銀杏外種皮與垂序商陸葉提取物及二者復(fù)配劑對小菜蛾殺蟲活性研究

于凌一丹，向陽春，蹇寧彬，何 欽，湯 瑤，廖 陽，閆榮玲

1湖南科技學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院；2湘南優(yōu)勢植物資源綜合利用湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；3湖南省銀杏工程技術(shù)中心，永州 425199

化學(xué)農(nóng)藥在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中發(fā)揮了重要作用，但也逐漸突顯出污染環(huán)境、危害健康、產(chǎn)生耐藥性等諸多弊端，不能很好地適應(yīng)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的需要。而生物農(nóng)藥對生態(tài)鏈破壞小，不易產(chǎn)生抗藥性和隨食物鏈富集，甚至兼具促植物生長等功效而成為人們關(guān)注的熱點(diǎn)[1,2]。

植物的根、莖、葉、花、果實(shí)、種子等不同器官次生代謝產(chǎn)生的可有效驅(qū)殺農(nóng)業(yè)有害生物的活性物質(zhì)，是植物源生物農(nóng)藥開發(fā)的重要原料[3]。人們已得到核桃楸、水菖蒲、苦皮藤等多種植物的提取物，并進(jìn)行了殺蟲活性測試，發(fā)現(xiàn)部分植物提取物表現(xiàn)出較好的殺蟲活性和生物農(nóng)藥開發(fā)潛力[4-8]。但大部分植物品種由于難以大面積種植，或種植成本高，或提取物對農(nóng)業(yè)害蟲的驅(qū)殺效果不佳等原因而限制了它們的開發(fā)利用[9,10]。因此，篩選來源豐富、成本低廉、提取簡單、活性顯著的植物提取物用于生物農(nóng)藥開發(fā)意義顯著。

銀杏(GinkgobilobaL.)和垂序商陸(PhytolaccaamericanaL.)是在我國廣泛分布的兩種植物資源。前者為銀杏科銀杏屬多年生落葉喬木，人們主要利用其葉片提取物生產(chǎn)治療心血管疾病的藥物，而覆蓋于銀杏種子硬殼外的肉質(zhì)外種皮往往作為廢棄物被舍棄；后者為商陸科商陸屬多年生草本植物，人們主要利用的是其根部，可曬干后切片作中藥使用，而生物量巨大、前處理簡單、獲取更容易的垂序商陸葉片往往也像銀杏外種皮一樣被舍棄；因此，銀杏外種皮與垂序商陸葉未得到有效利用。實(shí)質(zhì)上，在我國銀杏主產(chǎn)區(qū)，長期農(nóng)業(yè)生產(chǎn)經(jīng)驗(yàn)告訴人們可把銀杏外種皮用作土農(nóng)藥來防治農(nóng)業(yè)病蟲害；除此之外，已有研究也發(fā)現(xiàn)銀杏外種皮的乙醇或石油醚等不同溶劑提取物可對一些農(nóng)業(yè)害蟲以及釘螺等有滅殺活性[11-13]。而長期以來未被人們重視的垂序商陸，其根、葉等部位的提取物也已初步被證實(shí)對朱砂葉螨、煙草花葉病毒等農(nóng)業(yè)病蟲害具有一定的滅殺活性，但顯而易見，葉片獲取更容易，前處理更簡單[14-16]。因此，利用來源豐富、成本低廉的垂序商陸葉片及銀杏外種皮進(jìn)行生物農(nóng)藥研發(fā)潛力大、可行性強(qiáng)，但目前還鮮有針對二者提取物殺蟲活性的比較研究；另一方面，植物提取物單方制劑往往滅殺活性低、殺蟲譜窄等不足，復(fù)配是解決上述弊端的重要途徑。基于此，本研究擬對不同濃度的銀杏外種皮及垂序商陸葉提取物進(jìn)行小菜蛾滅殺活性測試，并進(jìn)行提取物的復(fù)配，摸索確定二者的最佳配比與復(fù)配濃度和互作類型，以期進(jìn)一步提高提取物的滅殺活性與滅殺譜，為后續(xù)生物農(nóng)藥的開發(fā)提供理論基礎(chǔ)與實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

