.05）。

圖6 應激狀態(tài)下大黃魚的溶菌酶含量變化Fig.6 Changes of lysozyme concentration in Larim ichthys crocea under stress

3 討論

魚類屬于水生低等變溫脊椎動物，生存容易受到外源環(huán)境因素影響。目前，日益惡化的環(huán)境對魚類造成的影響已成為一個突出性問題［2］。同樣，在養(yǎng)殖生產(chǎn)中魚類也常受到多種環(huán)境因素的影響，繼而引發(fā)魚體的應激反應［10-11］。應激反應可分為3級：初級應激反應是魚類神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)水平上的反應，主要表現(xiàn)為血清腎上腺素或去腎上腺素以及皮質(zhì)醇含量顯著升高；次級應激反應為初級反應引起的呼吸系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)等各組織與器官方面的變化；而第三級應激反應是在次級應激反應基礎上導致的如生長速率、抗病能力、繁殖能力及行為等個體以及群體方面的改變。

魚體接收到外界脅迫信號后，首先由其下丘腦產(chǎn)生促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素（CRH）傳遞給腦垂體，腦垂體前葉受到CRH刺激分泌促腎上腺皮質(zhì)激素（ACTH），并傳遞給腎間組織，再由腎間組織產(chǎn)生以皮質(zhì)醇為主的皮質(zhì)類固醇，并釋放到血液中去引發(fā)其他反應。皮質(zhì)醇是參與魚體應激反應過程的重要激素，其含量的快速升高已見于多種魚類脅迫應激相關報道［12-13］。皮質(zhì)醇通過代謝調(diào)節(jié)，可促進糖元、蛋白質(zhì)和脂肪分解以應對應激反應。但皮質(zhì)醇同時還具有免疫抑制和抗炎功能，應激和適應過程中血清皮質(zhì)醇濃度升高往往也會導致機體免疫力下降。例如，大西洋鮭（Salmo salarLinnaeus）經(jīng)過操作脅迫處理后，隨著皮質(zhì)醇含量的升高，免疫細胞中IL-1β等基因會出現(xiàn)過表達，繼而降低白細胞在外界病原入侵時候的存活力［14］。本研究中，大黃魚經(jīng)驚擾脅迫處理后，皮質(zhì)醇含量也快速升高，并在脅迫處理6 h時達到最高峰，這是大黃魚經(jīng)外界人工干擾后的初級應激反應；之后，隨著魚體對外界刺激的逐步適應，皮質(zhì)醇含量也逐漸降低并最終恢復到處理前水平，這有利于魚體對自身內(nèi)穩(wěn)態(tài)的維持，同時也體現(xiàn)了大黃魚對長期應激狀態(tài)的適應性調(diào)節(jié)。

血糖是血液中重要的能源物質(zhì)，為魚體進行各種生命活動所需能量的直接來源。大黃魚在應激狀態(tài)下血清中血糖含量顯著增加，推測魚體在受到外界刺激后能量消耗劇增，體內(nèi)代謝加快，糖原消耗加速；同時，皮質(zhì)醇含量的增加將促進肝臟糖異生作用并降低各組織對血糖的利用率，這都將導致大黃魚血液中血糖含量快速升高，為機體應對外界環(huán)境變化提供能量。相似的情況也出現(xiàn)在脅迫后的銀鯧（Pampus argenteus）［12-13］、大西洋鮭［14-15］等魚類中，以保障機體可以經(jīng)受住外界因素刺激，快速調(diào)節(jié)機體以適應外界環(huán)境并維持相對穩(wěn)定的狀態(tài)。乳酸主要在肌肉供氧不足的情況下由糖酵解產(chǎn)生［12］。在劇烈運動的狀態(tài)下，糖酵解可迅速為機體提供能量。大黃魚經(jīng)人工追趕和空氣暴露處理后，魚群受驚并表現(xiàn)為呼吸急促和快速游動，這都可導致魚體內(nèi)乳酸含量的升高。

