小一點紅醇提物對慢性盆腔炎大鼠藥效學(xué)研究

趙丹妮，何國鑫，周 欣，龔小見，程 力，劉 璇，趙 超*

1貴州師范大學(xué) 貴州省山地環(huán)境信息系統(tǒng)與生態(tài)環(huán)境保護重點實驗室；2喀斯特山地生態(tài)環(huán)境保護與資源利用協(xié)同創(chuàng)新中心 3貴州師范大學(xué) 貴州省藥物質(zhì)量控制及評價技術(shù)工程實驗室；4貴州師范大學(xué) 天然藥物質(zhì)量控制研究中心；5貴州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，貴陽 550001

小一點紅(Emiliaprenanthoides DC.)又名細紅背葉、挖耳草等，為菊科一點紅屬植物的干燥全草[1]。在我國南方地區(qū)具有悠久的藥用歷史，其性味苦涼，具有清熱解毒，活血化瘀之功效，主治跌打損傷，紅白痢，瘡瘍腫毒及抗炎消腫等[2-4]?；t片是臨床中廣泛用于治療各種急、慢性婦科炎癥疾病的中成藥，據(jù)《廣西植物志》記載，小一點紅與其同屬植物一點紅為同等藥材入藥[4-6]，小一點紅為其的主要原料藥，但其在婦科炎癥的藥理作用研究卻鮮有報道。因此本研究以炎癥因子含量、大鼠子宮腫脹度為評價指標(biāo)，探究小一點紅對慢性盆腔炎大鼠的抗炎作用，通過對子宮病理組織顯微觀察進一步探究其藥效學(xué)作用，以期為小一點紅在抗婦科炎癥方面的深入研究提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 藥材

小一點紅藥材采自貴州省都勻市務(wù)川縣大坪鎮(zhèn)，經(jīng)貴陽中醫(yī)藥大學(xué)孫慶文教授鑒定為小一點紅(EmiliaprenanthoideaDC.)干燥全草。

1.2 動物

SD雌性大鼠56只，SPF級，體重190 ± 20 g，購自長沙市天勤生物技術(shù)有限公司[許可證號SCXK(湘)2014-0011]。

1.3 試劑

婦科千金片(株洲千金藥業(yè)股份有限公司，批號Z43020027)；苯酚膠漿(廣東光華化學(xué)廠，批號20140315)；水合氯醛(酷爾化學(xué)科技(北京)有限公司，批號G6806V17)；腫瘤壞血因子(TNF-α)、白介素-2(IL-2)、白介素-6(IL-6)購自上海喬羽生物科技有限公司；水為蒸餾水和超純水。

1.4 儀器

離心機(常州市萬和儀器制造有限公司，TDL-5A)；酶標(biāo)儀(美國Moleaular Devices公司，型號Max Plus 384)；十萬分之一電子天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司，型號XS105)；電熱恒溫水浴鍋(天津市泰斯特有限公司，型號DK-98-Ⅱ)；倒置熒光顯微鏡(廣州市明美光電技術(shù)有限公司，型號，MF53)。

2 方法

2.1 受試藥制備

取干燥小一點紅生藥粉碎，過60目篩，稱取1 kg粗粉，90%乙醇回流提取2次(2 h/次)，料液比1∶10(g∶mL)，合并提取液，濾過，濃縮得浸膏，得率為19.3%。將生藥材與浸膏進行換算，配置出高、中、低劑量(0.8、1.6、3.2 g/(kg·d))受試藥混懸液于具塞錐形瓶中，4 ℃中儲存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 造模

參照《中藥現(xiàn)代研究的思路與方法》[7]盆腔炎建立方法，取健康雌性SD大鼠，7%水合氯醛腹腔注射麻醉，下腹常規(guī)消毒，于正中切口0.8～1 cm，暴露子宮，除假手術(shù)組外，其余大鼠均由注射器針頭機械損傷右側(cè)子宮壁，并由右側(cè)子宮向卵巢方向推注25%苯酚膠漿(0.05 mL/只)，注畢，分層縫合關(guān)腹，消毒，術(shù)后正常喂養(yǎng)。

2.3 分組及給藥

造模大鼠正常飼養(yǎng)7天，除空白組和假手術(shù)組外，隨機分為5組，每組8只，即模型組、婦科千金片陽性組(0.86 g/(kg·d))、小一點紅高、中、低劑量組(0.8、1.6、3.2 g/(kg·d))?？瞻捉M、模型組和假手術(shù)組給予等體積生理鹽水10 mL/(kg·d)灌胃，連續(xù)給藥14天。