銀杏外種皮與野生垂序商陸(9月葉，去柄)經(jīng)清洗、瀝干后60 ℃烘至恒重備用，處理前兩種植物材料經(jīng)化學(xué)與生物工程學(xué)院黃國文博士鑒定確認(rèn)為銀杏科銀杏屬的銀杏外種皮和商陸科商陸屬的垂序商陸葉片。小菜蛾卵購于河南濟(jì)源白云實(shí)業(yè)有限公司，孵化后挑選3齡幼蟲進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 儀器與試劑

JP-300B高速多功能粉碎機(jī)(永康市久品工貿(mào)有限公司)；BSA124S電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)；HH-W600恒溫水浴鍋(江蘇國勝實(shí)驗(yàn)儀器廠)；XH-MC-1微波合成儀(祥鵠科技有限公司)；SHZ-D循環(huán)水真空泵(鞏義市予華儀器責(zé)任有限公司)；RF52-A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；DGG-9053AD電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海森信實(shí)驗(yàn)儀器廠)及容量瓶(100 mL)、塑料培養(yǎng)皿、燒杯、燒瓶、布氏漏斗、濾紙等；95%乙醇、無水乙醇(分析純)。

1.3 方法

1.3.1 浸提

將烘至恒重的銀杏外種皮與垂序商陸葉置粉碎機(jī)打成粉末后80目過篩。分別稱取200 g銀杏外種皮與垂序商陸葉粉末，加入95%乙醇1 500 mL，400 W微波持續(xù)處理60 s，抽濾、減壓濃縮至稠膏狀后40 ℃烘至恒重。

1.3.2 提取液單方制備

分別稱取0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 g銀杏外種皮與垂序商陸葉二者的提取物，加入95%乙醇溶解并定容至100 mL，得到濃度分別為1、2、4、6、8 mg/mL銀杏外種皮與垂序商陸葉提取液，并將不同濃度提取液倒于燒杯中，標(biāo)記備用。

1.3.3 滅殺活性測試

選用去掉若干外層葉片后的新鮮卷心菜葉片，制作成直徑為1 cm的圓片，置各濃度提取液中浸泡10 s后取出揮干，放入墊有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中(每皿5片)；挑選形態(tài)大小基本一致且饑餓處理2 h后的3齡小菜蛾幼蟲進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，每皿10頭，每12 h清理一次培養(yǎng)皿并更換新鮮葉片，葉片均作提取物試液浸泡處理，以隨行試劑作為空白對照，各處理均設(shè)置5個(gè)重復(fù)，每間隔12 h即12、24、48、72、84 h(以此類推)時(shí)進(jìn)行一次死亡蟲數(shù)統(tǒng)計(jì)，直至死亡蟲數(shù)不再增加，并根據(jù)公式“校正死亡率=〔(對照組生存率-處理組生存率)/對照組生存率〕×100%”計(jì)算校正死亡率，其中生存率根據(jù)公式：生存率=〔1-(處理后小菜蛾死亡數(shù)/供試小菜蛾數(shù))〕×100%計(jì)算[17]。

1.3.4 提取液復(fù)配及最佳復(fù)配比測試

1.3.5 兩種提取物互作類型分析

以“1.3.4”所確定的最佳配比條件下復(fù)配液濃度為母液，稀釋得到此配比下的系列濃度梯度(稀釋后濃度分別為原母液濃度的2/3、1/2、1/3、1/4)，并按照“1.3.3”的方法對各濃度復(fù)配液進(jìn)行殺蟲活性測試，再通過SPSS軟件分析得到復(fù)配劑的毒力回歸方程、半致死濃度LC50，并計(jì)算得到毒力指數(shù)及共毒系數(shù)以確定兩種提取物的互作類型(拮抗、相加、增效)。其中毒力指數(shù)=100×標(biāo)準(zhǔn)殺蟲劑LC50/供測藥劑LC50，復(fù)配劑實(shí)測毒力指數(shù)=100×標(biāo)準(zhǔn)殺蟲劑LC50/復(fù)配劑LC50，復(fù)配劑理論毒力指數(shù)=成分A毒力指數(shù)×A%+成分B毒力指數(shù)×B%，共毒系數(shù)=100×復(fù)配劑實(shí)測毒力指數(shù)/復(fù)配劑理論毒力指數(shù)。計(jì)算時(shí)以垂序商陸葉提取物為標(biāo)準(zhǔn)殺蟲劑，若計(jì)算得到共毒系數(shù)>120表示增效作用，80<共毒系數(shù)≤120之間表示相加作用，共毒系數(shù)<80表示拮抗作用[18,19]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)經(jīng)Excel2007、SPSS19.0以及Sigmaplot10.0等軟件整理、分析與作圖。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 兩種提取物單方對小菜蛾的滅殺活性隨處理時(shí)間的變化規(guī)律