溶菌酶是一種堿性蛋白，它可通過水解革蘭氏陽性菌細胞壁中的肽聚糖使之裂解并釋放出來，以破壞和消除侵入體內(nèi)的外源性物質(zhì)。研究表明，在急性脅迫情況下溶菌酶活性可以作為魚類應激程度的指示信號［16］。例如，在渾濁的水體中半滑舌鰨（Cynoglossus semilaevis）肝臟內(nèi)溶菌酶活性隨著懸浮物濃度升高和處理時間延長而顯著增加［17］。本研究也發(fā)現(xiàn)，大黃魚受脅迫后溶菌酶也呈現(xiàn)活力升高的趨勢，推測這與應激狀態(tài)下魚體的免疫防御行為有關。隨著魚體對外界刺激的響應，體內(nèi)需消耗大量能量以調(diào)整和適應新的環(huán)境，魚體的氧化損傷以及免疫相關基因的表達變化可能降低機體對外源病原菌的殺傷力。這時，為抵御和消除病原菌侵入所造成的傷害，作為先天性防御系統(tǒng)重要成員的溶菌酶通過增加活力以抵御外界病原的影響。然而，詳細的情況尚待進一步研究。魚類的新陳代謝活動會產(chǎn)生自由基（ROS），它是機體正常代謝的副產(chǎn)物。通常情況下，體內(nèi)ROS的產(chǎn)生和抗氧化過程處于動態(tài)平衡中。在魚體受到外界刺激而引發(fā)應激反應時，機體內(nèi)的ROS會迅速積累。當體內(nèi)的自由基含量積累到一定程度且超過機體的清除能力時，則會產(chǎn)生氧化應激（oxidative stress），對魚體的脂類、蛋白質(zhì)和DNA造成氧化損傷［18］。自由基導致的氧化損傷不僅能造成細胞膜損傷，還可以使多種酶功能失活，從而削弱機體的免疫能力［19-21］。SOD和CAT在清除自由基方面發(fā)揮著重要作用，對機體細胞損傷后的氧化過程和吞噬作用具有很強的防御功能［22-23］。其中，SOD被認為是率先起作用的抗氧化酶之一，是超氧陰離子自由基（O2-）的天然消除劑。本研究發(fā)現(xiàn)，在驚擾脅迫處理第1天，大黃魚肝臟中SOD酶活力隨著處理時間的延長而顯著增加，表明SOD在大黃魚的應激調(diào)節(jié)和適應過程中發(fā)揮著重要的抗氧化作用；之后，隨著機體對外界刺激的逐漸適應和調(diào)節(jié)，SOD活力逐漸恢復至實驗前的水平。SOD清除過程中產(chǎn)生的H2O2能在CAT的催化下生成H2O和O2，故CAT活力的整體升高趨勢遲于SOD；與SOD活力變化規(guī)律不同，直至實驗結束CAT含量一直顯著高于對照組，表明長期的應激狀態(tài)導致大黃魚體內(nèi)自由基含量一直處于較高的水平，而這必然會導致大黃魚細胞損傷進而影響其免疫防御機能。

在日常養(yǎng)殖實踐中，人們常認為維護操作對魚體的影響較小，因而這些脅迫因素容易被忽視。本研究模擬了換水、清污和結網(wǎng)等操作過程中涉及的驚擾因素，從生理學角度分析了驚擾操作處理對大黃魚個體的影響，探討了大黃魚在應激狀態(tài)下的適應性響應規(guī)律。研究顯示，人工驚擾操作可引起大黃魚應激反應，其應激與適應的過程涉及神經(jīng)內(nèi)分泌、能量代謝、抗氧化以及免疫調(diào)節(jié)在內(nèi)的多個系統(tǒng)的協(xié)同作用。其中涉及的生理指標如皮質(zhì)醇、血糖、乳酸、SOD和CAT等均出現(xiàn)顯著性變化，體現(xiàn)了它們作為應激反應的生物指示劑的潛力［24］。在應激反應前期，大黃魚調(diào)節(jié)自身機能以應對外界環(huán)境變化，魚體將逐漸適應新環(huán)境，而體內(nèi)多個系統(tǒng)也逐漸趨于新的平衡；然而，長期處于應激狀態(tài)勢必影響其能量供給和細胞健康，最終導致生長和抗病等方面機能的降低。