2.4 血清中TNF-α、IL-2、IL-6水平測定

末次給藥后禁食不禁水12 h，腹主動脈取血，于4 ℃ 3 500 rpm離心10 min，分離血清于密封試管中，-20 ℃儲存，ELISA法檢測大鼠血清內(nèi)TNF-α、IL-2、IL-6含量。

2.5 子宮指數(shù)測量與計算

取血后脫頸椎處死大鼠，解剖取左側(cè)及右側(cè)子宮，稱重，并按下列公式計算各組大鼠子宮的腫脹度、腫脹率和抑制率。

腫脹度=|m右側(cè)子宮-m左側(cè)子宮|

2.6 組織病理學(xué)變化觀察

將稱重后的左右側(cè)子宮浸于10%福爾馬林中固定48 h，取出后經(jīng)脫水、石蠟包埋、切片、常規(guī)HE染色、封片等步驟，于光學(xué)顯微鏡下觀察各組大鼠子宮組織病變情況，根據(jù)表3中的病變組織觀察指標(biāo)及評分標(biāo)準(zhǔn)[8]對大鼠子宮病理組織進行打分。

2.7 統(tǒng)計處理

3 結(jié)果

3.1 小一點紅醇提物對慢性盆腔炎大鼠子宮指數(shù)的影響

各組大鼠子宮腫脹度、腫脹率及抑制率見表1所示。與假手術(shù)組比較，空白組大鼠子宮腫脹程度與假手術(shù)組中大鼠體內(nèi)子宮腫脹程度并無顯著性差異(P> 0.05)，提示假手術(shù)組大鼠體內(nèi)并未因開腹造模導(dǎo)致子宮腫脹；與假手術(shù)組比較，模型組大鼠子宮腫脹度增加，腫脹率升高(P< 0.01)，提示慢性盆腔炎大鼠造模成功；與模型組大鼠比較，婦科千金片陽性組、小一點紅高、中、低劑量組大鼠子宮腫脹度、腫脹率均有所降低(P< 0.05)，各組的抑制率分別達到52.43%、49.25%、56.29%和36.79%。

表1 小一點紅乙醇提取物對慢性盆腔炎大鼠子宮腫脹度的影響Table 1 Effect of ethanol extract on uterine swelling in rats with chronic pelvic inflammatory s,n=8)

3.2 小一點紅提取物對慢性盆腔炎大鼠血清中TNF-α、IL-2、IL-6的影響

如表2所示，與假手術(shù)組比較，空白組大鼠體內(nèi)炎癥因子含量與假手術(shù)組中大鼠體內(nèi)炎癥因子含量并無顯著性差異(P> 0.05)，提示假手術(shù)組大鼠體內(nèi)并未因開腹造模導(dǎo)致感染和炎癥；模型組的TNF-α、IL-2、IL-6顯著增大(P< 0.01)，提示實驗中造模成功。與模型組比較，婦科千金片陽性組、小一點紅高劑量組(IL-2、TNF-α)、中劑量組(IL-2)、低劑量組(IL-2、TNF-α)顯著降低(P< 0.05)。

表2 小一點紅乙醇提取物對慢性盆腔炎大鼠血清中TNF-α、IL-2、IL-6含量影響Table 2 Effect of ethanol extract on serum TNF-α,IL-2,IL-6 level in rats with chronic pelvic inflammatory s,n=8)

表3 慢性盆腔炎模型大鼠子宮組織切片病變評分標(biāo)準(zhǔn)Table 3 Scoring criteria of uterine tissue slice lesions in rats with CPID

3.3 小一點紅對慢性盆腔炎子宮組織病變的影響

如圖1所示，空白組子宮組織細胞核圓潤，排列緊密，界限清晰，細胞核與細胞質(zhì)易于分化，無組織黏連(見圖A)；模型組中組織黏連，大量炎性細胞浸潤并出現(xiàn)纖維結(jié)締組織增生，細胞核破損，部分細胞核變性壞死(見圖B)；假手術(shù)組中，出現(xiàn)少量炎性細胞，但組織黏連破損，細胞排列緊密(見圖C)；與模型組比較，陽性對照組細胞分布均勻，結(jié)構(gòu)清晰完整，有少量炎性細胞浸潤，有輕微組織破損和黏連，見圖D；與模型組比較，小一點紅高、中、低給藥組，細胞核破損程度減輕，細胞核較圓滑，且分布均勻，炎癥浸潤且組織黏連程度減輕(見圖E、F、G)。

圖1 小一點紅對慢性盆腔炎大鼠子宮組織病理形態(tài)學(xué)的影響(×400)Fig.1 Effect of EP on the pathomorphology of uterine tissue in rats with chronic pelvic inflammation (×400)注：A：空白組；B：模型組；C：假手術(shù)組；D：陽性組；E：小一點紅高劑量組； F：小一點紅中劑量組；G：小一點紅低劑量組。Note:A:Blank group;B:Model group;C:Control group;D:Positive group;E:High EP dose group;F:Medium EP dose group;G:Low EP dose group.