如圖1所示，銀杏外種皮與垂序商陸葉提取物均能對小菜蛾表現(xiàn)出較好滅殺活性。各濃度處理下，兩種提取物的小菜蛾死亡率均隨處理時(shí)間的延長逐漸增加。8 mg/mL濃度處理72 h后，小菜蛾校正死亡率分別達(dá)到74.7%(銀杏外種皮)與64.8%(垂序商陸葉)，但72 h后，各濃度下的小菜蛾死亡數(shù)不再增加，校正死亡率保持不變；除二者處理均無小菜蛾死亡的情況之外(如1、2、4、6 mg/mL處理12 h)，試驗(yàn)所設(shè)各濃度的所有時(shí)間節(jié)點(diǎn)下，銀杏外種皮提取物的小菜蛾滅殺活性均明顯優(yōu)于垂序商陸葉提取物。圖2為三個(gè)代表性處理(分別是對照組處理72 h、6 mg/mL垂序商陸葉提取物處理48 h以及8 mg/mL銀杏外種皮處理12 h)小菜蛾滅殺效果的實(shí)拍照片。

圖1 相同濃度下兩種提取物對小菜蛾的滅殺活性隨時(shí)間的變化規(guī)律Fig.1 Insecticidal activity of these two extracts against P.xylostella changing with treating time at the same concentration

圖2 提取物對小菜蛾殺蟲活性效果照片F(xiàn)ig.2 Photos of insecticidal activity of extracts against P.xylostella注：左圖示對照組處理72 h；中圖示6 mg/mL垂序商陸葉提取物處理48 h；右圖示8 mg/mL銀杏外種皮處理12 h。Note:Left photo showed the control group after 72 h;Middle photo showed the group of 6 mg/mL Pal extract after 48 h treatment;Right photo showed the group of 8 mg/mL Gbs after 12 h treatment.

2.2 兩種提取物單方對小菜蛾殺蟲活性隨濃度變化規(guī)律

如圖3所示，各時(shí)間節(jié)點(diǎn)下，兩種提取物的小菜蛾滅殺活性均隨濃度增加呈增加趨勢，且提取物處理時(shí)長越短表現(xiàn)出殺蟲活性所需的提取物濃度更高。相同處理時(shí)長時(shí)，要表現(xiàn)出滅殺活性銀杏外種皮所需濃度較垂序商陸葉低。處理12 h時(shí)，垂序商陸葉提取物所有濃度下均無滅殺活性，而銀杏外種皮8 mg/mL濃度下表現(xiàn)出了滅殺活性；處理24 h時(shí)，垂序商陸葉提取物從6 mg/mL開始具有滅殺活性，而銀杏外種皮提取物從1 mg/mL即開始表現(xiàn)出滅殺活性。

圖3 相同處理時(shí)長下兩種提取物對小菜蛾的殺蟲活性隨濃度變化規(guī)律Fig.3 Insecticidal activity changing law with concentration of these two extracts against P.xylostella under the same treating time

2.3 兩種提取物單方處理72 h條件下的毒力

不同濃度兩種提取物單方在處理72 h后的小菜蛾死亡數(shù)經(jīng)SPSS軟件處理得到了各自毒力回歸方程及半致死濃度LC50，具體如表1所示。由表可知，銀杏外種皮提取物的毒力回歸方程及LC50分別為y=1.584x-1.243和2.95 mg/mL；垂序商陸葉提取物的毒力回歸方程及LC50分別為y=1.337x-0.629和6.09 mg/mL；銀杏外種皮提取物的LC50明顯小于垂序商陸葉提取物；計(jì)算得到表中X2值表明二者毒力回歸曲線擬合度良好。