3.4 對慢性盆腔炎子宮組織病變形態(tài)評分分析

對比慢性盆腔炎大鼠子宮病理形態(tài)的評分結(jié)果見表4，與假手術(shù)比較，空白組大鼠子宮組織病理形態(tài)無顯著性差異(P> 0.05)，提示假手術(shù)組大鼠體內(nèi)并未因開腹造模導(dǎo)致子宮病理形態(tài)變化；與模型組對比，小一點紅中劑量給藥組對宮腔黏連、上皮細胞變性或壞死、慢性炎細胞浸潤、慢性炎細胞浸潤評分數(shù)值均小于模型組(P< 0.05)，高劑量給藥組對上皮細胞變性或壞死和內(nèi)膜充血水腫評分數(shù)值均小于模型組(P< 0.05)，低劑量給藥組對上皮細胞變性或壞死、慢性炎細胞浸潤和內(nèi)膜充血水腫評分數(shù)值均小于模型組(P< 0.05)。

表4 慢性盆腔炎性模型大鼠子宮組織病理形態(tài)的評分Table 4 Scores of pathological morphology of uterine tissue in CPID model rats

4 討論

慢性盆腔炎(chronic pelvic inflammatory disease，CPID)是女性內(nèi)生殖器及周圍結(jié)締組織、腹膜的慢性非特異性炎癥，是較為常見及多發(fā)的婦科疾病[9]。治療過程中單一使用抗生素治療效果不佳，無法使患者全面治愈且具有毒副作用[10,11]，而中醫(yī)藥在慢性盆腔炎的治療中具有多途徑、多靶點的優(yōu)勢，發(fā)揮出西藥不可比擬的作用[12]。在中醫(yī)理論中歸屬于“婦人腹痛”、“帶下病”、“癥瘕”、“不孕”等病癥，其主要病因歸屬為臟腑失調(diào)、勞倦過度、氣血失和、經(jīng)絡(luò)氣血受阻，故中醫(yī)藥治療該病多以清熱解毒、活血化瘀、軟堅散結(jié)止痛為主[13]。小一點紅因其清熱解毒、活血化瘀、抗炎消腫的功效，在婦科炎癥方面具有不可忽視的開發(fā)研究價值。

TNF-α、IL-6、IL-2被認為是重要促炎細胞因子[14]，在炎癥反映初期，體內(nèi)TNF-α含量升高，激活機體的中性粒細胞/淋巴細胞，促進機體內(nèi)多種炎癥因子的釋放，包括IL-6和IL-2的釋放[15]。IL-6、IL-2是體內(nèi)重要的炎性介質(zhì)，與周身的炎癥反映有關(guān)，其在體內(nèi)的含量可較確切的反映出機體的炎癥情況[16]。本研究中以小一點紅的乙醇提取物為供試藥對慢性盆腔炎大鼠的療效進行探究，發(fā)現(xiàn)小一點紅可以有效抑制慢性盆腔炎大鼠體內(nèi)TNF-α、IL-6、IL-2炎癥因子的產(chǎn)生，降低大鼠子宮的腫脹度，改善子宮組織病理情況，表明小一點紅對慢性盆腔炎大鼠有較好的療效。本研究結(jié)果與Jiang等[4]對小一點紅的抗炎作用研究結(jié)果一致，均表明小一點紅可降低炎癥大鼠體內(nèi)的TNF-α含量，具有抑制和降低大鼠體內(nèi)炎癥的作用。同時小一點紅醇提物中含有綠原酸、槲皮苷等具有抗炎抗氧化等作用的黃酮類物質(zhì)，且含量較大[17]，進一步證實了小一點紅的抗炎作用。

在臨床中，花紅片用于治療盆腔炎性疾病后遺癥濕熱瘀結(jié)證患者療效顯著[18,19]，小一點紅作為其原料藥，本研究中證實了其在慢性盆腔炎大鼠中抗炎作用的療效，小一點紅與一點紅在外形上相差無幾，成分相仿[4,20]，且在《廣西植物志》中記載為同等藥材入藥，則提示一點紅和小一點紅可能是花紅片中治療盆腔炎疾病重要的藥效原料藥材之一。本研究為小一點紅藥材合理用藥提供理論基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)，并為花紅片在臨床中的合理利用提供參考。但小一點紅對大鼠體內(nèi)炎癥因子抑制通路尚未證實，還有待進一步深入研究。