表1 單方條件下兩種提取物的毒力回歸方程及LC50Table 1 The virulence regression equation and LC50 of the two kinds of extracts

2.4 不同配比復(fù)配劑對小菜蛾的殺蟲活性及與單方的比較

兩種提取物以不同比例復(fù)配后得到的復(fù)配劑濃度及對應(yīng)的小菜蛾滅殺活性如表2所示。由表可知，小菜蛾滅殺活性隨兩種提取物的配比變化表現(xiàn)出一定的波動規(guī)律。1∶1復(fù)配時(shí)，滅殺活性僅30.22%，之后隨銀杏外種皮提取物占比的增加，滅殺活性逐步升高，當(dāng)比例為1∶11時(shí)滅殺活性達(dá)最大值86.69%；之后隨復(fù)配劑中的銀杏外種皮提取物含量進(jìn)一步增加，滅殺活性開始緩慢下降?？梢?，1∶11是二者的最佳復(fù)配比例。

表2 不同配比條件下復(fù)配液對小菜蛾的殺蟲活性比較Table 2 Insecticidal activity comparison of the extract mixture with different proportion against Plutella xylostella

由表2可知，最佳配比條件下，銀杏外種皮與垂序商陸葉提取物復(fù)配液的濃度為3.21 mg/mL。比較此濃度下復(fù)配液與最大濃度(8 mg/mL)下二者單方的小菜蛾校正死亡率可知，盡管復(fù)配液的濃度更低，但滅殺活性卻顯著高于二者單方(t-test，P<0.01，圖4)。

圖4 最佳配比復(fù)配液與高濃度單方殺蟲活性比較Fig.4 Insecticidal activities comparison between extracts mixture with optimum proportion and single extract with high concentration

2.5 兩種提取物復(fù)配條件下的互作類型

最佳配比下不同濃度復(fù)配液小菜蛾滅殺活性如表3所示。由表可知，在保持二者配比不變情況下，隨著復(fù)配劑濃度的減小，小菜蛾的滅殺活性逐漸降低。基于表3數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS軟件分析得到了復(fù)配液的LC50為1.24 mg/mL，毒力回歸方程為y=0.476x-0.639，具體見表4所示。

表3 最佳配比條件下不同濃度復(fù)配劑對小菜蛾的殺蟲活性Table 3 Insecticidal activity of extracts mixture with different concentrations against Plutella xylostella under the optimum proportion

表4 復(fù)配劑的LC50、毒力指數(shù)及共毒系數(shù)Table 4 LC50,toxicity index and co-toxicity coefficient of the mixture

比較可知，復(fù)配劑的LC50較二者單方時(shí)的LC50明顯降低。通過共毒系數(shù)分析可知，復(fù)配后的毒力指數(shù)為491.13 mg/mL，明顯高于兩種單方的毒力作用之和；復(fù)配后共毒系數(shù)為152.92，其值大于120說明兩種植物提取物復(fù)配后表現(xiàn)出顯著的增效作用。

3 討論

我國生物農(nóng)藥植物資源豐富，目前已開展研究的主要集中在楝科、豆科、菊科、衛(wèi)矛科等植物種類[1,10]，而關(guān)于銀杏科和商陸科植物在生物農(nóng)藥領(lǐng)域開發(fā)利用的研究還不多見，也不夠深入。銀杏外種皮與垂序商陸葉長期以來被人們作為廢棄物舍棄而未得到有效利用，其在農(nóng)業(yè)害蟲防治領(lǐng)域的潛在價(jià)值還未得到足夠重視和挖掘。本研究發(fā)現(xiàn)，銀杏外種皮與垂序商陸葉提取物均對小菜蛾表現(xiàn)出良好殺蟲活性，且在一定范圍內(nèi)殺蟲效果隨處理時(shí)長和提取物濃度的增加而逐漸提高，進(jìn)一步證實(shí)了二者在生物農(nóng)藥領(lǐng)域的開發(fā)潛力。

本研究發(fā)現(xiàn)，相同濃度的銀杏外種皮提取物與垂序商陸葉提取物相比，前者的小菜蛾校正死亡率高，且銀杏外種皮提取物在更短處理時(shí)間下即可表現(xiàn)出殺蟲活性均提示銀杏外種皮提取物對小菜蛾具有更好的滅殺效果；而計(jì)算得到的銀杏外種皮提取物對小菜蛾的LC50更低則進(jìn)一步證明了這一點(diǎn)。這與人們在其他植物資源研究中所得到的不同植物提取物對某一種特定農(nóng)業(yè)害蟲的滅殺活性往往存在差異的結(jié)論一致[21,22]。本研究還發(fā)現(xiàn)，不同濃度的兩種提取物在處理12或24 h后即可出現(xiàn)小菜蛾死亡，而在在處理72 h后各濃度下的小菜蛾死亡數(shù)不再增加，一方面說明提取物的藥效快，兩種植物提取物進(jìn)入小菜蛾體內(nèi)后被迅速吸收，并觸發(fā)了蟲體內(nèi)系列生理生化反應(yīng)以及相關(guān)基因的異常表達(dá)；另一方面，也說明兩種植物提取物的藥效集中在一定時(shí)間區(qū)間，從而使滅殺活性表現(xiàn)出一定時(shí)相特征[23]。

兩種或兩種以上具有特定生物學(xué)活性的物質(zhì)按一定比例混合形成可表現(xiàn)出新特性或更高效混合物的策略稱為復(fù)配。研究表明，化學(xué)農(nóng)藥施用時(shí)，合理復(fù)配可顯著減少農(nóng)藥用量、提高防治效果、減緩抗性形成[24]；人們通過對狼毒、牛心樸子、當(dāng)歸、蓖麻等多種植物提取物開展了復(fù)配及活性測試也發(fā)現(xiàn)，復(fù)配同樣可以有效增強(qiáng)植物源生物農(nóng)藥的毒力從而提高農(nóng)藥害蟲的滅殺效果[25,26]?？梢姡瑥?fù)配是農(nóng)藥施用中的一種常見易行的提效策略。對比本研究中銀杏外種皮與垂序商陸葉二者提取物的復(fù)配劑與各自單劑的小菜蛾殺蟲活性可知，復(fù)配劑在更低濃度條件下即可獲得相對單方更高的校正死亡率，且毒力指數(shù)遠(yuǎn)高于兩種單劑毒力指數(shù)之和，共毒系數(shù)值則顯著大于120。這一系列的研究結(jié)果均表明，兩種提取物的復(fù)配表現(xiàn)出顯著的增效作用。而復(fù)配劑的LC50降到明顯低于兩種單劑各自LC50的1.34 mg/mL，則意味著復(fù)配除增效作用明顯外，還可有效減少農(nóng)藥的施用量，達(dá)到節(jié)約成本和保護(hù)環(huán)境雙重目標(biāo)。需要指出的是，復(fù)配除了提高滅殺效果的有效途徑外，還往往可以擴(kuò)展生物農(nóng)藥的滅殺譜，從而提高產(chǎn)品的應(yīng)用范圍和商業(yè)價(jià)值，含有不同活性成分的垂序商陸與銀杏外種皮提取物復(fù)配后，也可能擴(kuò)展了二者單方制劑時(shí)的滅殺譜，由于本研究主要關(guān)注活性這一指標(biāo)，僅選用小菜蛾這一種農(nóng)業(yè)害蟲作為測試對象，因此不能驗(yàn)證這一推測，我們將在后續(xù)研究中對此進(jìn)行進(jìn)一步證明。另一方面，植物提取物滅殺農(nóng)業(yè)害蟲的作用機(jī)制復(fù)雜多樣，后續(xù)研究我們將系統(tǒng)分析垂序商陸與銀杏外種皮提取物復(fù)配劑如何影響小菜蛾的消化、呼吸、神經(jīng)、基因表達(dá)等來闡明其作用機(jī)制。

綜上所述，本研究證實(shí)了銀杏外種皮和垂序商陸葉二者提取物均具有小菜蛾殺蟲活性，且銀杏外種皮提取物的活性更佳的基礎(chǔ)上摸索了二者的最佳復(fù)配方案的，確定了復(fù)配劑的互作類型、最佳配比與濃度、LC50，研究結(jié)果為利用銀杏外種皮和垂序商陸葉提取物進(jìn)行新型植物源生物農(nóng)藥的協(xié)同開發(fā)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。